UV、O3及UV/O3削減耐藥菌和抗性基因性能

李樹銘,王 錦*,王海潮,李今朝,黃 雪,王曉月

UV、O3及UV/O3削減耐藥菌和抗性基因性能

李樹銘1,王 錦1*,王海潮1,李今朝2,黃 雪1,王曉月1

(1.北京交通大學(xué)土建學(xué)院,水中典型污染物控制與水質(zhì)保障北京市重點實驗室,北京 100044；2.中國神華海外開發(fā)投資有限公司,北京 100011)

從某污水處理廠二級出水分離出糞腸球菌、短芽孢桿菌、假單胞桿菌和大腸桿菌4種耐藥菌,通過菌落計數(shù)法、qPCR評價UV、O3及UV/O3對耐藥菌和抗性基因的削減效果.研究表明,3種方式對耐藥菌均有較好的削減效果,其中革蘭氏陽性菌滅活效果比陰性菌差;對抗性基因的削減受消毒方式和抗性基因的種類影響較大,結(jié)果表明短芽孢桿菌在耐藥菌和抗性基因削減過程中表現(xiàn)出較強的抗逆性.結(jié)合復(fù)活實驗和掃描電鏡發(fā)現(xiàn),UV消毒72h后耐藥菌的光復(fù)活率為6.93%~11.58%;O3因破壞了細胞結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)光復(fù)活現(xiàn)象,這一過程中胞內(nèi)抗性基因可能釋放到環(huán)境中;UV/O3對耐藥菌造成的損傷同樣具有不可逆性.

耐藥菌；抗性基因；消毒；光復(fù)活；掃描電鏡

自1942年青霉素被發(fā)明以來,已有數(shù)百種抗生素被合成.抗生素被廣泛應(yīng)用于人類疾病控制、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè),為人類生產(chǎn)和生活提供了有效保障.然而,抗生素的過度使用和濫用產(chǎn)生了耐藥菌(Antibiotic resistance bacteria, ARB)和抗性基因(Antibiotic resistance genes, ARGs)問題,嚴(yán)重降低了它們對人類和動物病原體的治療潛力.ARGs是一種新型、持久性的環(huán)境污染物[1-3],攜帶ARGs的質(zhì)粒、整合子等可以在同種或不同種細菌之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移(Horizontal gene transfer, HGT),即使細菌死亡后,攜帶ARGs的DNA也會在環(huán)境中長期存在[4]. 2015年,世界衛(wèi)生組織將抗生素耐藥性描述為一場全球性的公共衛(wèi)生危機,必須以最大的緊迫性加以管理[5].

污水處理廠是人類生產(chǎn)、生活產(chǎn)生污水的交匯點,同時也是ARB和ARGs的儲存庫[6-7].在水處理中,消毒可以滅活病原微生物,降低水傳播疾病的風(fēng)險[8],許多研究發(fā)現(xiàn),消毒在去除ARGs方面發(fā)揮著重要作用,并且可以作為限制ARB和ARGs傳播的屏障[9-10].Sullivan等[11]考察了傳統(tǒng)消毒方法對四環(huán)素耐藥菌的處理情況,發(fā)現(xiàn)其在削減四環(huán)素耐藥菌方面是有效的,但在削減W基因片段方面效果較差.Pak等[12]采用臭氧對大腸桿菌和pB10質(zhì)粒進行處理,發(fā)現(xiàn)達到4lg削減時,pB10所需的投加量是大腸桿菌的1.04~1.25倍.曾萍等[13]研究了芬頓氧化技術(shù)對四環(huán)素抗性基因廢水的處理效果,發(fā)現(xiàn)芬頓氧化后廢水中的微生物種群數(shù)量和四環(huán)素抗性基因的絕對含量均有降低.當(dāng)前的大多數(shù)研究側(cè)重于消毒劑濃度和接觸時間的設(shè)定,以滿足污水和飲用水處理的微生物標(biāo)準(zhǔn)[14].然而,消毒可以誘導(dǎo)一些微生物進入一種存活但不能培養(yǎng)的狀態(tài),它們?nèi)匀槐Ａ袅舜x活動和生理毒性[15-16].因此,當(dāng)前的大多數(shù)研究可能低估了微生物對消毒劑的耐受性和水中病原菌的危險性.再者,對ARB的研究主要集中于大腸桿菌,對ARGs的研究主要集中于四環(huán)素和磺胺類,對其它類型ARB和ARGs的研究并不多見.此外,當(dāng)前的研究側(cè)重于單一消毒方式,對聯(lián)合消毒方式的考察尚有提升空間.

