曲格列汀誘導(dǎo)高糖條件下腎系膜細(xì)胞表達(dá)HO-1*

伍先明， 李愛瓊， 周麗麗， 彭小珊， 李 堅(jiān)

(郴州市第一人民醫(yī)院 1老年病科, 2兒童醫(yī)院，湖南 郴州 423000； 3重慶青年職業(yè)技術(shù)學(xué)院，重慶 400712； 4湘南學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 郴州 423000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥之一，其機(jī)制非常復(fù)雜，高血糖誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是重要的發(fā)病因素[1]。正常情況下機(jī)體內(nèi)存在多重抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)拮抗病理生理?xiàng)l件下的氧化應(yīng)激損傷，其中以核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)-血紅素氧合酶 1(heme oxygenase-1，HO-1)系統(tǒng)最重要。HO-1是哺乳動(dòng)物體內(nèi)參與血紅素代謝的一種多種功能氧化酶。研究表明，HO-1不但能降解血紅素為一氧化碳，膽綠素和Fe2+發(fā)揮抗氧化活性，也參與了腎髓質(zhì)微循環(huán)。在高糖所致氧化應(yīng)激中，機(jī)體可代償性誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)從而抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[2]。對(duì)于糖尿病患者而言，即便血糖控制得到改善，ROS介導(dǎo)的血管應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)存在依然可引起持續(xù)性的血管損傷[3-4]，因此采用藥物誘導(dǎo)抗氧化應(yīng)激基因如HO-1的表達(dá)，有望改善糖尿病腎病的治療效果。胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是腸道L 細(xì)胞分泌的一種激素，GLP-1主要發(fā)揮穩(wěn)定血糖的作用，并能改善高糖條件下的血管內(nèi)皮功能，生理情況下GLP-1的半衰期非常短，能迅速被二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)降解。臨床上對(duì)于2型糖尿病患者的治療策略主要是通過(guò)抑制DPP-4活性或使用GLP-1類似物來(lái)增加腸促胰島素反應(yīng)[5]。除此之外，某些DPP-4抑制劑也顯示出抗氧化能力[6]。曲格列汀是由日本武田公司最近開發(fā)的一種DPP-4抑制劑[7- 8]。然而迄今為止曲格列汀是否也像其它DPP-4抑制劑一樣具有抗氧化應(yīng)激活性仍不清楚。本研究旨在探討曲格列汀對(duì)高糖條件下人腎系膜細(xì)胞(human renal mesangial cells，HRMCs)表達(dá)HO-1的影響，并初步探討其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要實(shí)驗(yàn)材料

人腎系膜細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)提供。曲格列汀購(gòu)自Takeda；RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen。鼠抗人Nrf2抗體購(gòu)自Santa Cruz；抗Akt磷酸化抗體購(gòu)自Cell Signaling。siRNA由廣州瑞博公司合成。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HRMCs用含10%熱滅活的胎牛血清、5×104U/L青霉素和50 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)到視野80%～90%密度時(shí)，棄培養(yǎng)基，加入5 mL無(wú)菌PBS漂洗3次，經(jīng)胰酶消化后，加入新鮮培養(yǎng)基并按照比例進(jìn)行傳代。本研究用的HRMCs傳代次數(shù)在25～30次。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、高糖組及曲格列汀干預(yù)組，其中對(duì)照組的葡萄糖濃度為5 mmol/L，高糖組的葡萄糖濃度為25 mmol/L，曲格列汀干預(yù)組在高糖組的基礎(chǔ)上分別加入濃度為1、5和10 μmol/L的曲格列汀作用24 h。

2.2RT-qPCR檢測(cè)HO-1 mRNA的表達(dá) 采用Qiagen公司提供的RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA。隨后將其逆轉(zhuǎn)錄為從cDNA后，采用實(shí)時(shí)定量PCR分析HO-1 mRNA的表達(dá)。HO-1的上游引物序列為5’-AGAGCCTGCAGCTTCTCAGA-3’， 下游引物序列為5’-ACAAAGTCTGGCCATAGGAC-3’； GAPDH的上游引物序列為5’- CCACTCCTCCACCTTTGAC-3’，下游引物序列為5’- ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3’。擴(kuò)增反應(yīng)于ABI Prism 7900上進(jìn)行，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

2.3Western blot分析蛋白表達(dá) HRMCs處理結(jié)束后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min；12 000 r/min、4 ℃離心20 min，上清即為總蛋白。對(duì)于核蛋白提取，使用Pierce提供的試劑盒提取細(xì)胞核總蛋白。隨后獲取各處理組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。經(jīng)封閉和洗膜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌謩e用抗HO-1、p-Akt、total-Akt、Nrf2和β-actin(Santa Cruz)孵育。隨后用HRP標(biāo)記的II抗孵育，最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光、顯影，并用ImageJ軟件進(jìn)行灰度掃描。

