新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對阿爾茨海默病模型小鼠的神經(jīng)保護作用*

谷青芳， 尉杰忠， 郭敏芳， 魏文悅， 肖保國， 張光先， 馬存根△

(1山西大同大學(xué)神經(jīng)炎癥及變性疾病基礎(chǔ)與應(yīng)用研究山西省重點實驗室， 山西 大同 037009； 2山西醫(yī)科大學(xué)， 山西 太原 030000； 3復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所， 上海 200025； 4托馬斯·杰弗遜大學(xué)神經(jīng)學(xué)系， 美國 賓夕法尼亞州 費城 19107)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種主要發(fā)生在老年人的神經(jīng)退行性疾病，隨著我國老齡化社會的到來，AD 患者數(shù)量迅速上升，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。AD 的形成有多種病因，但其確切的發(fā)病機制尚不清楚[1]。β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)和tau蛋白構(gòu)成了AD患者大腦中老年斑的主要神經(jīng)毒性成分，這2種蛋白質(zhì)的斑塊和纏結(jié)破壞了大腦的神經(jīng)元，損害了病人的記憶從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶障礙[2]。迄今為止，大多數(shù)旨在改變單一病理因素(例如膽堿能功能障礙或Aβ異常沉積)的治療措施都失敗了，因為它們只針對有限的AD致病因素[1-2]。

Rho激酶是近十年來發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞諸多活動的主要激酶之一。Rho相關(guān)激酶(Rho-associated kinase，ROCK)的異常激活也已在AD實驗?zāi)Ｐ湍X中被發(fā)現(xiàn)，并且可能參與AD疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。值得注意的是激活Rho激酶信號通路，可導(dǎo)致生長錐的萎縮和軸突生長抑制，而ROCK抑制劑可以明顯促進脊髓損傷后小鼠軸突再生和功能恢復(fù)[3]，ROCK抑制劑Y-27632對各種原因?qū)е碌纳窠?jīng)損傷均具有抑制作用，可增加神經(jīng)元的存活和神經(jīng)突起的延長[4-6]，因此ROCK通路可能是促進中樞神經(jīng)保護的主要信號通路。因此，近年來尋找能夠拮抗突觸再生抑制分子或阻斷其與受體結(jié)合通路的ROCK抑制劑成為研究熱點。新近的ROCK抑制劑系列研究已證明ROCK抑制劑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用[3-6]，Rho激酶抑制劑將為促進AD神經(jīng)保護和功能恢復(fù)提供新的思路和作用靶點。

多年來人們一直在尋找高效低毒的新型Rho激酶抑制劑。我們前期篩選了一系列合成的新型Rho激酶抑制劑衍生物，選擇FSD-C10與fasudil進行了一系列的對比實驗。在發(fā)現(xiàn)FSD-C10具有與fasudil諸多相似的生物學(xué)特征基礎(chǔ)上，證實FSD-C10具有細(xì)胞毒性低和對血管影響小等優(yōu)勢[7]。本研究試圖在此基礎(chǔ)上研究FSD-C10治療AD動物模型的效果，并進一步探討其在神經(jīng)變性病變中的免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)保護機制。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

清潔級雄性8月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因(transgenic，Tg)小鼠20只(體重18～22 g)，同窩同性別8月齡野生型C57BL/6小鼠10只(體重18～20 g)。實驗動物置于室溫和光照可控的無菌動物房清潔飼養(yǎng)[(25±2)℃，12 h 明暗交替，相對濕度40%]。該實驗按照國際實驗動物科學(xué)理事會的指導(dǎo)方針進行，并得到了山西大同大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號：1601)。

APP/PS1Tg小鼠購自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司，可表達(dá)人的APPswe基因與早老素PS1-dE9基因，能產(chǎn)生高水平的Aβ1-42纖維沉積，在8月齡時可出現(xiàn)Aβ老年斑，是國際通用的AD模型鼠之一。APP/PS1Tg實驗小鼠隨機分為模型(NS)組與FSD-C10治療組，分別持續(xù)腹腔注射給予生理鹽水(0.9% NaCl，n=10)和FSD-C10(25 mg·kg-1·d-1，n=10) 2個月，野生(WT)組取10只正常老齡小鼠同法給予等量生理鹽水。