本研究從山東省某污水處理廠二級出水中分離出糞腸球菌()、短芽孢桿菌()、假單胞桿菌()和大腸桿菌()4株ARB,挑選出A、TEM、I和B 4種ARGs,通過紫外(UV)、臭氧(O3)及紫外臭氧聯(lián)合消毒(UV/O3)探究消毒對ARB和ARGs的削減效果,同時,通過復(fù)活實驗和消毒前后的掃描電鏡探究消毒效果的持久性和消毒過程中ARB和ARGs的削減機制,研究結(jié)果可為污水中ARB和ARGs的控制提供理論支持和技術(shù)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 菌株的篩選與鑒定

采集山東省某污水處理廠二級出水,稀釋、涂布于無抗性固體培養(yǎng)基平板上,37℃下培養(yǎng)24h后,挑取單一菌落進行分離純化.采用Chelex-100法提取細菌DNA[17-19],測定16S rRNA基因序列,測序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進行序列同源性檢索比對,確定單一菌株菌種.選擇污水處理廠中常見的革蘭氏陽性菌和陰性菌各2株,通過藥敏實驗確定菌株的耐藥類型,采用PCR法對4株細菌分別進行ARGs及16S rRNA、1基因進行定性檢測,并分析其抗性基因類型.

PCR體系為20.0μL:其中2×Taq PCR StarMix 10.0μL(GenStar, China),上下游引物各0.5μL, DNA模板1.0μL, ddH2O 8.0μL.各引物見表1.在PCR擴增儀(Coyote, Theater4*4, China)中進行擴增,PCR擴增條件為:95℃預(yù)變性5min后,95℃變性30s,退火30s,72℃延伸30s,共32個循環(huán),最后72℃下延伸10min.PCR完成后,取6μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物,使用經(jīng)過EB染色的1%的瓊脂糖凝膠,在120V電壓下電泳30min檢測擴增條帶.使用全自動凝膠成像儀(NEWBIO Industry, USA)對瓊脂糖凝膠進行拍照,分析所得PCR產(chǎn)物長度并與表1中的擴增片段相比較.

表1 各基因引物序列及退火溫度

本研究選用的菌株為:①糞腸球菌,革蘭氏陽性,具有四環(huán)素、磺胺甲噁唑、阿莫西林等抗性,16S rRNA序列NCBI登入號為MH773163;②短芽孢桿菌,革蘭氏陽性,具有磺胺甲噁唑、阿莫西林、亞胺培南等抗性,16S rRNA序列NCBI登入號為MH773164;③假單胞桿菌,革蘭氏陰性,具有磺胺甲噁唑和亞胺培南抗性,16S rRNA序列NCBI登入號為MH773162;④大腸桿菌,革蘭氏陰性,具有磺胺甲噁唑、慶大霉素、氯霉素等抗性,16S rRNA序列NCBI登入號為MH773165.各菌株對應(yīng)的ARGs類型為:糞腸球菌(A),短芽孢桿菌(TEM),假單胞桿菌(I),大腸桿菌(B).

1.2 實驗水樣準(zhǔn)備

將實驗所需菌株在37℃下培養(yǎng)24h后取菌液50mL, 5000r/min離心10min,棄上清液收集菌體,并用無菌PBS重懸,將重懸后的溶液以1:20的比例投加至水樣中,最終實驗水樣細菌濃度約為107~ 108CFU/mL(模擬污水處理廠細菌濃度).

1.3 消毒實驗裝置

消毒實驗裝置如圖1所示.

圖1 反應(yīng)裝置示意

1.氧氣瓶;2.臭氧發(fā)生器;3.氣體流量計;4.臭氧分析儀;5.反應(yīng)器;6.曝氣頭;7磁力攪拌器;8.紫外燈;9.轉(zhuǎn)子;10.尾氣處理

臭氧發(fā)生器產(chǎn)生的臭氧通過反應(yīng)器底部的曝氣頭與待處理水樣混合.反應(yīng)器為中心輻射的圓柱形結(jié)構(gòu),內(nèi)徑6cm,高41cm,中心為直徑2.5cm的石英套管.選用紫外燈作為光源,放置于石英套管內(nèi),反應(yīng)器底部設(shè)取樣口.

1.4 消毒實驗

UV消毒時,關(guān)閉氣源和臭氧發(fā)生器,打開紫外輻射燈.從燈管發(fā)出的紫外線均勻輻照到反應(yīng)器.實驗水樣體積為1L,控制紫外燈強度不變(1032.8μW/cm2),通過調(diào)節(jié)輻照時間(ARB實驗取樣間隔10s, ARGs實驗取樣間隔5min)以獲得不同的紫外劑量.為避免復(fù)活效應(yīng),紫外消毒處理后立即進行下一步樣品處理與檢測.

