RKIP在不同類型肺癌中表達(dá)的變化及臨床意義

閆雪波，王炯

摘要：目的 ?觀察Raf激酶抑制蛋白（RKIP）在不同類型肺癌中表達(dá)的變化及探討其臨床價(jià)值。方法 ?選取鱗癌21例、腺癌23例及小細(xì)胞肺癌10例設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，肺良性病變10例設(shè)為對(duì)照組，采用免疫組化的方法檢測(cè)RKIP的表達(dá)，觀察在不同類型肺癌中表達(dá)的差異及與臨床分期的關(guān)系。結(jié)果 ?與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中RKIP的表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組中RKIP的表達(dá)最低的是小細(xì)胞癌，其次為鱗癌，再次腺癌。對(duì)腺癌進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與Ⅰ及Ⅱ期比較，RKIP在Ⅲ及Ⅳ期的表達(dá)更低;與Ⅰ期比較，RKIP在Ⅱ期中表達(dá)稍有減低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與Ⅲ期比較，RKIP在Ⅳ期中表達(dá)稍有減低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表達(dá)趨勢(shì)與RKIP相反，與Ⅰ和Ⅱ期比較，在Ⅲ和Ⅳ期中表達(dá)明顯升高。相關(guān)性分析顯示，RKIP與p-ERK1/2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.893，P<0.05）。結(jié)論 ?RKIP表達(dá)水平的缺失可能促進(jìn)了ERK1/2的磷酸化，從而促進(jìn)了肺癌的發(fā)生及發(fā)展，因此檢測(cè)RKIP的表達(dá)水平可能對(duì)診斷肺癌及分期預(yù)后有重要的臨床價(jià)值。

關(guān)鍵詞：RKIP;ERK1/2;肺癌;腺癌;癌癥分期

中圖分類號(hào)：R734.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.018

文章編號(hào)：1006-1959（2019）22-0055-04

Changes of RKIP Expression in Different Types of Lung Cancer and Its Clinical Significance

YAN Xue-bo，WANG Jiong

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，

Hefei 230022，Anhui，China）

Abstract：Objective ?To observe the changes of expression of Raf kinase inhibitory protein （RKIP） in different types of lung cancer and to explore its clinical value. Methods ?21 cases of squamous cell carcinoma， 23 cases of adenocarcinoma and 10 cases of small cell lung cancer were selected as experimental group. 10 cases of benign lung lesions were used as control group. The expression of RKIP was detected by immunohistochemistry and observed in different types of lung cancer. Differences and relationships with clinical staging. Results ?Compared with the control group， the expression level of RKIP in the experimental group decreased，the difference was statistically significant （P<0.05）. The lowest expression of RKIP in the experimental group was small cell carcinoma， followed by squamous cell carcinoma and re-adenocarcinoma. Further studies on adenocarcinoma found that RKIP was lower in stage III and IV than stage I and stage II. Compared with stage I， RKIP was slightly decreased in stage II， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Compared with stage III， RKIP expression was slightly decreased in stage IV， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The expression trend of phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） was opposite to that of RKIP， and the expression was significantly increased in stages III and IV compared with stage I and II. Correlation analysis showed that RKIP was negatively correlated with p-ERK1/2 expression （r=-0.893， P<0.05）. Conclusion ?The loss of RKIP expression may promote the phosphorylation of ERK1/2， which promotes the occurrence and development of lung cancer. Therefore， the detection of RKIP expression may have important clinical value in the diagnosis of lung cancer and staged prognosis.