2 主要試劑和儀器

FSD-C10化合物購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；兔抗小鼠Aβ1-42抗體(Millipore)；兔抗小鼠磷酸化tau蛋白(phosphorylated tau, p-tau)、第668位蘇氨酸磷酸化的淀粉樣前體蛋白[phosphorylated amyloid precursor protein at Thr668, p-APP (Thr668)]、β位點APP剪切酶1 (beta-site APP-cleaving enzyme 1, BACE1)、突觸后致密區(qū)蛋白95(postynaptic density protein 95, PSD-95)抗體購自Cell Signaling Technology；抗突觸小泡蛋白(synaptophysin)和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor, AMPAR)抗體購自Abcam。

水迷宮軟件SMART 3.0及硬件購自深圳瑞沃德生命科技有限公司；冰凍切片機購自Leica；酶標(biāo)儀購買于THERMO；凝膠成像分析儀購自Bio-Rad。

3 方法

3.1莫里斯水迷宮(Morris water maze，MWM)實驗 MWM是一個高50 cm，直徑90 cm的圓形水池，水池裝滿用食用白色素調(diào)和形成的不透明的水，水溫維持在21～23 ℃。 MWM通過 SMART 3.0軟件分為4 個象限：西北(northwest，NW)、東北(northeast，NE)、西南(southwest，SW)和東南(southeast，SE)象限。在SW象限放一個逃生平臺(5.0 cm×5.0 cm)，低于水面2.0 cm。每次實驗中，訓(xùn)練小鼠從起點到達(dá)平臺的時間和距離，時長每次60 s，如果在60 s期間小鼠沒有到達(dá)平臺，則引導(dǎo)幫助小鼠到達(dá)平臺，訓(xùn)練完成后，對認(rèn)知功能進行5 d的認(rèn)知功能測定，然后將平臺移除進行空間探索，以確定小鼠對平臺空間位置的記憶能力。實驗過程中，小鼠游動的蹤跡被SMART 3.0系統(tǒng)攝像頭跟蹤記錄并分析處理各項指標(biāo)，包括動物從入水到平臺的時間、動物第1次到達(dá)平臺所在象限時間、動物達(dá)到平臺的平均距離、動物在平臺所在象限待的時間占總時間的比例、動物在平臺所在象限游的路徑距離占總路徑距離的比例、動物在平臺所在象限活動度占總活動度的比例，通過比較時間和距離判斷小鼠對平臺空間位置的記憶能力。

3.2標(biāo)本采集 水迷宮實驗結(jié)束后，腹腔注射100 g/L 的水合氯醛(每只0.2 mL)麻醉小鼠。每組取5只小鼠用4%多聚甲醛灌流進行體內(nèi)組織固定，然后分離腦組織，OTC包埋后切10 μm冠狀冰凍切片，-80 ℃保存，進行組織免疫熒光染色。各組剩余5只小鼠冰上快速取腦組織，用組織裂解液在4 ℃條件下裂解組織蛋白，并用BCA法測定蛋白含量，制備蛋白上樣緩沖液樣品，進行Western blot法檢測。

3.3免疫熒光染色 將上述制備的冰凍切片用 PBS 洗3 次，每次5 min；1% BSA室溫封閉1 h；I 抗(包括抗Aβ1-42、p-tau、 synaptophysin、 AMPAR-1 和AMPAR-2抗體， 稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；次日用PBS洗 3 次，每次5 min；加AlexaFlour 555或AlexaFlour 488熒光標(biāo)記的 II 抗(1∶1 000，Thermo Scientific)室溫孵育2 h， 50% 甘油封片，熒光顯微鏡觀察蛋白的表達(dá)和分布。