O3消毒時,關(guān)閉紫外燈,打開氣源和臭氧發(fā)生器.臭氧發(fā)生器產(chǎn)生的臭氧經(jīng)硅膠管輸送至反應(yīng)器底部的曝氣頭,氣路上裝有氣體流量計和臭氧分析儀,反應(yīng)器底部設(shè)轉(zhuǎn)子以使曝氣更加均勻.實驗水樣體積為1L,控制臭氧濃度(ARB和ARGs實驗分別為0.86, 2.2mg/L)不變,通過調(diào)節(jié)反應(yīng)時間(取樣間隔5min),以獲得不同的臭氧投加量.在取樣管中提前加入體積為取樣量2%的0.1mol/L的Na2S2O3溶液,在取樣的同時立即終止臭氧以及其它殘余氧化物質(zhì)的反應(yīng).

UV/O3聯(lián)合消毒時,控制紫外燈強度和臭氧濃度與單獨消毒實驗相一致.

1.5 復(fù)活實驗

將制備好的水樣放置于磁力攪拌器上,分別用UV(1032.8μW/cm2)、O3(2.2mg/L)及相同強度和濃度UV/O3消毒處理30min后,取樣10mL并轉(zhuǎn)移到25W日光燈下進行復(fù)活實驗,每隔24h檢測水樣中耐藥菌數(shù)目.

1.6 菌落計數(shù)法

用無菌PBS對水樣進行梯度稀釋,各取100μL水樣稀釋液于固體培養(yǎng)基平板上,用玻璃涂布棒涂布均勻,平行3份,37℃下培養(yǎng)24h后進行菌落計數(shù)(CFU/mL).

1.7 熒光定量PCR

通過熒光定量PCR對抗性基因的絕對豐度進行檢測.水樣采用Chelex-100法提取DNA,利用微量蛋白質(zhì)核酸分析儀(Nanodrop, USA)測定DNA濃度,并置于-80℃保存.

熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:普通PCR擴增得到的目的基因序列通過使用DNA凝膠回收試劑盒(Biomed, China)純化回收PCR產(chǎn)物,測量DNA含量和純度,調(diào)節(jié)至合適濃度后,連接pMD18-T質(zhì)粒載體,轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞DH5,再將感受態(tài)細胞涂布在含有氨芐青霉素、X-gal、和IPTG的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12~16h;通過藍白斑篩選挑選白色重整菌株,挑選陽性克隆子用LB培養(yǎng)液在37℃下培養(yǎng)45min后,取1mL菌液測序檢測插入基因片段.測序結(jié)果使用BLAST進行序列同源性檢索比對;將剩余菌液使用質(zhì)粒小量提取試劑盒(Biomed, China)進行質(zhì)粒提取,并確保質(zhì)粒DNA的260/280比值在1.8左右.符合要求的質(zhì)粒,作為標(biāo)準(zhǔn)品計算其濃度,質(zhì)粒濃度計算公式為:濃度=(質(zhì)量?相對分子質(zhì)量)′6.02′1023.將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進行10倍稀釋,并保持質(zhì)粒濃度在102~108之間.

熒光定量PCR反應(yīng)在Mini8Plus實時熒光定量PCR儀(Coyote, China)中進行.熒光定量PCR反應(yīng)體系為:SYBR-Green Master PCR Mix 10.0μL (TransGen Biotech, China),上下游引物各0.5μL, DNA模板1.0μL,ddH2O 8.0μL.熒光定量PCR反應(yīng)程序為:95℃預(yù)變性10min;然后進入40個循環(huán)擴增階段,其中:95℃變性15s, 60℃延伸60s,延伸的同時掃描熒光信號.溶解曲線程序為60~95℃之間,每0.5℃讀數(shù),其間停留30s.平行3份.

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2013、Origin 9.0和SPSS Version 22軟件進行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 UV、O3及UV/O3對ARB的削減

如圖2所示,3種方式在反應(yīng)初期均具有較快的滅活速率,隨著反應(yīng)的進行,滅活速率逐漸降低,但隨反應(yīng)時間延長、消毒劑量增加,ARB削減率提高.

由圖2(a)所示,UV對ARB的滅活效果存在明顯差異.紫外強度1032.8μW/cm2,反應(yīng)時間60s(紫外劑量62mJ/cm2)時,糞腸球菌、短芽孢桿菌、假單胞桿菌、大腸桿菌分別有4.34、3.76、5.01和5.13lg的滅活.革蘭氏陽性菌(糞腸球菌,短芽孢桿菌)的滅活率低于革蘭氏陰性菌(假單胞桿菌,大腸桿菌),這與Mckinney等[10]的實驗結(jié)果一致,其原因可能與革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌具有不同大小的總基因組有關(guān).紫外輻射可以使DNA中相鄰的嘧啶分子形成嘧啶二聚體,從而阻止DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成,進而細胞死亡.革蘭氏陰性菌的基因組更大,可能形成更多的嘧啶二聚體,因而革蘭氏陰性菌更容易被UV滅活.

