昆蟲細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究

王家敏，馬桂蘭，馮玉萍，馬 偉，馬 祺，馬忠仁，喬自林*

（1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州百靈生物技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730010；3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirus Expression Vector System，BEVS）是以桿狀病毒為載體，在昆蟲細(xì)胞上表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。由于昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)能高水平地生產(chǎn)異源蛋白質(zhì)，而且能保證異源蛋白質(zhì)的生物活性并應(yīng)用于醫(yī)療診斷、疫苗生產(chǎn)方面。目前已上市的利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的疫苗有豬瘟疫苗、豬圓環(huán)病毒2型疫苗、宮頸癌疫苗和治療性前列腺癌疫苗等。另外，2013年美國(guó)FDA 批準(zhǔn)了Flublok用于19至49歲人群季節(jié)性流感的預(yù)防，F(xiàn)lublok也成為第一個(gè)用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的流感疫苗[1-3]。

隨著昆蟲細(xì)胞體外培養(yǎng)的需求，昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基的研發(fā)勢(shì)在必行。本研究以Gibco生產(chǎn)的Grace’s Insect Medium培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，經(jīng)改良后用于Sf-21和Hi-five細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)，該培養(yǎng)基成分明確，支持Sf-21和Hi-five細(xì)胞全懸浮生長(zhǎng)且狀態(tài)良好，可為我國(guó)昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)提供無(wú)血清培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 貼壁培養(yǎng)型Sf-21及Hi-five細(xì)胞從CCTCC引進(jìn)，引進(jìn)后由甘肅省動(dòng)物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心經(jīng)懸浮馴化后保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 Grace’s Insect Medium干粉 (Gibco)，葡萄糖（國(guó)藥集團(tuán)），水解乳蛋白（HyClone），Pluronic F-68（Gibco），酵母粉（Organotechnie），0.2%臺(tái)盼藍(lán)（Sigma）、倒置相差顯微鏡（CK40-32PH型，Olympus），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（CASY TT型，INNOVATIS），電子天平（AR2140型，上海奧豪斯），搖床（2102C型，上海智誠(chéng)），pH計(jì)（MP120-BLE型，梅特勒）等。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的制備 濃度50倍的酵母粉濃縮液配制：稱取200g酵母粉溶解到500 ml注射用水中，反復(fù)攪拌后置2～8℃冰箱，過(guò)夜后取出再加500 ml注射用水充分?jǐn)嚢韬笥脝螌悠胀V紙過(guò)濾后備用。

Grace’s Insect Medium配制：配制4.9 L溶液，其中各種溶質(zhì)的用量為5 L溶液時(shí)溶質(zhì)的用量（先不加碳酸氫鈉）。

將以上兩種培養(yǎng)基合并到一起攪拌后，加入30.75 g葡萄糖、13.5 g水解乳蛋白、200 ml濃度50倍的酵母粉濃縮液和20 g PF68，攪拌后再加12.752 g碳酸氫鈉后充分混勻，調(diào)pH值到6.16，過(guò)濾除菌在2～8℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Sf-21、Hi-five細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng) 取細(xì)胞密度達(dá)到2×106/ml以上、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf-21、Hi-five細(xì)胞，按6.0×105/ml的初始密度分別接種上述培養(yǎng)基分別接種，不添加血清，置27℃，100 rpm搖床培養(yǎng)，每24 h取樣，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，連續(xù)培養(yǎng)三代，繪制三個(gè)代次細(xì)胞平均值的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 昆蟲細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是Grace’s Insect medium培養(yǎng)基基礎(chǔ)，添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等組份，溶解性好，液體透明，呈微黃色。

2.2 Sf-21、Hi-five細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)

配制的培養(yǎng)基分別無(wú)血清培養(yǎng)Sf-21、Hifive細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)均較好，能夠很好的全懸浮生長(zhǎng)。其中，Sf-21細(xì)胞最高密度可達(dá)（39.8±2.6）×105/ml，Hi-five細(xì)胞最高密度可達(dá)（44.4±1.0）×105/ml，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見表1，生長(zhǎng)曲線見圖2，細(xì)胞形態(tài)見圖1。

圖1 昆蟲細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)狀態(tài)（A: Sf-21細(xì)胞 B: Hi-five細(xì)胞）

圖2 無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)兩種昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

表1 兩種昆蟲細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)三代計(jì)數(shù)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

目前成分穩(wěn)定且廣泛應(yīng)用的商品化基礎(chǔ)培養(yǎng)基有Grace′s、IPL-41和TC-100，使用時(shí)通常要加10%的牛血清和4g/L酵母浸出液才能正常培養(yǎng)，由于使用時(shí)添加動(dòng)物血清增加了生物安全的風(fēng)險(xiǎn)和下游純化工藝。無(wú)血清培養(yǎng)基主要有Thermo Fisher Scientific公司的Sf-900?SFM、Express Five? SFM 和 HyQ SFX-Insect，LONZA公司的Insect-XPRESS?，Sigma-Aldrich公 司 的 EX-CELL? 405、420和 TiterHigh?Medium等。這些產(chǎn)品均為國(guó)外公司生產(chǎn)，由于中國(guó)沒(méi)有相應(yīng)的產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)，外國(guó)公司給中國(guó)用戶的賣價(jià)很高，如1L包裝的液體EX-CELL?405給中國(guó)用戶的直銷價(jià)為650元，導(dǎo)致工業(yè)用戶生產(chǎn)成本太高產(chǎn)品沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[4,5]。Grace’s Insect medium是一種基礎(chǔ)培養(yǎng)使用時(shí)加血清和酵母浸出液才能維持昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)，價(jià)格約為進(jìn)口商品化無(wú)血清培養(yǎng)基的一半左右。

本研究以基礎(chǔ)培養(yǎng)基Grace’s Insect medium為基礎(chǔ)，添加了葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等組份后可較好的支持Sf-21、Hi-five兩種昆蟲細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)，為昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)提供了一種價(jià)格相對(duì)便宜無(wú)血清懸浮培養(yǎng)基，為我國(guó)利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)生物制品提供培養(yǎng)基的支持。