水稻Histone3同源蛋白序列和基因表達(dá)特性分析

胡明瑜 白文欽 潘曉雪 吳紅 雷開榮

摘? ?要? ?組蛋白Histone3是表觀遺傳調(diào)控的重要靶蛋白。同一物種中往往有多個(gè)Histone3同源基因，這些同源基因在生物學(xué)功能上是否有差異尚不清楚。本研究對水稻的8個(gè)Histone3同源蛋白作了比較，發(fā)現(xiàn)在N端序列差異相對較大。在“秀水03”和“日本晴”中，8個(gè)Histone3同源基因的表達(dá)特性相似，其中LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在大部分組織器官中組成型表達(dá)，而其他Histone3同源基因的表達(dá)水平較低;部分同源基因在種子、花粉囊和雌蕊等組織器官中特異性高表達(dá)。進(jìn)一步分析這些同源基因的上游調(diào)控序列，發(fā)現(xiàn)具有大量的生長調(diào)節(jié)劑和環(huán)境信號(hào)調(diào)控元件，以及組織特異性表達(dá)相關(guān)元件，并且不同基因中的調(diào)控元件有一定差別，如在LOC_Os04g34240和LOC_Os06g04030中含有生長素應(yīng)答元件，而在LOC_Os05g41080和LOC_Os03g27310中含有赤霉素應(yīng)答元件。這些結(jié)果表明，水稻Histone3同源基因不僅編碼的氨基酸序列有差異，而且在表達(dá)調(diào)控上也有較大差別，暗示這些基因在生物學(xué)功能上可能有所差異。

關(guān)鍵詞? ? 水稻;組蛋白;OsHistone3;基因表達(dá);表觀遺傳調(diào)控

中圖分類號(hào)：S511.5;Q78? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.31.001

表觀遺傳調(diào)控在植物適應(yīng)不同生物逆境的過程中發(fā)揮著重要作用[1]。近幾年，越來越多的證據(jù)表明，植物抗病性與DNA/RNA甲基化、非編碼RNA表達(dá)和組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)。例如，在擬南芥中，利用siRNAs （small interference RNAs）介導(dǎo)RNA依賴性的DNA甲基化，對DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行修飾，可增強(qiáng)對病毒的防御能力[1]。在侵染擬南芥的溴病毒（bromovirus）中，腺嘌呤甲基化程度與擬南芥抵抗侵染的能力相關(guān)，表明RNA水平的甲基化也與抗病性相關(guān)[2]。

組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控的重要方式，包括組蛋白乙?；⒓谆头核鼗?。擬南芥突變體Atelp2和Atelp3-10對十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola）等病原菌高度敏感，研究發(fā)現(xiàn)，受到病原體侵染時(shí)，AtELP2和AtELP3蛋白促進(jìn)防御應(yīng)答基因表達(dá)，而這與AtELP2和AtELP3的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性有關(guān)[3-4]。擬南芥ATX1蛋白具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性，能夠激活拮抗水楊酸和茉莉酸甲酯信號(hào)的WRKY70基因表達(dá)，并維持該基因核小體的Histone3組蛋白在K4位的三甲基態(tài);同時(shí)，水楊酸信號(hào)應(yīng)答基因PR1和茉莉酸甲酯信號(hào)應(yīng)答基因THI2.1的核小體也是ATX1蛋白的作用靶點(diǎn)[5]。擬南芥組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SDG8（set domain group 8）通過調(diào)控茉莉酸甲酯和乙烯信號(hào)相關(guān)基因，來防御真菌病原侵染;其功能缺失突變體sdg8-1對蕓薹生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）和灰葡萄孢菌石竹變種（Botrytis cinerea）等病原菌的防御能力降低[6]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SDG8和SDG25調(diào)控?fù)p傷相關(guān)內(nèi)源性肽pep1、細(xì)菌鞭毛蛋白flg22和效應(yīng)物誘發(fā)的植物免疫反應(yīng)和系統(tǒng)性抵抗反應(yīng)[7]。在玉米中，對赤藻莖腐病抗性與ZmCCT基因表達(dá)水平相關(guān);在感病株系中發(fā)現(xiàn)ZmCCT基因上游調(diào)控序列中插入轉(zhuǎn)座子元件，使組蛋白激活標(biāo)簽H3K4me3被刪除，并引入大量甲基化的GC序列，導(dǎo)致ZmCCT基因在病原菌侵染時(shí)無法誘導(dǎo)表達(dá)[8]。黃單胞桿菌水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）侵染水稻時(shí)，誘導(dǎo)15個(gè)組蛋白賴氨酸去甲基化酶（Jumonji C）基因表達(dá);在jmj704突變株中H3K4me2/3標(biāo)記水平顯著增加，表明JMJ704蛋白可能調(diào)控H3K4me2/3的去甲基化[9]。此外，用大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）毒素處理擬南芥組蛋白H2B單泛素化相關(guān)突變體（hub1-4、hub2-2、ubc1-1、hub1-4/hub2-2、ubc1-1/ubc2-2等），發(fā)現(xiàn)組蛋白H2B單泛素化在防御反應(yīng)中參與調(diào)控了微管的動(dòng)力學(xué)特性[10]。這些證據(jù)表明在受到病原侵染時(shí)，植物的防御反應(yīng)與組蛋白修飾緊密相關(guān)，開展組蛋白及其修飾酶的研究對于揭示植物抗病機(jī)理有重要意義。