2.4HO-1活性的測(cè)定 經(jīng)處理后的HRMCs用PBS洗滌，然后超聲離心(18 000×g，10 min，4 ℃)，所得微粒體顆粒再懸浮于冰冷磷酸鉀緩沖液(100 mmol/L)中。上清蛋白(1 mg)與含小鼠肝細(xì)胞溶膠(1 mg蛋白)、50 μmol/L血紅素、1 mmol/L NADPH、2 mmol/L葡萄糖-6-磷酸和0.2 U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的混合物在pH 7.4的100 mmol/L磷酸鉀緩沖液中，避光孵育1 h。然后用1 mL氯仿提取膽綠素，并用酶標(biāo)儀測(cè)定其吸光度。HO-1活性以每毫克蛋白每小時(shí)形成的膽紅素表示。

2.5ROS生成的測(cè)定 以H2DCF-DA為熒光探針，用熒光法測(cè)定ROS的生成。即，細(xì)胞在37 ℃下用探針孵育30 min，PBS漂洗后用熒光分光光度計(jì)分別在485 nm和538 nm的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2.6RNA干擾實(shí)驗(yàn) 采用Mirus公司提供的TransIT-TKO試劑沉默HRMCs中的Nrf2。簡(jiǎn)言之，使用TransIT-TKO試劑將Nrf2特異性siRNA轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HRMCs中(每孔2.5×105個(gè))。轉(zhuǎn)染后24 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基用于下一步實(shí)驗(yàn)。本研究使用的siRNA序列是為5’-GAGUAUGAGCUGGAAAAACdTdT-3’和5’-GUUUUUCCAGCUCAUACUCdTdT-3’，siRNA由廣州瑞博合成；用于陰性對(duì)照的nontarge-ting siRNA購(gòu)自Dharmacon。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析 (one-way ANOVA)后應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行各組均數(shù)間兩兩比較。以P<0.05，為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 不同濃度曲格列汀對(duì)HO-1表達(dá)及酶活性的影響

首先我們采用RT-qPCR檢測(cè)了不同濃度曲格列汀對(duì)HRMCs中HO-1 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，與5 mmol/L葡萄糖濃度組相比，25 mmol/L高糖培養(yǎng)后的HRMCs中HO-1 mRNA表達(dá)僅輕微增高，而同時(shí)給予1、5和10 μmol/L曲格列汀作用12 h可明顯上調(diào)HO-1的mRNA表達(dá)水平(P<0.05),見圖1A。同時(shí)，Western blot也顯示曲格列汀處理24 h后的HRMCs內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)水平也顯著增高(P<0.05)，見圖1B，同時(shí)，HO-1的酶活性也隨著曲格列汀濃度的增高而增高(P<0.05)，見圖1C。

Figure 1.Effect of trelagliptin at different concentrations on mRNA expression (A), protein expression (B) and enzyme activity (C) of HO-1. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 5 mmol/L glucose group.

2 曲格列汀誘導(dǎo)HO-1表達(dá)與細(xì)胞內(nèi)ROS有關(guān)

HRMCs在25 mmol/L葡萄糖作用下，細(xì)胞內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度僅輕微增高，而采用1、5和10 μmol/L曲格列汀作用8 h后，HRMCs內(nèi)ROS的熒光強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。此外，給予ROS清除劑N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)10 mmol/L預(yù)處理1 h后，可明顯抑制曲格列汀誘導(dǎo)的HO-1表達(dá)(P<0.05),見圖2。

Figure 2.The effects of trelagliptin on the production of ROS in the HRMCs with high glucose culture. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 5 mmol/L glucose group; #P<0.05 vs 25 mmol/L glucose+trelagliptin group.

3 曲格列汀通過(guò)PI3K/Akt通路誘導(dǎo)HO-1表達(dá)

為了觀察高糖條件下曲格列汀對(duì)PI3K/Akt通路的影響，本研究首先采用Western blot檢測(cè)了不同濃度曲格列汀對(duì)Akt磷酸化的影響。結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L曲格列汀作用HRMCs 8 h后，Akt的磷酸化水平明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖3A。為了探究PI3K/Akt是否參與HO-1的表達(dá)，我們采用PI3K特異性抑制劑LY294002預(yù)處理HRMCs 1 h，Western blot結(jié)果顯示，HO-1表達(dá)水平明顯減少(P<0.05),見圖3B。

4 曲格列汀經(jīng)ROS和PI3K/Akt激活核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2

為了觀察曲格列汀是否能激活Nrf2，我們采用Western blot檢測(cè)了Nrf2的核轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示高糖條件下細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)水平僅輕微增加，而曲格列汀處理后，Nrf2的核轉(zhuǎn)位進(jìn)一步增多，而分別采用ROS清除劑NAC和PI3K抑制劑LY294002處理后，細(xì)胞核內(nèi)的Nrf2表達(dá)水平明顯減少(P<0.05),見圖4。

5 敲減Nrf2表達(dá)后曲格列汀喪失誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的效應(yīng)