0為反應(yīng)開始時ARB的濃度(CFU/mL),為反應(yīng)后ARB的濃度(CFU/mL)

由圖2(b)可知,臭氧濃度0.86mg/L,反應(yīng)時間25min(投加量21.5mg/L)時,O3對4種ARB分別有5.35、5.04、5.99和5.68lg的滅活.其中革蘭氏陽性菌的耐受性優(yōu)于陰性菌,其原因可能與革蘭氏陽性菌細胞壁的保護作用有關(guān),通常,革蘭陽性菌細胞壁肽聚糖層數(shù)較多,細胞壁較厚、韌性較強,可以在一定程度上阻礙O3分子的穿透[24],因而革蘭氏陽性菌對O3的耐受能力較強.

由圖2(c)可知,紫外強度1032.8μW/cm2,臭氧濃度0.86mg/L,反應(yīng)時間60s(紫外劑量62mJ/cm2,臭氧投加量21.5mg/L)時,UV/O3對4種ARB分別有4.87、4.48、5.73和5.61lg的滅活,革蘭氏陰性菌與陽性菌耐受性的差異與UV消毒和O3消毒時的現(xiàn)象一致.當(dāng)進行UV/O3消毒時,僅10s就比UV消毒提升了0.23~0.96lg;O3消毒達到4lg削減需要11~15min,而UV/O3僅需22~30s.這表明UV/O3具有一定的協(xié)同作用.

此外,3種消毒方式中短芽孢桿菌的處理效果均最差,深入研究后發(fā)現(xiàn)這與芽孢桿菌獨特的結(jié)構(gòu)有關(guān).芽孢桿菌的DNA、RNA位于芽孢內(nèi),大量的嘧啶二羥酸鈣布滿整個芽孢,由于芽孢具有厚而含水量低的多層結(jié)構(gòu),所以折光性強,對輻射、化學(xué)消毒劑和其他理化因素有較強的抵抗力[25].在水質(zhì)檢測中,最常用的是動物和人類糞便污染指標(biāo)[26],如大腸桿菌和腸球菌.然而,其他未列入水質(zhì)常規(guī)監(jiān)測計劃的生物可能在污水處理過程中存活下來.

2.2 UV、O3及UV/O3對ARGs和intI1的削減

如圖3所示,3種方式對ARGs均有一定的削減效果,在處理過程中,不同ARGs總體上隨著處理時間的延長而下降,但削減效果受消毒方式和ARGs的種類影響較大.

如圖3(a)所示,紫外強度1032.8μW/cm2,反應(yīng)時間5min(紫外劑量310mJ/cm2)時,UV對糞腸球菌水樣中的A、短芽孢桿菌水樣中的TEM、假單胞桿菌水樣中的I和大腸桿菌水樣中的B有0.10~0.96lg的削減;當(dāng)反應(yīng)時間延長到30min(紫外劑量1859mJ/cm2)時,削減達到0.42~4.57lg,處理效果受ARGs種類影響較大.其中,短芽孢桿菌水樣中的TEM基因在處理時間30min時僅下降0.42lg,在UV削減ARB實驗中(圖2a),UV對短芽孢桿菌的滅活效果同樣最差.芽孢桿菌獨特的結(jié)構(gòu)同樣是抑制ARGs削減的主要原因,這表明UV對ARGs的削減可能還與細菌細胞結(jié)構(gòu)有關(guān).

如圖3(b)所示,臭氧濃度2.2mg/L,反應(yīng)時間5min(投加量11mg/L)時,O3對ARGs有0.07~0.43lg的削減;反應(yīng)時間為30min(投加量66mg/L)時僅提高到0.32~0.79lg,在O3消毒過程中,ARGs隨反應(yīng)時間的延長削減效果提升不大,這與鄭吉等[24]的結(jié)果相似.Sousa等[26]發(fā)現(xiàn),O3在進入細菌內(nèi)部與DNA中的嘌呤和嘧啶反應(yīng)之前存在與細胞壁和細胞成分的多種氧化反應(yīng),O3不具有選擇性的特點可能是造成削減ARGs效果較差的主要原因.在水處理中,O3消毒因其殺菌徹底,無殘留,殺菌廣譜的特點備受青睞,但其在削減ARGs方面不容樂觀.