Key words：RKIP;ERK1/2;Lung cancer;Adenocarcinoma;Cancer staging

肺癌（lung cancer）為世界范圍內(nèi)各類腫瘤死亡率之首，全球每年大約有160萬(wàn)例新增肺癌患者及140萬(wàn)例肺癌死亡患者，而且大部分發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家[1]，已經(jīng)成為我國(guó)高發(fā)病率及高死亡率的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響我國(guó)人民的健康，給社會(huì)、經(jīng)濟(jì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)[1]。肺癌分為非小細(xì)胞肺癌及小細(xì)胞肺癌，約80%的患者是非小細(xì)胞肺癌，且50%～70%的患者診斷時(shí)已經(jīng)是晚期。因此，肺癌的早期診斷、臨床分期的早期評(píng)估在診斷和治療過(guò)程中尤為重要。Raf激酶抑制蛋白（RKIP）是一種小分子保守蛋白，能夠抑制Raf/有絲分裂原激活蛋白激酶激酶（MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路，抑制Raf和MEK結(jié)合，從而抑制Raf介導(dǎo)的MEK磷酸化，對(duì)ERK信號(hào)通路起到負(fù)調(diào)控的作用[2]。RKIP在人體組織中廣泛表達(dá)，既往研究發(fā)現(xiàn)，RKIP可能對(duì)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移起抑制作用。本研究探討了在不同類型肺癌組織中RKIP及ERK1/2磷酸化的表達(dá)變化，以及這種變化與臨床分期的關(guān)系，以期能夠?yàn)榉伟┑陌l(fā)生發(fā)展以及對(duì)未來(lái)肺癌的治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1資料和方法

1.1一般資料 ?本研究所用標(biāo)本均來(lái)自2017年1月～2019年8月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（干部，西一，西二病區(qū)）住院患者，均為初次診斷，未接受治療，標(biāo)本為氣管鏡下活檢，或CT引導(dǎo)下肺穿取肺癌組織。研究對(duì)象根據(jù)病例診斷分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組為良性病變10例;實(shí)驗(yàn)組即肺癌組總計(jì)54例，包括鱗癌21例、腺癌23例及小細(xì)胞肺癌10例，所有病例均由病理學(xué)確診。

1.2方法 ?免疫組化的方法檢測(cè)RKIP和p-ERK1/2的表達(dá)：5 μm石蠟組織切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min;梯度乙醇水化，具體如下：100%乙醇2次，每次5 min;90%乙醇2次，每次5 min;80%乙醇2次，每次5 min;70%乙醇水化2次，每次5 min。PBS浸泡2次，每次5 min;蒸餾水浸泡2次，每次5 min;0.3%H2O2去離子水孵育10～30 min，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）浸泡，微波750 w抗原修復(fù)2次，每次5 min，自然冷卻。血清封閉，室溫30 min;加入一抗孵育，4℃過(guò)夜，復(fù)溫2 h。PBS沖洗5次，每次3 min;加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記標(biāo)記的二抗孵育，室溫1 h。PBS沖洗5次，每次3 min;氧化二氨基聯(lián)苯胺顯色5～10 min;自來(lái)水充分沖洗;10%蘇木精復(fù)染 ? ?2 min，鹽酸酒精分化;自來(lái)水沖洗10～15 min;梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。抗體及相關(guān)試劑為即用型，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3結(jié)果判斷 ?肺癌患者臨床特征按照年齡、性別、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期進(jìn)行分析整理;低表達(dá)和高表達(dá)的定義如下：染色強(qiáng)度（陰性：0，弱：1，中等：2，強(qiáng)：3）乘以陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比（<5%：0，6%～25%：1，26%～50%：2，50%～75%：3，>75%：4）。評(píng)分值<3被認(rèn)為是低表達(dá)，4～12被認(rèn)為是高表達(dá)。即免疫組化染色表達(dá)評(píng)分值=染色深度（陰性：0，弱：1，中等：2，強(qiáng)：3）×陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的百分比×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 ?采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，多組之間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料使用[n（%）]表示，采用？字2檢驗(yàn)。RKIP與p-ERK1/2相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肺癌患者臨床特征與RKIP的表達(dá) ?納入分析的肺癌患者臨床特征包括年齡（≥60歲、<60歲），性別（男、女），腫塊大?。ā? cm、>3 cm），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有、無(wú)），分期（Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期）。結(jié)果顯示，RKIP的表達(dá)高低，不受年齡、性別影響（P<0.05）;腫塊大小對(duì)RKIP的影響大于年齡和性別，腫塊越大，RKIP的表達(dá)值越低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)RKIP的表達(dá)有影響，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移時(shí)RKIP的表達(dá)低于淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。肺癌的分期對(duì)RKIP的表達(dá)有影響，RKIP的表達(dá)在Ⅰ～Ⅱ期高于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），即RKIP的表達(dá)在Ⅲ～Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時(shí)顯著降低，見(jiàn)表1。

