溫度對(duì)提取RNA質(zhì)量的影響

陳 朗，吳 佳，黃國(guó)明，姜 濤，李耀東

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

在動(dòng)物組織中進(jìn)行RNA提取是分子生物學(xué)中的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而提取RNA 的質(zhì)量將直接影響cDNA文庫(kù)的構(gòu)建、基因克隆、基因表達(dá)分析和功能基因篩選等后續(xù)結(jié)果的可靠性[1]。在提取RNA的過(guò)程中RNA的質(zhì)量受到多個(gè)因素的影響[2]，溫度是制約提取RNA質(zhì)量的重要因素[3]。本實(shí)驗(yàn)采用TRIzol法[4]在不同溫度（2℃、4℃和8℃）條件下提取雞肉RNA，探究不同提取溫度對(duì)RNA質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

雞來(lái)自市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，靜寧雞，將雞進(jìn)行解剖，將各個(gè)組織切割成一定大小后放入研缽中，再加入液氮研磨至粉狀，采集研磨好的冷凍組織到離心管，然后迅速加入1 ml Biozol Reagent, 漩渦充分震蕩30 s。保證所有的凝塊全部溶解。冰上靜置5 min，再用2℃（高速冷凍離心機(jī)）/4℃（高速冷凍離心機(jī)）/8℃（高速冷凍離心機(jī)），12 000 rpm離心10 min，除去上層油脂，吸取中間層勻漿液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。在離心管中加入1/5體積的氯仿。蓋好蓋，漩渦劇烈震蕩15 s，冰上靜置10 min。2℃（高速冷凍離心機(jī)）/4℃（高速冷凍離心機(jī)）/8℃（高速冷凍離心機(jī)），12 000 rpm 離心15 min。溶液分為酚氯仿相、中間相和上層水相。RNA溶解在水相中。轉(zhuǎn)移不超過(guò)80%的水相到一個(gè)干凈的離心管，然后加入等體積的異丙醇，漩渦充分震蕩15 s，在冰上靜置15 min。2℃（高速冷凍離心機(jī)）/4℃（高速冷凍離心機(jī)）/8℃（高速冷凍離心機(jī)），12 000 rpm 離心10 min，離心后試管底部將出現(xiàn)沉淀。RNA沉淀的清洗：沿管壁輕輕加入1 ml 75%的乙醇，用手輕輕震蕩離心管洗滌沉淀。在2℃（高速冷凍離心機(jī)）/4℃（高速冷凍離心機(jī)）/8℃（高速冷凍離心機(jī)），8 000 rpm 離心5 min，棄上清，盡量去除殘留乙醇，這樣可以減少鹽離子污染。RNA沉淀的清洗：沿管壁輕輕加入1 ml 75%的乙醇，用手輕輕震蕩離心管洗滌沉淀。7 500 rpm 離心5 min，棄上清，盡量去除殘留乙醇，減少鹽離子污染。RNA的溶解：室溫晾干或真空干燥，然后加入30～50 μl DEPC 水溶解RNA，槍頭吸打幾次，待沉淀完全溶解。將RNA成品分成幾份，放置于-80℃低溫冰箱中做長(zhǎng)期保存。

取4μl總RNA樣品與2μl上樣緩沖液（10×loading buffer）混合，以1×TAE為電泳緩沖液，在1%的瓊脂糖凝膠上和200V電壓條件下電泳30 min，結(jié)果用凝膠成像儀拍照保存。

然后對(duì)總RNA的質(zhì)量進(jìn)行鑒定：使用Shimadzu Corporation公司的UV-1800紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行260 nm和280 nm紫外光檢測(cè)，取不同溫度提取的總RNA各20μl，加入DEPC水稀釋?zhuān)靹蛑?ml，以DEPC水參比，用紫外分光光度計(jì)在吸光度為260 mm和280 mm處進(jìn)行測(cè)量，計(jì)算OD260 mm和OD280 mm處吸光度的比值，每個(gè)樣品重復(fù)三次，取其平均值，并以經(jīng)驗(yàn)公式[5]估算RNA濃度=40μg/μl×稀釋倍數(shù)×OD260 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析

RNA瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果是判定RNA質(zhì)量的重要途徑，從28S、18S、5SRNA條帶的帶型和亮度可以判斷出提取RNA的質(zhì)量。在1%的瓊脂糖凝膠上，3種溫度所提取的RNA電泳結(jié)果如圖1所示。3種不同溫度提取的RNA電泳移動(dòng)速率基本一致，2℃條件下所提取的總RNA條帶非常暗，4℃條件下提取的總RNA條帶拖帶嚴(yán)重，無(wú)法區(qū)分5S位置上的條帶，是屬于DNA條帶，還是5SRNA，亦或是兩者的混合物。8℃條件下提取的總RNA條帶清晰，無(wú)斷裂、少降解，拖尾現(xiàn)象的發(fā)生。采用3種溫度提取出的RNA中，僅有8℃條件下提取出的RNA可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖1 RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 不同溫度條件下提取RNA含量分析

使用SHIMADZU公司的UV-1800進(jìn)行260 nm和280 nm紫外光檢測(cè)，重復(fù)三次取平均值，得出RNA濃度檢測(cè)峰圖（圖2），并根據(jù)結(jié)果算出260 nm/280 nm的比值和RNA濃度（表1）。當(dāng)OD260/OD280的比值在1.8-2.0左右可推斷出總RNA未降解，表1中，在4℃條件下②樣品的OD260nm/OD280nm遠(yuǎn)大于2.0，其260nm處的吸光值較小，計(jì)算得出總RNA的濃度較低，這可能是由于RNA發(fā)生降解或存在DNA和蛋白質(zhì)的殘留。

圖2 不同溫度提取出的RNA濃度檢測(cè)峰圖

3 討論

從動(dòng)物組織中提取出高質(zhì)量的RNA是對(duì)該動(dòng)物進(jìn)行研究必不可少的步驟。RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，少量存在于細(xì)胞核中，細(xì)胞中的RNA可分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類(lèi)，不同組織總RNA提取實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過(guò)不同方式去除蛋白、DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純RNA產(chǎn)物的過(guò)程。提取RNA時(shí)，使用的Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層（無(wú)色）主要為RNA，有機(jī)層（黃色）主要為DNA和蛋白質(zhì)，再通過(guò)乙醇析出DNA，異丙醇沉淀蛋白質(zhì)，即可將RNA分離。

表1 不同溫度提取RNA的總RNA的純度及濃度

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，8℃條件下提取的RNA條帶清晰完整，且無(wú)拖帶現(xiàn)象出現(xiàn)，而4℃條件下提取的RNA有明顯拖帶現(xiàn)象，2℃條件下提取的RNA已降解。這可能是由于Trizol試劑中的苯酚被氧化后的產(chǎn)物使DNA雙鏈相交聯(lián)。溫度過(guò)低，讓組織細(xì)胞釋放的內(nèi)源核酸酶活性較低，無(wú)法將殘留的DNA降解，而8℃條件下的內(nèi)源核酸酶能較好的除去殘留DNA，從而得到高品質(zhì)的RNA。并且紫外分光光度計(jì)的結(jié)果也驗(yàn)證了這一結(jié)論。

綜上所述，在8℃條件下提取出的RNA的質(zhì)量較高。