油酸致急性呼吸窘迫綜合征大鼠肺組織KLF2蛋白表達的研究

鐘紅平，袁 強，馮孝強，王娟娟*，陳彥香

(1.延安大學附屬醫(yī)院兒科；2.延安市人民醫(yī)院兒科，陜西延安716000；3.寧夏銀川市第一人民醫(yī)院新生兒科，寧夏銀川750001)

新生兒呼吸窘迫綜合征(Neonatal respiratory distress syndrome,NRDS)是指早產(chǎn)兒出生后不久即出現(xiàn)進行性呼吸困難和呼吸衰竭等癥狀，主要由于肺泡表面活性物質(zhì)(Pulmonary Surfactant,PS)缺乏引起通氣、換氣功能障礙[1]，在臨床上又稱為肺透明膜病[2]，常表現(xiàn)為呼吸費力、次數(shù)增多，發(fā)紺等，嚴重者出現(xiàn)呼吸停止及衰竭，甚至死亡。該病生后6 h內(nèi)出現(xiàn)吸窘迫，并呈進行性加重，是新生兒生后3 d內(nèi)死亡的主要原因之一[3]。隨著外源性PS在臨床中的應(yīng)用，疾病死亡率降低了30%左右，但仍有部分患兒預(yù)后較差，表明PS缺乏并非新生兒呼吸窘迫綜合征的唯一因素[4]。近年來對NRDS的發(fā)病機制主要集中到對肺泡整體細胞功能的調(diào)控上，尤其是肺泡Ⅰ型細胞的功能調(diào)控越來越受到重視，本文主要通過研究RDS大鼠肺組織中的I型標記物KLF2蛋白的量變化，進而探討I型標記物KLF2蛋白與呼吸窘迫綜合征的關(guān)系，為難治性NRDS患兒發(fā)病機制提供可能的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠32只，體重約(193.49±9.01)g。實驗原料主要為醫(yī)用油酸，實驗儀器微量進液器、手術(shù)剪刀、止血鉗、鑷子、玻璃分針，液氮罐，水浴鍋，旋轉(zhuǎn)搖床，微波爐，通風廚。PBS(pH 7.2)∶檸檬酸鹽緩沖液，3%甲醇/H2O2溶液，中性樹膠牛血清白蛋白(BSA)等。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將32只SD大鼠隨機分為對照組、3 h、18 h、24 h組，每組8只，將大鼠固定于固定器中，酒精棉球消毒鼠尾，實驗組大鼠用微量泵通過尾靜脈注射0.17 mg/kg油酸，制成RDS動物模型。分別于注射油酸3 h、18 h、24 h后用水合氯醛通過腹腔麻醉大鼠，消毒大鼠胸部，用剪刀沿胸正中線剪開胸腔，取下肺葉，最后石蠟包埋，放入液氮罐中低溫保存。

1.2.2 Western blot檢測 取出液氮罐中低溫保存的肺組織樣品，將取好的組織加入事先溶解有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的強效組織裂解液中，勻漿機低溫勻速裂解后，置于離心機中4℃離心5 min(14000 r/min)，取出離心管并吸取上清液，使用BCA法進行組織蛋白定量。首先制備SDS-PAGE凝膠，采用上樣針吸取20 μg變性蛋白，加至凝膠孔中，60 V電壓條件下電泳30 min。將電壓調(diào)至120 V，電泳至染料跑出分離膠，進行電泳蛋白轉(zhuǎn)印及曝光，采取6 cm×8 cm的PVDF膜，甲醇浸泡至無氣泡存在，雙蒸水浸泡，置于轉(zhuǎn)印緩沖液，備用；浸濕轉(zhuǎn)印濾紙，切除濃縮膠，轉(zhuǎn)印緩沖液浸泡5 min；然后按照濾紙-分離膠-PVDF膜-濾紙的順序組裝“三明治結(jié)構(gòu)”，玻棒來回滾動，趕出氣泡，將三明治結(jié)構(gòu)置于轉(zhuǎn)印槽中，加入適量轉(zhuǎn)印緩沖液，將轉(zhuǎn)印槽置于冰浴中，50 V電壓轉(zhuǎn)印120 min，小心取出轉(zhuǎn)印后的PVDF膜,置于含5%BSA的PBST溶液中，緩慢搖動，室溫封閉1 h；加入一抗，其中KLF2抗體按照1∶1000稀釋，β-ACTIN按照1∶5000稀釋，4℃冰箱孵育過夜，并緩慢搖動，取出PVDF膜，1×TBST溶液洗滌三次，10min/次，加入山羊抗兔二抗(中杉金橋ZB23011∶5000稀釋)溶液，室溫孵育60 min，用1×TBST溶液洗滌三次，10 min/次，再滴加1 mL ECL發(fā)光液，室溫孵育5 min，置于化學發(fā)光儀曝光，采集圖片，使用Image Pro軟件分析印跡條帶光密度值。