圖3(a)與圖3(b)對比可知,UV削減ARGs的效果較O3更為明顯.與O3消毒相比,UV對ARGs的削減更為直接、更具針對性[27],因而效果更佳.

由圖3(c)可知,紫外強度1032.8μW/cm2,臭氧濃度2.2mg/L,反應(yīng)時間5min(紫外劑量310mJ/cm2,臭氧投加量11mg/L)時,UV/O3對ARGs有0.22~0.99lg的削減;當(dāng)反應(yīng)時間達到30min(紫外劑量1859mJ/cm2,臭氧投加量66mg/L)時提高到0.58~ 4.67lg,UV/O3在削減ARGs方面也表現(xiàn)出一定的協(xié)同效果,且紫外輻射起主要作用,而O3的加入進一步提升了ARGs的削減率.在UV/O3反應(yīng)體系中,O3在紫外的輻射下,可發(fā)生如下反應(yīng)分解產(chǎn)生?OH[28]:

自由基的存在促進了細胞壁和細胞成分的分解,同時也促進了對DNA的損傷.

表2 3種消毒方式下ARGs和16S rRNA基因相關(guān)性分析

ARGs與16S rRNA基因之間的相關(guān)分析(表2)可能展現(xiàn)出ARGs削減過程中的潛在機理.3種方式處理過程中,ARGs與16S rRNA基因均呈現(xiàn)正相關(guān)(<0.05),16S rRNA基因豐度在一定程度上可以反映水樣中微生物的數(shù)量[29],這說明3種方式對ARGs的削減均與微生物數(shù)量的降低有關(guān).UV/O3處理過程中,ARGs與16S rRNA基因的相關(guān)系數(shù)2>0.8,這表明在ARB滅活的同時,ARGs也得到了有效的削減.而UV和O3消毒過程中,ARB被滅活后,ARGs的行為特征有待進一步的研究.

如圖4所示,當(dāng)反應(yīng)時間為30min(紫外劑量1859mJ/cm2,臭氧投加量66mg/L)時,UV、O3及UV/O3對1可達到4.47、3.92、5.59lg的削減,UV/O3展現(xiàn)出較強的協(xié)同作用.整合子是一種重要的耐藥基因捕獲及傳播元件,其中?、П、Ш類整合子已經(jīng)證實與細菌的耐藥性相關(guān)[23,30],3種方式對intI1均有一定程度的削減,這表明UV、O3及UV/O3對ARGs的水平轉(zhuǎn)移有一定的抑制效果.

圖4 3種消毒方式對intI1削減效果比較

2.3 UV、O3及UV/O3對ARB光復(fù)活的影響

表3 3種消毒方式對ARB復(fù)活效果比較

注:“-”表示未檢驗.

本實驗采用磷酸緩沖溶液制備水樣,由于磷酸緩沖溶液中不含碳源和氮源,因此可以認(rèn)為日光燈照射過程中ARB數(shù)目的增長是由于光復(fù)活引起的.由表3可知,UV消毒30min(紫外劑量1859mJ/cm2)后,隨著日光燈照射時間的延長,4種ARB的復(fù)活率逐漸增加,當(dāng)日光燈照射時間為72h時,4種ARB的復(fù)活率為6.93%~11.58%,復(fù)活效果明顯.

UV消毒后4種ARB均存在光復(fù)活現(xiàn)象.其原因是DNA光解酶可以特異性的結(jié)合到含有嘧啶二聚體的DNA上,在光照下產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移,裂解嘧啶二聚體,恢復(fù)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)[31-32],使得UV消毒過程中處于亞致死或活的但不可培養(yǎng)狀態(tài)細菌復(fù)蘇[33].O3(投加量66mg/L)和UV/O3(紫外劑量1859mJ/cm2,臭氧投加量66mg/L)消毒后未出現(xiàn)光復(fù)活.研究表明,O3及產(chǎn)生的自由基最先與細菌的細胞壁發(fā)生反應(yīng),造成細胞壁的穿孔或破裂,因而O3及UV/O3消毒不具有可逆性.

