轉錄輔激活因子和乙酰基轉移酶p300在心臟成纖維細胞衰老相關纖維化中的作用*

高小燕， 李 昕， 韋鑒欽， Nanette Hahr BISHOPRIC， 王釗煜， 周慧珊， 饒 芳△， 鄧春玉

(1華南理工大學醫(yī)學院， 廣東 廣州 510006； 2廣東省心血管病研究所心內科， 廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學研究部，廣東省醫(yī)學科學院， 廣東 廣州 510080； 3邁阿密大學米勒醫(yī)學院, 分子心臟病學及分子和細胞藥理學系， 美國 佛羅里達州 邁阿密 33101)

房顫(atrial fibrillation，AF)是臨床最常見的心律失常之一，其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加。隨著人口的老齡化，我國AF的發(fā)病率逐年增加，探索衰老在AF發(fā)病中的機制顯得尤為重要。結構重塑是AF發(fā)生的主要病理機制之一，而心房擴大和纖維化是AF結構重塑的主要表現[1]，心房纖維化可使心房傳導發(fā)生異常，從而產生心房折返通路誘發(fā) AF[2]。研究者發(fā)現與老年患者相比，年輕患者左房纖維化更少。年老組患者左房基質金屬蛋白酶2/9(matrix metalloproteinase-2/-9, MMP-2/9)活性明顯升高，而金屬蛋白酶組織抑制劑物(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMP)水平明顯降低，年齡是唯一影響纖維化形成的因素[3]。

動物實驗亦發(fā)現，快速起搏誘發(fā)AF的老年犬其左房纖維化相對于成年犬要嚴重[4]。主動脈縮窄術后心臟纖維化小鼠心臟中，衰老的心臟成纖維細胞(cardiac fibroblasts，CFs)明顯增加[5]；在人體組織中，亦發(fā)現AF患者心臟纖維化亦伴隨著衰老CFs的堆積[6]，提示衰老CFs在心臟纖維化中起重要作用。此外，另有研究顯示，衰老可使心臟膠原合成降解失衡，膠原交聯增強，最終導致纖維化發(fā)生[7-8]。

p300是一種能與腺病毒E1A蛋白相互作用的蛋白質，因其分子量為300 kD，被命名為p300，也被稱為KAT3B或EP300。作為重要的真核生物基因調控因子，p300參與細胞生長、增殖和分化[9]。研究表明，p300參與慢性高血糖所致人皮膚微血管內皮細胞衰老[10]，以及維持端粒功能和調節(jié)端粒相關的DNA損傷反應進而影響細胞衰老和周期[11]；p300在硬皮病患者皮膚成纖維細胞中表達增加，且參與人皮膚成纖維細胞轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smads誘導的膠原生成增加[12]。因此，p300不僅參與細胞衰老的發(fā)生，還參與纖維化的發(fā)生，但是p300在CFs衰老及衰老相關纖維化中的作用尚不清楚。

綜上所述，進一步明確p300在CFs衰老相關纖維化中的作用對了解衰老在AF發(fā)生發(fā)展中的作用具有重要意義。因此，本研究擬用不同月齡的C57BL/6小鼠以及不同代數的CFs為研究對象，觀察p300、衰老及纖維化相關蛋白的表達變化，并干預p300，觀察其對CFs衰老的影響。

材 料 和 方 法

1 動物

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，3周齡，7周齡、5月、13月和18月齡，由廣東省廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2013-0034。不同基因型(p300+/+和p300flox/+)小鼠獲贈于Dr. David Roux(Jackson Laboratory in Miller School of Medicine in University of Miami)。心臟成纖維細胞由小鼠心臟分離獲取，連續(xù)傳代至20代。本研究所有動物實驗已通過廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)的動物實驗倫理審查(No.GDREC2016128A)。