1.2.3 組化免疫檢測 將實驗組與對照組石蠟標本進行切面，將切片置于二甲苯中脫蠟，水化酒精溶液處理；取適量枸櫞酸鈉緩沖液加入到高壓鍋中，將微波功率調(diào)制最大，放入脫蠟水化的組織切片，將切片置于染色缸中，3%H2O2甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶15 min；洗滌后用5%BSA的PBS溶液封閉1 h，滴加二抗(約50 μL)，室溫密閉孵育1 h，用自然成熟的蘇木精染液染核2 min，鹽酸酒精溶液分化20 s，經(jīng)梯度乙醇對切片脫水，最后滴加20 μL中性樹膠，24×32 mm蓋玻片封片；室溫自然干燥，后行鏡檢。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 油酸致呼吸窘迫綜合征大鼠結(jié)果

32只大鼠用微量泵通過尾靜脈注射0.17 mg/kg油酸后，大約5～10 min出現(xiàn)輕度呼吸窘迫綜合征樣癥狀，如呼吸急促，易驚等表現(xiàn)，并伴有粉紅色泡沫樣肺水腫液由鼻腔溢出，快速取出肺組織見肺實體顏色暗紅，不光滑，有散在瘀點，成功制成RDS大鼠。

2.2 RDS大鼠與正常大鼠肺組織KLF2表達量的比較

Western blot結(jié)果顯示油酸18 h組、24 h組肺組織中的I型標記物KLF2蛋白的量與對照組大鼠數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而油酸3 h組與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具體數(shù)值見表1所示。免疫組化結(jié)果顯示，KLF2蛋白在各組不同時間段肺組織量的表達，相比對照組圖，18 h組和24 h組顯示KLF2蛋白減少，而3 h組KLF2蛋白減少不明顯(見圖1)。

表1 大鼠KLF2蛋白表達對比

注：*與對照組P<0.05

3 討論

當前兒科界醫(yī)生普遍認為NRDS的發(fā)病是由于肺泡Ⅱ型細胞中的PS分泌不足引起，近年來研究者們對肺泡Ⅰ型細胞的功能有新的認識，他們認為肺泡I型上皮細胞的功能在NRDS的發(fā)病機制中也起著重要的作用[5]。研究證明[5]I型肺泡細胞負責進行氣體交換，Ⅱ型肺泡細胞在肺部功能是分泌PS，降低肺表面張力。Pei等[6]在研究呼吸窘迫小鼠的動物實驗中，發(fā)現(xiàn)它們的肺組織有早熟的I型肺泡，給這類小鼠加抗甲狀腺素類藥物能減少RDS的發(fā)生，認為甲狀腺激素受體在小鼠肺發(fā)育很重要，繼續(xù)研究認為甲狀腺激素與甲狀腺激素受體結(jié)合，最終能激活小鼠肺組織中的KLF2蛋白，它能促成I型肺泡細胞的成熟，無KLF2蛋白的小鼠會馬上死亡，死亡的小鼠解剖發(fā)現(xiàn)有肺不張，免疫圖片有稀少I型肺泡的扁平細胞，Ⅱ型樣立方細胞正常，免疫組化顯示小鼠肺組織中I型標記物蛋白明顯減少，而SP-B，SP-C和PECAM-1染色判定Ⅱ型肺細胞和血管內(nèi)皮細胞無影響，因此小鼠體內(nèi)甲狀腺素缺乏會影響KLF2蛋白生成，最終會影響I型肺泡細胞的發(fā)育和成熟，這說明I型肺泡細胞及其KLF2蛋白與呼吸窘迫綜合征有關(guān)聯(lián)。

在本實驗中，主要研究大鼠肺組織中的I型標記物蛋白的變化關(guān)系，選擇油酸18 h組、24 h組中大鼠，提取它們肺組織中的I型標記物KLF2蛋白的量與健康大鼠KLF2蛋白的量進行比較，P<0.05，有統(tǒng)計學意義；在本實驗中，18 h、24 h RDS大鼠肺組織相比正常組I型標記物KLF2蛋白的量是減少的。本人在前期大鼠動物研究中發(fā)現(xiàn)，由油酸誘導的呼吸窘迫綜合征大鼠的血清甲狀腺素與健康大鼠的血清甲狀腺素相比較是下降的，是符合統(tǒng)計學意義的[7]，再結(jié)合Pei等[6]小鼠的動物實驗研究結(jié)果，說明小鼠的血清甲狀腺素和I型肺泡細胞及其KLF2蛋白與其呼吸窘迫綜合征是有一定的關(guān)聯(lián)的。

在臨床上導致NRDS發(fā)病多數(shù)與Ⅱ型肺泡細胞分泌的PS有關(guān)，但有些患兒用其治療無效果，可能與I型肺泡細胞及甲狀腺素受體缺乏有關(guān)，有的可能與基因缺乏等有關(guān)。本研究實驗數(shù)據(jù)量較少，這需要在今后臨床工作中繼續(xù)積累病例，在動物實驗中增加實驗數(shù)據(jù)，需研究呼吸窘迫大鼠第二天乃至第三天KLF2蛋白的量，來明確大鼠血清甲狀腺素與KLF2及呼吸窘迫的相關(guān)性，為明確NRDS患兒甲狀腺素替代治療提供理論依據(jù)。