2.4 UV、O3消毒過程中細胞膜通透性的變化

掃描電鏡用來觀測ARB經(jīng)過UV和O3處理后細菌表面的可見損傷.未經(jīng)處理的ARB具有完整的細胞形態(tài)且細胞表面光滑、平整(圖5a、5d、5g、5j);UV處理10min(紫外劑量620mJ/cm2)后,絕大多數(shù)ARB不再具備可培養(yǎng)性,但細菌的表面結(jié)構(gòu)幾乎沒有受到損傷,部分細菌表面變得略微粗糙和褶皺(圖5b、5e、5h、5k),大多數(shù)細菌表面結(jié)構(gòu)保持完整[34].已有的研究表明,在UV消毒過程中,不可逆的表面損傷需要相當(dāng)高的紫外劑量才能顯現(xiàn)[35].O3處理10min(臭氧投加量22mg/L)后,可以清晰的觀測到細菌表面出現(xiàn)了孔洞和褶皺,部分細菌破裂(圖5c、5f、5i、5l).細胞壁在維持細菌固有形態(tài)、與外界環(huán)境進行物質(zhì)交換的過程中發(fā)揮著重要作用.細菌表面結(jié)構(gòu)的不可逆損傷可能是臭氧氧化過程中微生物失活的主要原因,這種損傷削弱或者喪失細菌對外界不利因素抵御能力,且影響其存活能力.

圖5 UV和O3消毒前后ARB掃描電鏡

a,b,c:糞腸球菌;d,e,f:短芽孢桿菌;g,h,i:假單胞桿菌;j,k,l:大腸桿菌,其中a,d,g,j為未處理組,b,e,h,k為UV處理組,c,f,i,l為O3處理組

值得注意的是,O3與細胞膜上的脂蛋白和脂多糖發(fā)生氧化反應(yīng),導(dǎo)致細胞溶解死亡[12].在這一過程中,攜帶ARGs的游離DNA可能會釋放到環(huán)境中,對環(huán)境造成潛在的威脅.相對于O3消毒,UV消毒可直接對DNA造成損傷,因而對ARGs的削減更有效,但UV消毒后普遍存在光復(fù)活現(xiàn)象,ARB的復(fù)活意味著經(jīng)紫外線照射形成的嘧啶二聚體已經(jīng)被裂解或清除,DNA重新恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu),這說明UV對ARGs的削減可能同樣具有可逆性.UV/O3消毒過程中,紫外線對DNA造成直接損傷的同時細菌的表面結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞,不具備可復(fù)活性,這表明UV/O3消毒具有優(yōu)越性,但其消毒過程中ARGs的行為特征有待深入研究.

3 結(jié)論

3.1 3種消毒方式對污水處理廠二級出水中的ARB均有較好的滅活效果,革蘭氏陽性菌具有細胞壁較厚、基因組較小的特點,其滅活效果比陰性菌差.

3.2 UV及UV/O3對ARGs的削減有一定的效果, O3不具選擇性的特點是其對ARGs的削減效果較差的主要原因.此外,3種方式對ARGs的削減均與細菌數(shù)量的減少有關(guān).由于短芽孢桿菌具有獨特的結(jié)構(gòu),在ARB和ARGs削減過程中表現(xiàn)出較強的抗逆性,這反映出現(xiàn)有的水質(zhì)常規(guī)監(jiān)測可能存在缺陷.

3.3 UV消毒可使DNA中相連的嘧啶分子之間形成嘧啶二聚體,從而直接造成ARGs的削減;O3消毒過程中首先對細菌的表面結(jié)構(gòu)造成損傷,ARGs可能被釋放到環(huán)境中,造成潛在威脅;UV/O3消毒過程中,紫外線對DNA造成損傷的同時細菌的表面結(jié)構(gòu)已經(jīng)被破壞.

[1] Pruden A, Pei R, Storteboom H, et al. Antibiotic resistance genes as emerging contaminants: Studies in northern Colorado [J]. Environmental Science & Technology, 2006,40(23):7445-7450.

[2] 羅 義,周啟星.抗生素抗性基因(ARGs)——一種新型環(huán)境污染物[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2008,28(8):1499-1505. Luo Y, Zhou Q X. Antibiotic resistance genes (ARGs) as emerging pollutants [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2008,28(8):1499-1505.

[3] 羅 曉,袁立霞,張文麗,等.制藥廢水廠抗性基因和微生物群落相關(guān)性研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2019,39(2):831-838. Luo X, Yuan L X, Zhang W L, et al. Correlation study between resistance genes and microbial communities in pharmaceutical wastewater treatment plants [J]. China Environmental Science, 2019, 39(2):831-838.

[4] 張 寧,李 淼,劉 翔.土壤中抗生素抗性基因的分布及遷移轉(zhuǎn)化[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(7):2609-2617. Zhang N, Li M, Liu X. Distribution and transformation of antibiotic resistance genes in soil [J]. China Environmental Science, 2018,38(7): 2609-2617.

[5] World Health Organization, Antimicrobial Resistance, (2015) Fact Sheet n 194. 2014.

[6] Mao D, Yu S, Rysz M, et al. Prevalence and proliferation of antibiotic resistance genes in two municipal wastewater treatment plants [J]. Water Research. 2015,85:458-466.