2 主要試劑

DMEM-F12 培養(yǎng)基(HyClone)；特級澳洲胎牛血清和 0.25% EDTA-胰蛋白酶(Gibco)；pBS185CMV-Cre 質粒和Neo-pEGFP-C1質粒(Addgene)；G418和質粒提取試劑盒GenElute Plasmid DNA Miniprep Kit(Sigma)；DNeasy Blood & Tissue 試劑盒(Qiagen)；轉染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen)；DNA 及蛋白 marker(Fermentas)；抗p300 抗體(Millipore)；抗I型膠原蛋白α1鏈(collagen type I α1 chain，Col1A1)抗體(Abcam)；抗MMP-2和p21抗體(Santa Cruz)；抗p53、GAPDH、β-actin和TGF-β抗體及衰老相關β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal) 染色試劑盒(Cell Signaling Technology)；其它生化試劑均為進口分裝或國產分析純化。

3 主要方法

3.1細胞培養(yǎng)、質粒轉染和克隆獲取 使用0.25%EDTA-胰蛋白酶，從C57BL/6小鼠(3周齡)及p300+/+和p300flox/+小鼠(3月齡)心臟中消化分離心臟成纖維細胞，采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含10% FBS、100 mg/L 鏈霉素和1×105U/L青霉素)培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。C57BL/6小鼠(3周齡)心臟成纖維細胞傳代至第3、7和11代，用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化收集于EP管，用于后續(xù)實驗；p300+/+和p300flox/+小鼠(3月齡)心臟成纖維細胞傳代至第4代，將細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待細胞密度達70%～80%時即進行轉染。3.3 μg plasmid(3 μg pBS185CMV-Cre+0.3 μg Neo-pEGFP-C1)與相應體積的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻，10 μL Lipofectamine 2000試劑與相應體積Opti-MEM培養(yǎng)基混合室溫孵育5 min。然后將分別含有plasmid 和脂質體的溶液混合，輕柔混勻，室溫孵育20 min后加入心臟成纖維細胞的培養(yǎng)基中，混勻，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后給予G418(1.1 g/L)進行篩選，獲得細胞克隆，挑取細胞克隆擴增，獲得穩(wěn)定表達的細胞株。

3.2PCR鑒定細胞基因型 采用DNeasy Blood & Tissue 試劑盒分離提取各組細胞的DNA，分光光度法測定計算提取的DNA含量及濃度。PCR總反應體積為25 μL，其中具體方法如下：10 mmol/L dNTP，0.5 μL；50 mmol/L MgCl2，1.25 μL；10×PCR buffer，2.5 μL；10 μmol/L p300Xba+117S，1 μL；10 μmol/L p300Bam-460AS，1 μL；H2O，17.5 μL；DNA，1 μL；Taq polymerase，0.25 μL。引物序列：p300Xba+117S:5′-TGGACTGGTTATCGGTTCACC-3′；p300Bam-460AS:5′-CAGTTACATACAGCTGTGATG-3′。PCR程序為：94 ℃ 5 min；33×(94 ℃ 10 s、55 ℃ 1 min、68 ℃ 2 min)；72 ℃ 7 min；4 ℃ forever。野生型的目的條帶為800 bp，flox的條帶為1 kb。然后，取PCR產物加適量上樣緩沖液，在瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠圖像成像系統(tǒng)拍攝保存實驗結果。

3.3Western blot實驗 細胞或剪碎研磨的組織內加入適量 RIPA裂解液，同時加入蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，收集裂解液，12 000 r/min離心20 min，取上清，分裝后儲存于-80 ℃。測定蛋白濃度后，4×上樣緩沖液(Invitrogen)稀釋后的30 μg樣本，95 ℃煮5 min。8%～10% SDS-PAGE分離蛋白，然后轉至PVDF膜。TBST-脫脂牛奶室溫下封閉2 h，加入相應Ⅰ抗[p300(1∶1 000)、Col1A1(1∶2 500)、MMP-2(1∶2 000)、p53(1∶1 000)、TGF-β(1∶1 000)、p21(1∶750)和GAPDH(1∶1 000)]，4 ℃過夜。TBST 洗3次，每次10 min。根據Ⅰ抗來源種屬選擇合適的Ⅱ抗(辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗小鼠IgG)，5%脫脂奶粉1∶1 000比例稀釋，室溫孵育1 h。TBST洗3次，每次10 min。ECL 試劑盒顯影蛋白條帶，ImageJ軟件定量分析蛋白灰度值，計算比值進行統(tǒng)計分析。

