人5型腺病毒結(jié)合抗體檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

王玉東，趙拯浩，宋小紅，陳旖，王步森，吳詩坡，侯利華

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

腺病毒是一種無包膜的雙鏈DNA 病毒，基因長(zhǎng)度為34～43 kb，直徑70～90 nm，相對(duì)分子質(zhì)量約2×108[1]。迄今已記錄了90 多種人腺病毒血清型，并根據(jù)其血清學(xué)和分子特征分為7 個(gè)亞屬（A～G）[2-3]。腺病毒主要引起人呼吸道、胃腸道、眼睛、膀胱等部位感染[4-5]。近年來，隨著免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展和相互交叉滲透，腺病毒在基因和分子治療上的應(yīng)用越來越廣泛。由于可實(shí)現(xiàn)高水平的外源基因表達(dá)、安全性高、可快速激發(fā)高效的特異性免疫反應(yīng)、易于改構(gòu)、便于大規(guī)模制備等優(yōu)點(diǎn)，重組腺病毒載體己被廣泛用于疫苗研制[6]。目前重組腺病毒載體已用于研發(fā)多種傳染病疫苗，如埃博拉病毒、馬爾堡病毒、人類乳頭瘤病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、狂犬病毒、流感病毒和瘧原蟲疫苗等[7]。與其他重組載體相比，人5 型腺病毒（human adenovirus type 5，HAdv5）載體的優(yōu)勢(shì)在于高重組病毒產(chǎn)量、安全性好，以及在廣泛的真核細(xì)胞中均能實(shí)現(xiàn)較高的外源基因表達(dá)水平[8-9]，并且可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)[10-11]。

目前，血清中腺病毒抗體的檢測(cè)方法大多是檢測(cè)中和抗體，主要有2 種方法。一種是細(xì)胞病變法，檢測(cè)步驟是將滅活血清與腺病毒孵育后感染細(xì)胞，用顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)腺病毒介導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）[12]。這種方法用時(shí)較長(zhǎng)，一般需要4～8 d，對(duì)病變情況的觀察具有一定的主觀性，且靈敏度較低。另一種方法是報(bào)告基因法，血清中的中和抗體能夠抑制病毒感染從而降低報(bào)告基因在感染細(xì)胞中的表達(dá)水平，通過檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)被抑制的程度來確定中和抗體水平。常用的報(bào)告基因有LacZ、GFP 和螢光素酶基因等[13]。相比于細(xì)胞病變法，報(bào)告基因法有用時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、評(píng)判指標(biāo)客觀、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。然而，無論是細(xì)胞病變法還是報(bào)告基因法，腺病毒中和抗體檢測(cè)方法存在耗時(shí)較長(zhǎng)、血清用量較大、對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求較高、實(shí)驗(yàn)成本高等問題。因此，建立一種靈敏、快速、穩(wěn)定的HAdv5 抗體檢測(cè)方法具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究在制備HAdv5-Hexon 蛋白的基礎(chǔ)上，建立了HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)的ELISA 法，可用于SPF 級(jí)動(dòng)物模型HAdv5 載體結(jié)合抗體滴度檢測(cè)，為HAdv5 載體疫苗的小動(dòng)物模型評(píng)價(jià)提供了一種簡(jiǎn)單快捷的針對(duì)載體的抗體檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

293 F 細(xì)胞由本室保存；重組腺病毒以及用于檢測(cè)方法建立和驗(yàn)證的小鼠血清為研究室自備；293F 培養(yǎng)基、BCA 法檢測(cè)試劑盒和蛋白marker 購自Thermo Scientific 公司；核酸酶和牛血清白蛋白購自Sigma 公司；HAdv5-Hexon 蛋白和HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 抗體購自Abcam 公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和青鏈霉素雙抗購自Gibco 公司；螢光素酶檢測(cè)底物和細(xì)胞裂解液購自Promega公司；SDS-PAGE 蛋白膠購自金斯瑞生物科技有限公司；脫脂奶粉購自BD 公司；化學(xué)發(fā)光液購自Millipore 公司；ELISA 顯色液購自Solarbio 公司；Source 30Q 和Sepharose 4FF 層析柱購自GE 公司；TSK-GEL G3000SWXL 柱購自Tosoh 公司；96孔酶標(biāo)板和96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板購自Corning 公司。