已有研究表明，組蛋白Histone3具有多種修飾酶（如甲基化酶ATX1、SDG8、SDG25和去甲基化酶家族JMJCs等）及多個(gè)修飾位點(diǎn)（如H3K4、H3K9和H3K27等），而且Histone3的不同修飾參與調(diào)控植物生長發(fā)育和對病原菌的防御反應(yīng)[11]，這說明Histone3是植物進(jìn)行表觀遺傳調(diào)控的重要靶蛋白和紐帶，在植物生長發(fā)育調(diào)控和抵抗病原菌方面具有重要作用;不過，目前對Histone3基因自身的表達(dá)特性還研究較少。為了解Histone3基因是否可能在轉(zhuǎn)錄水平參與植物表觀遺傳調(diào)控，我們對水稻Histone3同源基因的編碼蛋白進(jìn)行了比較，并對基因表達(dá)特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)水稻中有8個(gè)Histone3同源基因，根據(jù)編碼蛋白質(zhì)的同源性可分為4組，同源蛋白間N端序列差異相對較大。表達(dá)分析顯示，8個(gè)Histone3同源基因在“秀水03”和“日本晴”中表達(dá)特性相似，其中LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在不同組織器官中組成型表達(dá)，而其他Histone3同源基因表達(dá)水平較低，LOC_Os12g22680、LOC_Os05g41080和LOC_Os02g25910分別在種子、花粉囊和雌蕊中相對高表達(dá)。對Histone3同源基因上游調(diào)控序列分析，發(fā)現(xiàn)存在多種生長調(diào)節(jié)劑的信號(hào)調(diào)控元件和環(huán)境響應(yīng)元件，同時(shí)還有胚乳、莖尖、分生組織等部位特異表達(dá)元件。水稻Histone3同源基因之間的上游調(diào)控序列包含的順式調(diào)控元件也存在差異，如生長素應(yīng)答元件主要在LOC_Os04g34240和LOC_Os06g04030中，而赤霉素應(yīng)答元件主要在LOC_Os05g41080和LOC_Os03g27310中，這表明水稻Histone3同源基因在生物學(xué)功能上可能有所差異。綜合而言，編碼Histone3蛋白同源性高的基因表達(dá)特性相似，部分水稻Histone3基因具有組織表達(dá)特異性。這為進(jìn)一步探索Histone3同源蛋白在調(diào)控植物生長發(fā)育和防御反應(yīng)中的不同作用提供了參考。

1 材料與方法

1.1? ?試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料

“秀水03”（Oryza sativa L. “Xiushui 03”），是逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的特早熟晚粳稻品種;“日本晴”（Oryza sativa L. “Nipponbare”），是國際水稻基因組計(jì)劃中的典型粳稻基因組供體，完成了全基因組測序，是常用的水稻研究材料。