3.4SA-β-Gal染色 將細胞接種于6孔板，待細胞融合度達50%～70%可進行SA-β-Gal染色。棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次，室溫固定15 min，PBS清洗3次，按SA-β-Gal染色試劑盒說明配制染色工作液，調整pH至6.0，每孔加入1 mL染色液，37 ℃無CO2培養(yǎng)箱避光孵育24 h后，顯微鏡下采集圖像。

3.5活細胞計數 將細胞制成細胞懸液，輕輕吹打細胞懸液，使細胞均勻分布；0.4%臺盼藍以1∶9與細胞懸液充分混勻，吸出少許細胞懸液滴于細胞計數板，靜置1～2 min，拒染的為活細胞；顯微鏡下對計數板4個大格內的活細胞進行計數，遵循計上不計下，計左不計右原則；根據公式“細胞數=4大格細胞計數總數/4×稀釋倍數×104×細胞懸液體積”算得細胞數目。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數據均采用均數±標準誤(mean±SEM)表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD和SNK檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 不同月齡小鼠心臟組織p300及衰老和纖維化相關蛋白表達

Western blot檢測不同月齡(7周、5月、13月和18月齡)C57BL/6小鼠左心房組織中p300，衰老相關指標p53和p21及纖維化相關蛋白Col1A1、MMP-2和TGF-β。結果顯示，隨著月齡增加，13月和18月齡小鼠左心房組織p300蛋白表達升高(P<0.01);與7周齡小鼠相比，13月和18月齡小鼠左心房組織p53和p21蛋白表達亦明顯增加(P<0.05)；纖維化相關蛋白Col 1A1的表達在13月和18月齡小鼠左心房組織中表達明顯高于7周齡和5月齡組小鼠(P<0.05)，MMP-2和TGF-β則以18月齡組小鼠左心房組織表達為最高(P<0.05)，見圖1。這提示隨著月齡的增加，小鼠左心房p300表達明顯升高，伴隨著纖維化和衰老相關因子的表達增加。

Figure 1.The protein expression of p300, p53, p21, Col1A1,MMP-2 and TGF-β in the atrial tissues of C57BL/6 mice at different ages. w: weeks; m: months. Mean±SEM. n=6～8. *P<0.05, **P<0.01 vs 7 w group; #P<0.05, ##P<0.01 vs 5 m group.

2 不同代數C57BL/6小鼠心臟成纖維細胞中p300、衰老相關蛋白及纖維化相關蛋白的表達

原代分離C57BL/6小鼠CFs，并傳代培養(yǎng)誘導細胞衰老。取第3、7和11代細胞，Western blot檢測p300、p53、p21、Col 1A1、MMP-2和TGF-β蛋白表達。隨著細胞傳代代數的增加，p300蛋白表達明顯增加，以第11代的CFs表達最高(P<0.05)；與第3代相比，第11代CFs細胞p53和p21蛋白的表達亦明顯增加(P<0.05)。纖維化相關蛋白Col1A1、MMP-2和TGF-β隨著細胞代數的增加，與第3代小鼠CFs相比，第11代CFs的Col1A1、MMP-2和TGF-β的蛋白表達均明顯增加(P<0.01)，見圖2。這提示，隨著心臟成纖維細胞的衰老，p300的表達和纖維化因子分泌增加。

Figure 2.The protein expression of p300, p53, p21,Col1A1, MMP-2 and TGF-β in mouse cardiac fibroblasts of different passages. Mean±SEM. n=6～8. *P<0.05, **P<0.01 vs P3 cells.