2.2 RKIP在不同類型肺癌中的表達(dá)變化 ?實(shí)驗(yàn)組RKIP表達(dá)較對(duì)照組低，其中RKIP在小細(xì)胞癌基本無(wú)表達(dá)，因此，直方圖未顯示RKIP在小細(xì)胞癌中的表達(dá)。RKIP的表達(dá)在腺癌，鱗癌呈下降趨勢(shì)，但鱗癌與腺癌RKIP表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 RKIP在肺腺癌不同分期中的表達(dá)變化 ?從Ⅰ～Ⅳ期RKIP的表達(dá)逐漸減低，但RKIP在Ⅰ期和Ⅱ期中的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在Ⅲ期和Ⅳ期中的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與Ⅰ和Ⅱ期比較，RKIP在Ⅲ期和Ⅳ期中表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖2。

2.4磷酸化ERK在肺腺癌不同分期中的表達(dá)變化 ?從Ⅰ～Ⅳ期，p-ERK1/2的表達(dá)逐漸升高，但p-ERK在Ⅰ期和Ⅱ期中的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;在Ⅲ和Ⅳ中的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;與Ⅰ和Ⅱ期比較，RKIP在Ⅲ期和Ⅳ期中表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)圖3。

2.5肺腺癌中RKIP和p-ERK1/2表達(dá)的相關(guān)性分析 ?Pearson相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)一步顯示在肺腺癌中RKIP與p-ERK1/2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.893，P<0.05），即RKIP表達(dá)值越大，p-ERK1/2表達(dá)值越小，RKIP表達(dá)值約小，p-ERK1/2表達(dá)值越大，見(jiàn)圖4。

3討論

肺癌已經(jīng)成為世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致我國(guó)惡性腫瘤死亡的重要疾病原因。肺癌包括非小細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌;非小細(xì)胞型肺癌又包括鱗狀細(xì)胞癌（鱗癌）、腺癌、大細(xì)胞癌。與小細(xì)胞癌相比，非小細(xì)胞癌擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚。但多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，5年生存率很低。肺癌的預(yù)后極差，生存時(shí)間短，與腫瘤細(xì)胞侵襲性和長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。本研究中，與對(duì)照組中的強(qiáng)表達(dá)比較，肺癌組織中RKIP的表達(dá)均明顯減低，而且在小細(xì)胞癌中最為顯著。臨床分期越晚，RKIP表達(dá)水平越低。70.00%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RKIP表達(dá)水平非常低，而41.18%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者的RKIP表達(dá)水平非常低，表明肺癌的轉(zhuǎn)移與RKIP表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)肺癌組織中的RKIP的表達(dá)水平可以預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)移和分期，表達(dá)越低，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性越大，分期越晚，預(yù)后可能也越差。

RKIP在肺癌中的具體發(fā)揮作用的機(jī)制目前尚不完全明確。Raf激酶能夠激活ERK信號(hào)通路激活轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移。RKIP是ras有絲分裂原激活蛋白激酶和ERK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子[4]。既往研究已經(jīng)證實(shí)，RKIP表達(dá)水平在所有非癌性前列腺組織中均可檢測(cè)到，但是在所有轉(zhuǎn)移性前列腺癌中都明顯降低或不可檢測(cè)的水平[5]。本研究結(jié)果顯示，p-ERK1/2與RKIP的表達(dá)完全相反，臨床分期越晚，p-ERK1/2表達(dá)越高。而且進(jìn)一步的相關(guān)性分析顯示二者呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明了在肺癌中，RKIP的表達(dá)降低，ERK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)降低，促進(jìn)了ERK信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致了肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與Wang A等[5]研究結(jié)論一致。同樣，在惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌和肝臟也有類似的結(jié)果。

綜上所述，RKIP表達(dá)水平的缺失可能促進(jìn)了肺癌的發(fā)生及發(fā)展，檢測(cè)RKIP的表達(dá)水平可能對(duì)診斷肺癌及分期預(yù)后有重要的臨床價(jià)值。未來(lái)需要對(duì)RKIP的作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究，期望能對(duì)肺癌的診斷和治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2019-9-3;修回日期：2019-9-15

編輯/肖婷婷