[7] 馬 奔,黃雅夢,王若楠,等.城市污水廠MCR-1基因及其攜帶菌的污染[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2018,38(4):1433-1440. Ma B, Huang Y M, Wang R N, et al.The pollution of MCR-1and MCR-1hosting bacteria in municipal wastewater treatment plants [J]. China Environmental Science, 2018,38(4):1433-1440.

[8] Yoon Y, Chung H J, Wen Di D Y, et al. Inactivation efficiency of plasmid-encoded antibiotic resistance genes during water treatment with chlorine, UV, and UV/H2O2[J]. Water Research, 2017,123:783- 793.

[9] Huang J, Hu H, Tang F, et al. Inactivation and reactivation of antibiotic-resistant bacteria by chlorination in secondary effluents of a municipal wastewater treatment plant [J]. Water Research, 2011,45(9): 2775-2781.

[10] Mckinney C W, Pruden A. Ultraviolet disinfection of antibiotic resistant bacteria and their antibiotic resistance genes in water and wastewater [J]. Environmental Science & Technology, 2012,46(24): 13393-13400.

[11] Sullivan B A, Vance C C, Gentry T J, et al. Effects of chlorination and ultraviolet light on environmental tetracycline-resistant bacteria and tet(W) in water [J]. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2017,5(1):777-784.

[12] Pak G, Salcedo D E, Lee H, et al. Comparison of antibiotic resistance removal efficiencies using ozone disinfection under different pH and suspended solids and humic substance concentrations [J]. Environmental Science & Technology, 2016,50(14):7590-7600.

[13] 曾 萍,劉詩月,張俊珂,等.芬頓法深度處理生物處理排水中的四環(huán)素抗性基因[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2017,37(9):3315-3323. Zeng P, Liu S Y, Zhang J K, et al. Advanced Fenton oxidation treatment of tetracycline resistance genes in effluent discharged from biological wastewater treatment [J]. China Environmental Science, 2017,37(9):3315-3323.

[14] Fang J, Liu H, Shang C, et al. E.coli and bacteriophage MS2 disinfection by UV, ozone and the combined UV and ozone processes [J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering. 2014,8(4): 547-552.

[15] Alleron L, Khemiri A, Koubar M, et al. VBNC Legionella pneumophila cells are still able to produce virulence proteins [J]. Water Research, 2013,47(17):6606-6617.

[16] Lin Y, Li D, Gu A Z, et al. Bacterial regrowth in water reclamation and distribution systems revealed by viable bacterial detection assays [J]. Chemosphere, 2016,144:2165-2174.

[17] 錢雪琴,張 軍,沈 芳.Chelex-100法和堿性裂解法提取細菌DNA的比較[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2008,18(8):1565-1566. Qian X Q, Zhang J, Shen F. Comparison of methods for extraction of DNA by chelex-100 and alkali split [J]. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2008,18(8):1565-1566.

[18] 胡曉紅,彭惠民,劉 昕,等. PCR及Real-time PCR評價細菌DNA提取方法[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2008,33(2):155-158. Hu X H, Peng H M, Liu X, et al. Methods of DNA extraction from bacteria for PCR and Real-time PCR [J]. Journal of Chongqing Medical University. 2008,33(2):155-158.

[19] Singh U A, Kumari M, Iyengar S. Method for improving the quality of genomic DNA obtained from minute quantities of tissue and blood samples using Chelex 100resin [J]. Biological Procedures Online, 2018,20(12):1-8.

[20] Zhang X, Zhang T. Occurrence, abundance, and diversity of tetracycline resistance genes in 15sewage treatment plants across China and other global locations [J]. Environmental Science & Technology, 2011,45(7):2598-2604.

[21] Luo Y, Mao D, Rysz M, et al. Trends in antibiotic resistance genes occurrence in the Haihe River, China [J]. Environmental Science & Technology, 2010,44(19):7220-7225.

[22] Zhu Y, Johnson T A, Su J, et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2013,110(9):3435-3440.

[23] Goldstein C, Lee M D, Sanchez S, et al. Incidence of class 1and 2integrases in clinical and commensal bacteria from livestock, companion animals, and exotics [J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001,45(3):723-726.

[24] 鄭 吉,周振超,陳 芳,等.3種常規(guī)消毒方法對磺胺類抗性基因削減效果的比較[J]. 環(huán)境科學(xué), 2017,38(4):1497-1505. Zheng J, Zhou Z C, Chen F, et al. Reducing effect of three disinfection technologies for sulfonamides resistance genes [J]. Environmental Science, 2017,38(4):1497-1505.

[25] Nicholson W L. Photoreactivation in the genus Bacillus [J]. Curr Microbiol. 1995,31(6):361-364.