1.1.2 試劑

Trizol法總RNA提取試劑盒，購自賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻Histone3同源蛋白序列分析

利用Lasergene的MegAlign程序分析水稻Histone3同源蛋白序列。采用Clustal W方法進(jìn)行計(jì)算，參數(shù)為軟件默認(rèn)。

1.2.2 “秀水03”轉(zhuǎn)錄組測序

“秀水03”種子萌發(fā)2周后，取15棵幼苗幼根，液氮研磨，用Trizol法提取總RNA備用;隨機(jī)抽取15棵田間正常生長的“秀水03”植株，分別用解剖刀取第二、三片完全展開葉，取第二、三節(jié)莖，取開花前和開花后果穗，液氮研磨，用Trizol法提取總RNA備用;從根、莖、葉和穗提取的總RNA樣品檢測合格后，由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司做轉(zhuǎn)錄組測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻Histone3同源蛋白序列比較

表觀遺傳學(xué)研究認(rèn)為，Histone3蛋白的序列變異和修飾與基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系密切。為了解水稻中Histone3同源蛋白序列差異，在國家水稻數(shù)據(jù)中心（http：//www.ricedata.cn/index.htm）查找到8個(gè)水稻Histone3同源基因，基因編號(hào)分別為LOC_Os11g05730、LOC_Os12g22680、LOC_Os06g06510、LOC_Os05g41080、LOC_Os04g34240、LOC_Os06g04030、LOC_Os03g27310和LOC_Os02g25910，對應(yīng)蛋白質(zhì)分別標(biāo)記為Os11g05730、Os12g22680、Os06g06510、Os05g41080、Os04g34240、Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910。

用Clustal W軟件對蛋白質(zhì)序列同源性做了分析（見圖1A）。結(jié)果顯示，Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910的蛋白質(zhì)同源性較高，其中Os06g04030和Os03g27310蛋白質(zhì)序列相同，Os02g25910與前兩者的序列一致性達(dá)到85.3%。Os11g05730、Os06g06510和Os04g34240編碼的蛋白質(zhì)同源性較高，其中Os11g05730和Os06g06510蛋白質(zhì)序列相同，Os04g34240蛋白在N端多出138個(gè)氨基酸殘基，其余部分序列與Os11g05730和Os06g06510蛋白質(zhì)序列相同。Os12g22680和Os05g41080編碼的蛋白質(zhì)與其他Histone3同源蛋白序列差異相對較大，序列一致性在57%～82%。根據(jù)水稻Histone3蛋白同源性分析結(jié)果構(gòu)建進(jìn)化樹（圖1B），可將8個(gè)水稻Histone3蛋白分成4組（組1：Os11g05730、Os06g06510和Os04g34240;組2：Os06g04030、Os03g27310和Os02g25910;組3：Os12g22680;組4：Os05g41080）。這說明水稻中Histone3同源蛋白在序列上存在一定差異，N端序列差異相對較大。

2.2 水稻“秀水03”中Histone3同源基因表達(dá)特性

為了解水稻Histone3同源基因的表達(dá)特性，利用特早熟粳稻品種“秀水03”的根、莖、葉和穗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析Histone3同源基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，8個(gè)Histone3同源基因均檢測到轉(zhuǎn)錄本（見圖2）。其中組2的LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在根、莖、葉和穗中組成型表達(dá)，F(xiàn)PKM（Fragments Per Kilobase per Million）值均在200以上;而LOC_Os02g25910在根、葉和穗中表達(dá)量極低，在莖中相對高表達(dá)。在組1中LOC_ Os11g05730、LOC_ Os06g06510和LOC_ Os04g34240表達(dá)特征相似，LOC_Os11g05730和LOC_Os06g06510在幼根和葉中表達(dá)相對較高，LOC_Os04g34240在幼根中表達(dá)相對較高。組3的LOC_Os12g22680在果穗中高表達(dá)，在其他部位表達(dá)量極低。組4的LOC_ Os05g41080在幼根和莖中相對高表達(dá)。這些數(shù)據(jù)初步表明“秀水03”中Histone3同源基因表達(dá)水平差異較大，部分Histone3同源基因存在組織表達(dá)特異性。