3.4Western blot法檢測蛋白水平 將上述制備的蛋白上樣緩沖液樣品，用10%(質(zhì)量濃度)SDS-PAGE分離蛋白，電泳完畢后，將分離好的蛋白凝膠用濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到PVDF膜(穩(wěn)流200 mA，2 h)。5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉封閉2 h，用 5%脫脂牛奶稀釋 I 抗[包括抗p-APP (Thr668)、BACE1、synaptophysin、 PSD-95、AMPAR-1 和AMPAR-2抗體，稀釋比例為1∶1 000]分別加至膜上，4 ℃過夜。次日洗滌后孵育HPR耦聯(lián)的 II 抗(稀釋比例1∶1 000)室溫45 min。洗膜后使用 Bio-Rad 凝膠成像分析儀檢測染色條帶強度，以檢測蛋白條帶吸光度與內(nèi)參照GAPDH或β-actin的吸光度比值表示。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行處理。所有實驗均重復(fù)至少3次，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示，兩組比較采用t檢驗，3組組間比較采用單因素方差分析及Dunnett’s post-hoc檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FSD-C10促進APP/PS1 Tg小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善

觀察新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對APP/PS1Tg小鼠的治療潛力，我們首先以藥物干預(yù)起始時小鼠的行為和病理變化作為基線來進行比較。首先采取水迷宮實驗檢測小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，由游泳運動軌跡可見野生組小鼠搜索策略多為直線式和趨向式，小鼠的運動軌跡主要集中在目標(biāo)平臺象限的位置，而AD模型組小鼠搜索策略多為邊緣式和隨機式，小鼠的運動軌跡多沿著池壁及遠(yuǎn)離目標(biāo)平臺象限的位置運動，搜索效率明顯低于野生組，見圖1A。與野生組相比，AD模型組搜索平臺逃避潛伏期時間明顯增加(P<0.05)，小鼠在平臺所在象限滯留時間占總時間的比例和小鼠在平臺所在象限游的路徑距離占總路徑距離的比例明顯減少(P<0.01)。而三組小鼠的游泳速度相當(dāng)，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，這表明小鼠在水下平臺定位所需的不同時間與運動能力無關(guān)，提示AD模型組小鼠認(rèn)知功能較野生組小鼠下降，AD 模型制備成功。

經(jīng)過2 個月FSD-C10治療后，F(xiàn)SD-C10治療組APP/PS1Tg小鼠的認(rèn)知功能較AD模型組明顯改善，小鼠搜索潛伏期明顯縮短(P<0.05)，小鼠在平臺所在象限滯留時間占總時間的比例和小鼠在平臺所在象限游的路徑距離占總路徑距離的比例明顯增加(P<0.05), 見圖1B，提示FSD-C10可有效促進APP/PS1Tg小鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善。

Figure 1.The cognitive ability of the mice in each group was analyzed by Morris water maze (MWM) test. A: the typical diagram of the 3 groups; B: the corresponding parameters of MWM test. Mean±SD. n=10. *P<0.05, **P<0.01 vs NS group.

2 FSD-C10治療減少APP/PS1 Tg小鼠腦內(nèi)Aβ沉積

免疫熒光組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，F(xiàn)SD-C10組和AD模型組小鼠的大腦皮層及海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區(qū)均有Aβ老年斑陽性表達(dá)。AD模型組小鼠腦內(nèi)Aβ老年斑呈散在分布，數(shù)量多，體積大；經(jīng)FSD-C10治療后小鼠腦內(nèi)的上述蛋白數(shù)量減少，體積減少，而野生組小鼠大腦海馬DG區(qū)和皮層區(qū)經(jīng)免疫組織化學(xué)染色，未見明顯Aβ蛋白陽性反應(yīng)，見圖2。

Figure 2.FSD-C10 attenuated Aβ1-42 and p-tau levels in hippocampal DG area and cerebral cortex of the mice in the 3 groups detected by immunohistochemistry.