[26] Sousa J M, Macedo G, Pedrosa M, et al. Ozonation and UV254nmradiation for the removal of microorganisms and antibiotic resistance genes from urban wastewater [J]. Journal of Hazardous Materials, 2017,323:434-441.

[27] Lee O, Kim H Y, Park W, et al. A comparative study of disinfection efficiency and regrowth control of microorganism in secondary wastewater effluent using UV, ozone, and ionizing irradiation process [J]. Journal of Hazardous Materials, 2015,295:201-208.

[28] Bustos-Terrones Y, Rangel-Peraza J G, Sanhouse A, et al. Degradation of organic matter from wastewater using advanced primary treatment by O3and O3/UV in a pilot plant [J]. Physics and Chemistry of the Earth, Parts A/B/C. 2016,91:61-67.

[29] Zheng J, Su C, Zhou J, et al. Effects and mechanisms of ultraviolet, chlorination, and ozone disinfection on antibiotic resistance genes in secondary effluents of municipal wastewater treatment plants [J]. Chemical Engineering Journal, 2017,317:309-316.

[30] Hall R M, Collis C M, Kim M J, et al. Mobile gene cassettes and integrons in evolution [J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 1999,870:68-80.

[31] Li G, Wang W, Huo Z, et al. Comparison of UV-LED and low pressure UV for water disinfection: Photoreactivation and dark repair of Escherichia coli [J]. Water Research, 2017,126:134-143.

[32] Guo M, Hu H, Bolton J R, et al. Comparison of low- and medium-pressure ultraviolet lamps: Photoreactivation of Escherichia coli and total coliforms in secondary effluents of municipal wastewater treatment plants [J]. Water Research, 2009,43(3):815-821.

[33] Xu L, Zhang C, Xu P, et al. Mechanisms of ultraviolet disinfection and chlorination of Escherichia coli: Culturability, membrane permeability, metabolism, and genetic damage [J]. Journal of Environmental Sciences, 2018,65:356-366.

[34] Cho M, Kim J, Kim J Y, et al. Mechanisms of Escherichia coli inactivation by several disinfectants [J]. Water Research, 2010,44(11): 3410-3418.

[35] 張崇淼,莊 凱,巨 欣,等.紫外線消毒對3種大腸桿菌的滅活效果和耐藥性影響[J]. 環(huán)境工程學(xué)報, 2015,9(9):4097-4101. Zhang C M, Zhuang K, Ju X, et al. Inactivation and antibiotic resistance variation of three Escherichia coli under ultraviolet disinfection [J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2015, 9(9):4097-4101.

致謝：本實驗的現(xiàn)場采樣工作由山東省濟南市環(huán)境研究院相關(guān)人員協(xié)助完成,在此表示感謝.

Reduction of ARB and ARGs by ultraviolet, ozone and combined disinfection technology.

LI Shu-ming1, WANG Jin1*, WANG Hai-chao1, LI Jin-zhao2, HUANG Xue1, WANG Xiao-yue1

(1.Beijing Key Laboratory of Aqueous Typical Pollutants Control and Water Quality Safeguard, School of Civil Engineering, Beijing Jiaotong University, Beijing 100044, China；2.China Shenhua Overseas Development & Investment Co. Limited, Beijing 100011, China)., 2019,39(12)：5145~5153

Four kinds of resistant bacterium,,, andwere isolated from the secondary effluent of a sewage treatment plant. The reduction effect of three disinfection methods of UV, O3and UV/O3on ARB and ARGs was evaluated by colony counting method and qPCR. The study showed that the three methods had obvious inactivation of ARB, and the effect on inactivation of Gram-positive bacteria was worse than that of Gram-negative bacteria. The reduction of ARGs varied by the means of disinfection and the types of ARGs, and the result indicated thatshowed stronger resistance during the reduction process of ARB and ARGs. In addition, combined with photoreactivation experiments and scanning electron microscopy, it was found that the photoreactivation rate of ARB after UV disinfection for 72h was between 6.93% and 11.60%. There was no photoreactivation phenomenon by O3due to the destruction of cell structure, which might lead intracellular ARGs to be released into the environment. Meanwhile, the ARB damage caused by UV/O3was also irreversible.

antibiotic resistance bacteria (ARB)；antibiotic resistance genes (ARGs)；disinfection；photoreactivation；scanning electron microscopy

X703

A

1000-6923(2019)12-5145-09

李樹銘(1994-),男,河北邢臺人,北京交通大學(xué)碩士研究生,主要從事水質(zhì)與水污染控制理論與技術(shù)方面的研究.

2019-05-10

國家重點實驗室開放基金課題(KF2017-17)

* 責(zé)任作者, 教授, jwang1@bjtu.edu.cn