3 穩(wěn)定敲除p300的心臟成纖維細胞株的建立

分離p300+/+和p300flox/+小鼠的CFs，構建pBS185 CMV-Cre和Neo-pEGFP-C1質粒，以10∶1的比例，使用Lipofectamin 2000進行轉染，轉染24 h后，倒置熒光顯微鏡觀察，見圖3A。予以G418(1.1 g/L)篩選后形成細胞克隆，PCR鑒定p300是否成功被敲除一條等位基因。結果顯示，Het 組細胞株1a、2a、5a和5b均被成功敲除p300的一條等位基因，且Western blot檢測提示其p300蛋白表達明顯下降(P<0.01),見圖3B、C。

Figure 3.Cell fluorescence and p300 expression after plasmid transfection. A: cell fluorescence after plasmid transfection for 24 h; B: PCR results for genotypes of WT (1, 2, 3, 4 and 5) and Het (1a, 2a, 3a, 4a, 5a and 6a); C: the protein expression of p300 in cardiac fibroblasts after p300 knockout in WT and Het mice. Mean±SEM. n=3. **P<0.01 vs Het control.

4 p300敲除小鼠心臟成纖維細胞的衰老率明顯低于對照組

WT組和Het組(p300-/+)的細胞分別予以傳代，取第12、15和18代細胞觀察2組細胞衰老率的不同。SA-β-Gal染成綠色的提示為衰老細胞。結果發(fā)現，WT組各代均有核染成綠色的衰老細胞，且隨著細胞代數的增加，衰老細胞增加；而Het組各代均無衰老細胞出現，見圖4A。這些結果提示部分敲除p300的CFs，隨著培養(yǎng)代數的增加，衰老細胞明顯少于野生型對照組。

5 p300敲除小鼠心臟成纖維細胞的生長速度明顯快于對照組

WT組和Het組(p300-/+)的細胞傳代至第12代，每日予以細胞計數，并繪制細胞增殖曲線，結果發(fā)現與WT組細胞相比，Het組細胞增殖明顯較快(P<0.01)，見圖4B。此結果提示，隨著細胞衰老模型的建立，細胞增殖速度減慢，而敲除p300可保護細胞免于增殖速度減慢，進而減少衰老。

Figure 4.Cell senescence and proliferation in p300 KO Het and WT CFs. A: representative images of SA-β-Gal staining in p300 KO Het and WT cell clones in passages 12, 15 and 18 (×40); B: the cell growth curve of Het and WT cell clones in passage 12. Mean±SEM. n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs WT group.

討 論

綜合以上研究結果，C57BL/6小鼠心房組織中，p300隨著年齡的增加而增加，并伴隨著衰老相關因子p53和p21及纖維化相關因子Col1A1、MMP-2和TGF-β表達的增加；p300參與心臟成纖維細胞衰老和衰老相關纖維化的發(fā)生；敲除p300表達有助于延緩成纖維細胞衰老的發(fā)生。

細胞衰老是指可增殖細胞細胞周期停滯于G1期，是對應激的一種反應，表現為細胞形態(tài)扁平，體積增大，并出現染色質集落、衰老相關的半乳糖苷酶和脂褐素顆粒等特異性標志物。細胞衰老分為復制性衰老和過早衰老，現有研究表明高糖、D-半乳糖等刺激因素均可用于誘導細胞衰老模型建立[13]。正常成纖維細胞在體外培養(yǎng)時，表現為有限生長，即傳代代數有限，通常被用作生物體衰老模型[14]。盡管細胞衰老是對應激的一種適應性反應，可增加器官壽命，但亦可對器官生存起負面作用。機體衰老時，衰老細胞在增殖性組織中聚集，釋放多種降解酶、生長因子和炎癥因子，影響周圍非衰老細胞的功能，從而導致一系列疾病?，F有研究表明衰老心臟成纖維細胞在疾病相關心臟纖維化中起重要作用[6, 9]，但其在衰老相關纖維化中的作用及具體機制尚不明確。因此，通過傳代心臟成纖維細胞建立復制性衰老模型模擬心臟衰老，探討其潛在機制，對于防治衰老相關心臟纖維化具有重要的生理病理意義。