3 FSD-C10治療調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)APP蛋白的代謝

Western blot 結(jié)果顯示，AD模型組和FSD-C10組小鼠腦內(nèi)的p-APP (Thr668)蛋白水平均高于野生組小鼠；與AD模型組相比，F(xiàn)SD-C10組小鼠腦內(nèi)的p-APP (Thr668)蛋白水平明顯高于AD組小鼠(P<0.05)，見圖3A。這表明FSD-C10促進APP蛋白向非淀粉樣途徑代謝，導(dǎo)致腦內(nèi)寡聚體Aβ的減少。另外，F(xiàn)SD-C10治療后小鼠腦內(nèi)BACE1 蛋白水平降低：FSD-C10組小鼠腦內(nèi)的BACE1蛋白水平明顯低于AD組小鼠(P<0.01)，但尚未達(dá)到野生組水平，見圖3B。

Figure 3.The protein levels of p-APP (Thr668)(A) and BACE1 (B) in the brain tissues of the mice in the 3 groups determined by Western blot. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs NS group.

4 FSD-C10增加APP/PS1 Tg小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)

免疫熒光組織化學(xué)染色檢測APP/PS1Tg小鼠海馬DG區(qū)、海馬CA3區(qū)及皮層區(qū)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與AD模型組相比，F(xiàn)SD-C10治療組小鼠這些區(qū)域出現(xiàn)synaptophysin、AMPAR-1和AMPAR-2蛋白的陽性反應(yīng)細(xì)胞表達(dá)，染色較深，海馬DG區(qū)、海馬CA3區(qū)及皮層區(qū)陽性細(xì)胞體積大，呈圓形或橢圓形，見圖4A、B。

Figure 4.FSD-C10 induced the expression of synapse-associated proteins. A: FSD-C10 induced the expression of synaptophysin in hippocampal DG area, hippocampal CA3 area and cerebral cortex of the mice in the 2 groups detected by immunohistoche-mistry; B: FSD-C10 induces the expression of AMPAR-1 and AMPAR-2 in hippocampal DG area, hippocampal CA3 area and cerebral cortex of the mice in the 2 groups detected by immunohistochemistry; C: the protein levels of synaptophysin, AMPAR-1, AMPAR-2 and PSD-95 in the brain tissues of the mice in the 2 groups determined by Western blot. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs NS group.

Western blot 檢測APP/PS1Tg小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，F(xiàn)SD-C10治療組小鼠腦內(nèi)synaptophsin、AMPAR-1、AMPAR-2和PSD-95的蛋白表達(dá)條帶均比對照AD模型組小鼠明顯變粗、顏色變深，表明其蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)，見圖4C。

因此，我們通過免疫組化和Western blot兩種實驗方法均證明FSD-C10治療可上調(diào)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)。

討 論

AD的病理學(xué)特征之一是出現(xiàn)老年斑Aβ。Aβ 是淀粉樣前體蛋白APP被一系列蛋白水解酶裂解的產(chǎn)物，是AD的核心致病物質(zhì)。 正常情況下APP 的代謝途徑是α-分泌酶途徑，裂解APP產(chǎn)生可溶性的sAPPα片段，可促進神經(jīng)軸突生長，突觸形成；病理情況下APP的代謝途徑是β-分泌酶途徑，裂解APP產(chǎn)生Aβ1-40和Aβ1-42，它們難溶于水，可聚集形成老年斑。Aβ具有很強的自聚性，只要形成聚集體，就能表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)毒性，造成突觸損傷，線粒體功能障礙，神經(jīng)元變性死亡，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生[8]。在本實驗研究中，我們應(yīng)用新型Rho激酶抑制劑FSD-C10對AD的APP/PS1Tg小鼠模型進行持續(xù) 2 個月的治療，結(jié)果顯示FSD-C10可有效改善空間認(rèn)知功能，小鼠腦內(nèi)的Aβ數(shù)量減少，體積變小，提示該治療在行為學(xué)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理學(xué)的良好效果。 而FSD-C10治療后APP/PS1Tg小鼠腦內(nèi)p-APP (Thr668)蛋白表達(dá)增多，同時FSD-C10治療后β-分泌酶BACE1蛋白表達(dá)減少，促進了APP蛋白向非淀粉樣途徑代謝轉(zhuǎn)化，減少小鼠腦內(nèi)的Aβ老年斑的沉積。這些結(jié)果可能是改善小鼠認(rèn)知功能的直接原因，但FSD-C10如何促進APP蛋白向非淀粉樣途徑代謝轉(zhuǎn)化其具體的網(wǎng)絡(luò)機制仍需進一步深入的探討。