采用特異性siRNA敲減Nrf2表達(dá)后，HRMCs中Nrf2蛋白表達(dá)減少，見圖5A，再用10 μmol/L曲格列汀誘導(dǎo)細(xì)胞18 h，Western blot結(jié)果顯示，Nrf2-siRNA組HO-1的表達(dá)也減少(P<0.05)，見圖5B。

討 論

GLP-1 受體廣泛表達(dá)于心臟、肺組織、消化系統(tǒng)以及腎臟等，它除了能促進(jìn)胰島素的分泌并增強(qiáng)其敏感性之外，還具有胰島素外的作用[9]。研究表明，DPP-4 抑制劑不但可延長(zhǎng) GLP-1 的半衰期，還具有多種GLP-1之外的效應(yīng)[10]，如西格列汀除了降血糖外，還能縮小動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積，并能抑制細(xì)胞因子的分泌，并對(duì)糖尿病腎損傷具有保護(hù)作用[11]。曲格列汀作為一種新型的DPP-4抑制劑，其降糖之外的活性目前尚不清楚。在本研究中，我們得到了以下重要發(fā)現(xiàn)：(1) 曲格列汀能上調(diào)HRMCs內(nèi)源性ROS的生成，并能激活PI3K/Akt信號(hào)通路；(2)曲格列汀能活化下游核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2，最終上調(diào)HO-1的表達(dá)。

糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，但其核心機(jī)制是高血糖所致的自由基的生成與清除失衡[12-13]，正常情況下，人體存在多種抗氧化機(jī)制來(lái)拮抗ROS損傷。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)曲格列汀不但可上調(diào)HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)也能增強(qiáng)其酶活性。HO-1可通過(guò)其降解血紅素的產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化損傷，另一方面也可下調(diào)TGF-β1的表達(dá)而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用[14]，這表明曲格列汀能有效上調(diào)高糖條件下腎系膜細(xì)胞中HO-1的表達(dá)而改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，該機(jī)制獨(dú)立于血糖調(diào)節(jié)之外。

Figure 3.The effects of trelagliptin on the expression PI3K/Akt signaling-related protein in the HRMCs. A:the effect of trelagliptin at different concentrations on the Akt phosphorylation; B: the effects of PI3K inhibitor on the expression of HO-1 in HRMCs induced by trelagliptin. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 5 mmol/L glucose group; #P<0.05 vs 25 mmol/L glucose+trelagliptin group.

為了進(jìn)一步明確曲格列汀誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的分子機(jī)制，我們隨后對(duì)其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。HO-1的表達(dá)主要受核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的調(diào)控[15]，此外，PKC，PI3K/Akt和NAPDH氧化酶也參與了HO-1的表達(dá)[16-17]。為了明確上述分子是否參與了曲格列汀誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，本研究首先測(cè)定了處理前后細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。在正常血糖條件下，HRMCs內(nèi)ROS的含量較低，高糖條件下ROS有一定的增高，但曲格列汀處理后，可促進(jìn)ROS進(jìn)一步增高。隨后采用ROS清除劑處理后，HO-1表達(dá)明顯減少。這表明ROS在HO-1的表達(dá)過(guò)程中發(fā)揮了信使分子的作用。PI3K/Akt是調(diào)控HO-1表達(dá)的另一關(guān)鍵信號(hào)通路[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)高糖條件下Akt磷酸化水平也有輕微增高，但曲格列汀處理后，Akt磷酸化水平顯著增高。采用PI3K/Akt抑制劑預(yù)處理后，HO-1減少，表明PI3K/Akt也參與了HO-1的表達(dá)。最后，本研究也發(fā)現(xiàn)曲格列汀能上調(diào)細(xì)胞核內(nèi)Nrf2水平，而ROS清除劑NAC以及PI3K/Akt抑制劑處理后，Nrf2活性有所降低，表明ROS和PI3K/Akt位于Nrf2的上游，兩者通過(guò)激活Nrf2而最終促進(jìn)HO-1的表達(dá)。

Figure 4.The effects of PI3K inhibitor LY294002 and ROS scavenger N-acetylcysteine (NAC) on the protein expression of Nrf2 in the HRMCs with trelagliptin induction. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 5 mmol/L glucose group; #P<0.05 vs 25 mmol/L glucose+trelagliptin group.

總之，本研究證實(shí)曲格列汀能增加高糖條件下HRMCs 的HO-1表達(dá)，從而改善氧化應(yīng)激水平。HO-1能夠降低由氧化應(yīng)激損傷導(dǎo)致的組織細(xì)胞損傷，最終發(fā)揮對(duì)腎臟的保護(hù)功能，為糖尿病腎病的治療提供了一個(gè)新的策略和思路。

Figure 5.The effects of Nrf2 expression knock-down on the HO-1 expression induced by trelagliptin in the HRMCs. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs 5 mmol/L glucose group; #P<0.05 vs nontargeting siRNA group.