2.3 “日本晴”中Histone3同源基因表達(dá)特性

利用RGAP數(shù)據(jù)庫[12]（The MSU Rice Genome Annotation Project Database and Resource， http：//rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml）分析水稻Histone3同源基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明，在“日本晴”中，組2的LOC_Os06g04030和LOC_Os03g27310在不同發(fā)育時(shí)期的芽、葉、胚、種子、果穗、花粉囊、雌蕊等部位組成型高表達(dá)（見圖3A），其中LOC_Os06g04030在雌蕊中的FPKM值高達(dá)934;而LOC_Os02g25910在各組織器官表達(dá)量較低，在花粉囊中相對高表達(dá)（圖3B）;組1的LOC_Os11g05730、LOC_Os06g06510和LOC_Os04g34240表達(dá)特征相似，在不同發(fā)育時(shí)期的果穗、雌蕊、芽、種子（5DPA）和胚（25DPA）等部位高表達(dá);組3的LOC_Os12g22680在種子（5DPA）中表達(dá)量相對較高;組4的LOC_Os05g41080在雌蕊和果穗中表達(dá)量相對較高（圖3B）。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明，水稻Histone3同源基因的表達(dá)水平差異較大，部分Histone3同源基因在雌蕊、花粉囊和種子（5DPA）等部位特異表達(dá)。

[4] Wang C， Ding Y， Yao J， et al. Arabidopsis Elongator subunit 2 positively contributes to resistance to the necrotrophic fungal pathogens Botrytis cinerea and Alternaria brassicicola[J]. Plant Journal， 2015， 83（6）：1019-1033.

[5] Alvarez-Venegas R， Avramova Z. Methylation patterns of histone H3 Lys 4， Lys 9 and Lys 27 in transcriptionally active and inactive Arabidopsis genes and in atx1 mutants[J]. Nucleic Acids Research， 2005， 33（16）： 5199-5207.

[6] Alexandre B， Emily J M， Abdelmalek A， et al. Arabidopsis histone methyltransferase SET DOMAIN GROUP8 mediates induction of the jasmonate/ethylene pathway genes in plant defense response to necrotrophic fungi[J]. Plant physiology， 2010， 154（3）： 1403-1414.

[7] Sanghun L， Fuyou F， Siming X， et al. Global regulation of plant immunity by histone lysine methyl transferases[J]. Plant Cell， 2016， 28： 1640-1661.

[8] Wang C， Yang Q， Wang W， et al. A transposon-directed epigenetic change in ZmCCT underlies quantitative resistance to Gibberella stalk rot in maize[J]. New Phytologist， 2017， 215（4）： 1503-1515.

[9] Hou Y X， Wang L Y， Wang L， et al. JMJ704 positively regulates rice defense response against Xanthomonas oryzae pv. oryzae infection via reducing H3K4me2/3 associated with negative disease resistance regulators[J]. BMC Plant Biology， 2015， 15：286.

[10] Hu M， Pei L B， Zhang L F， et al. Histone H2B monoubiquitination is involved in regulating the dynamics of microtubules during the defense response to Verticillium dahliae toxins in Arabidopsis[J]. Plant physiology， 2014， 164（4）： 1857-1865

[11] Zhou C， Zhao Y， Zhou S L， et al. Progresses and perspectives of crop epigenome research （in Chinese）[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences （生命科學(xué)） ， 2016， 28（10）： 1138-1145.

[12] Kawahara Y， de la Bastide M， Hamilton J P， et al. Improvement of the Oryza sativa Nipponbare reference genome using next generation sequence and optical map data[J]. Rice， 2013， 6：4.

[13] Magali L， Patrice D， Gert T， et al. PlantCARE， a database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J]. Nucleic Acids Research， 2002， 30（1）： 325-327.

（責(zé)任編輯：丁志祥）