在AD的APP/PS1Tg小鼠模型中，Aβ的病理性升高可誘導(dǎo)突觸損失[9]。雖然確切的分子機制尚未完全了解，但是寡聚體Aβ與突觸可塑性喪失和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能障礙有關(guān)[10-11]。通常認(rèn)為Aβ可結(jié)合突觸相關(guān)蛋白使其失活，因此作為AD中突觸可塑性喪失的病理機制[10-11]。 突觸是神經(jīng)元之間信息傳遞的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)，任何突觸都可能表現(xiàn)出不斷變化的傳遞效能，這就是突觸可塑性[12]。synaptophysin是囊泡形成和胞吐作用所需的突觸前囊泡的主要整合膜蛋白[13]，用來檢測突觸的密度和分布，而AD患者腦海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)synaptophysin蛋白含量比正常人明顯減少，提示AD患者的海馬神經(jīng)元突觸密度下降[14-15]。Bertoni-Freddari等[16]研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)和海馬突觸聯(lián)系缺失的嚴(yán)重程度與AD的癡呆程度呈正相關(guān)。谷氨酸受體在人體海馬區(qū)中發(fā)揮了重要的作用，它屬于神經(jīng)遞質(zhì)受體，參與突觸傳遞，神經(jīng)元生長和分化，突觸可塑性以及學(xué)習(xí)和記憶[17]。當(dāng)神經(jīng)元去極化時，谷氨酸被釋放到突觸間隙中，與谷氨酸受體結(jié)合[18]，參與快速興奮性突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)[19]?，F(xiàn)在的研究已經(jīng)公認(rèn)長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)現(xiàn)象是學(xué)習(xí)記憶活動的細(xì)胞水平的生物學(xué)基礎(chǔ)[20]。在突觸后膜，AMPAR能誘發(fā)和維持LTP,促進學(xué)習(xí)記憶行為。相反 AMPAR 從突觸后膜移除是 LTD的重要環(huán)節(jié)。Yasuda等[21]的研究證實，AD 病人海馬區(qū)域 GluR1和GluR2/3 水平分別下降 43% 和 38%，提示突觸后膜 AMPAR 數(shù)目和功能的改變可能與 AD 認(rèn)知障礙的發(fā)生有關(guān)。PSD-95是一種調(diào)節(jié)突觸分布的重要支架蛋白，PSD-95組織突觸蛋白以介導(dǎo)興奮性突觸的功能和結(jié)構(gòu)可塑性并維持突觸體內(nèi)平衡[22]。PSD-95被認(rèn)為在突觸成熟過程中發(fā)揮作用，因為它特別容易受到Aβ的毒性作用[23], 因此PSD-95下調(diào)可能是由Aβ引起的病理級聯(lián)事件中的重要中間步驟。FSD-C10治療后突觸可塑性相關(guān)蛋白，如synaptophysin、AMPAR和PSD-95蛋白的表達(dá)增加。FSD-C10可能通過上調(diào)這些突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)來維持突觸的正常功能。

綜上所述，本研究顯示新型Rho激酶抑制劑FSD-C10治療后雙轉(zhuǎn)基因AD 模型小鼠認(rèn)知功能障礙及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理改變顯著改善，其神經(jīng)保護作用機制可能與促進APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP蛋白向非淀粉樣途徑代謝，減少腦內(nèi)Aβ寡聚體的生成，降低Aβ老年斑的沉積，減少tau蛋白的數(shù)量有關(guān)。此外，通過上調(diào)突觸相關(guān)蛋白synaptophy-sin、AMPAR及PSD-95的表達(dá)，增強突觸可塑性，可能是FSD-C10改善APP/PS1Tg小鼠認(rèn)知功能的重要機制。