p300是一種轉錄輔激活因子和乙?；D移酶，具有內在乙酰基轉移酶活性，其分子中富含半胱氨酸/組氨酸區(qū)域(CH1～CH3)、KIX 區(qū)域、溴區(qū)、組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase，HAT)區(qū)和C末端富含谷氨酰胺區(qū)[15-17]。乙?；负徒M蛋白去乙酰化酶是一對相反的調控因子，參與調控細胞凋亡，DNA損傷修復，細胞周期控制，自噬和代謝等等[18-21]。研究表明去乙?；讣せ羁赏ㄟ^介導卡路里的限制和抑制胰島素信號，延長壽命[22]，參與衰老。因此可推測乙?；竝300也參與衰老的發(fā)生。轉錄共激活因子 p300作為一種乙酰轉移酶，其功能已得到廣泛的關注與研究，而直接關注p300在衰老中作用的研究較少。但已有研究表明，顯性失活p300轉基因抑制p300 HAT后，正常人黑素細胞經歷生長停滯，細胞周期蛋白抑制和細胞衰老激活[23]。此外，在腫瘤研究中發(fā)現，p300/CBP HAT 活性抑制劑 C646 可抑制人類黑色素瘤和其他腫瘤細胞的生長，促進細胞衰老[24]。

盡管多種細胞信號通路參與細胞衰老過程，但最終都集中于2個經典的信號通路，p53/p21通路和p16/Rb通路。通常正常細胞內MDM2(mouse double minute 2)與p53相互結合，抑制p53活性，維持p53低表達。細胞分裂時，MDM2活性被抑制，p53激活下游細胞周期依賴激酶抑制蛋白p21，從而使細胞周期停止。當細胞發(fā)生復制性衰老時可通過p53/p21通路啟動細胞衰老過程。另一條通路，當細胞受到外界刺激或DNA損傷時，可上調細胞內p16表達，抑制CDK4/6與細胞周期蛋白形成復合物，激活視網膜母細胞瘤蛋白Rb，抑制轉錄因子E2F活性，誘發(fā)細胞衰老[25]。當細胞發(fā)生過早衰老時，可通過p53/p21和p16/Rb通路啟動細胞衰老。本研究顯示，隨著動物或細胞衰老的發(fā)生，p300/p53/p21表達亦上調，這與以往在人臍靜脈血管內皮細胞中的研究發(fā)現p300在高糖刺激誘導的衰老內皮細胞中表達上調的報道一致[24]。人原代成纖維細胞中的研究也有報道p300/CBP是衰老途徑中p53的轉錄共激活因子，而E1A或siRNA對p300/CBP的失活可通過阻止p53活化來延緩衰老[26]。

此外，p300還可參與纖維化，如p300參與糖尿病患者心肌肥厚的同時，促進心肌纖維化[27]。但是p300參與衰老相關心臟纖維化的具體機制仍未被闡明。TGF-β是心房纖維化調控中的核心生長因子，由成纖維細胞生成。TGF-β1過表達可導致心房纖維化和心房傳導異常，產生心房折返通路誘發(fā)AF[2]。本研究證實，p300隨著衰老的發(fā)生增加，同時心臟成纖維細胞膠原蛋白和TGF-β表達也升高，最終小鼠心臟纖維化發(fā)生。這提示，p300不僅參與衰老的發(fā)生，還可能通過調控TGF-β相關纖維化通路參與心臟衰老相關纖維化的發(fā)生。

綜上所述，本文證實p300參與CFs衰老的發(fā)生，且可能通過調控纖維化相關蛋白表達參與CFs衰老相關纖維化，而抑制p300可延緩CFs衰老相關纖維化的發(fā)生。本研究進一步拓展了我們對于p300在CFs衰老中作用的認識，但其具體機制仍進一步深入研究去論證, 以期為臨床上衰老所致AF的防治提供新的策略。