1.2 HAdv5 抗原的表達(dá)與純化

將復(fù)制缺陷型HAdv5 以5～10 MOI 感染293F細(xì)胞，于36.5℃、5% CO2搖床120 r/min 搖動(dòng)培養(yǎng)3～5 d，從感染后第2 d 起每天檢測(cè)細(xì)胞活率，當(dāng)細(xì)胞活率下降至40%以下時(shí)收獲細(xì)胞培養(yǎng)液。將細(xì)胞培養(yǎng)液于-70℃反復(fù)凍融3 次，8000 r/min離心30 min，取上清，加入核酸酶至終濃度10 U/mL，37℃孵育1 h，0.45 μm 濾膜抽濾去除雜質(zhì)。用AKTA Purifier 純化儀對(duì)HAdv5 抗原蛋白進(jìn)行Source 30Q 和Sepharose 4FF 兩步層析純化。對(duì)于Source 30Q 層析，層析柱用平衡緩沖液（20 mmol/L Tris，150 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH7.5）平衡后A 泵上樣，上樣結(jié)束后再次平衡至UV 基線，5 mL/min，60 min，0～20% B 梯度洗脫，分管收集洗脫峰，最后100% B 直接洗脫（B 液為20 mmol/L Tris、2 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2，pH7.5）。用Sepharose 4FF 對(duì)HAdv5 抗原蛋白進(jìn)一步純化，流動(dòng)相為0.1 mol/L PBS，流速5 mL/min，限壓0.3 MPa，收集外水體積峰。將收集到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE，合并蛋白條帶一致的樣品，用30 kDa 超濾管濃縮，BCA 法檢測(cè)樣品濃度。

1.3 HAdv5 抗原的鑒定

分別采用HPLC、SDS-PAGE 和Western 印跡鑒定純化的HAdv5 抗原，檢測(cè)對(duì)象為HAdv5 抗原蛋白、復(fù)制缺陷型HAdv5 病毒和市售的HAdv5-Hexon。HPLC 色譜柱為TSK-GEL G3000SWXL，流動(dòng)相為250 mmol/L PBS（Na2HPO454.65 g、NaH2PO415.25 g、NaCl 8.5 g 溶于1 L 去離子水，pH6.8，0.22 μm 濾膜抽濾），室溫，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。SDSPAGE 使用12% PAGE 膠，每孔上樣20 μL，170 V 恒壓電泳約1 h，用金斯瑞eBLOT L1 蛋白染色儀對(duì)凝膠進(jìn)行染色和脫色。Western 印跡檢測(cè)一抗為HAdv5 免疫小鼠血清。用12% PAGE 膠完成SDS-PAGE 之后，將凝膠上的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（1∶5000 稀釋）室溫孵育2 h，洗膜4 次，二抗（HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體，1∶20 000 稀釋）溫室孵育1 h，洗膜4 次，用化學(xué)發(fā)光液顯色3～5 min，于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上成像。

1.4 ELISA 檢測(cè)方法的建立

實(shí)驗(yàn)前1 d，將HAdv5-Hexon 蛋白以適當(dāng)?shù)臐舛劝挥?6 孔酶標(biāo)板中，4℃過夜（12～24 h）。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將酶標(biāo)板從冰箱取出，用洗液（PBS+0.2%吐溫20）洗板3 次，2% BSA 于37℃封閉1 h；洗板3 次，待測(cè)血清以適當(dāng)?shù)某跏枷♂尪扔诿笜?biāo)板內(nèi)進(jìn)行1∶3 梯度稀釋，根據(jù)具體情況設(shè)定8～12個(gè)稀釋度，酶標(biāo)板于37℃孵育1 h；洗板5 次，每孔加入1∶10 000 稀釋的HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 抗體100 μL，37℃孵育1 h；洗板5 次，每孔加入TMB 單組分顯色液100 μL，室溫避光顯色8～10 min，每孔加入50 μL 終止液終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀上讀取D450nm值。每板設(shè)定4～8 個(gè)不加血清樣品的空白對(duì)照孔，以空白對(duì)照孔D450nm平均值的2.1 倍作為Cut-off 值，用GraphPad Prism 軟件計(jì)算血清樣品的抗體滴度。在ELISA 檢測(cè)方法建立過程中，分別對(duì)包被緩沖液、封閉液、HAdv5-Hexon蛋白包被濃度和二抗工作濃度進(jìn)行最優(yōu)化篩選。

1.5 ELISA 檢測(cè)方法的驗(yàn)證

開展了特異性和重復(fù)性驗(yàn)證，并分析結(jié)合抗體滴度與中和抗體滴度的相關(guān)性。重復(fù)性驗(yàn)證包括板內(nèi)重復(fù)、板間重復(fù)和日間重復(fù)，用以驗(yàn)證檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。特異性驗(yàn)證檢測(cè)了不同血清樣品在本檢測(cè)方法中的反應(yīng)情況，包括HAdv5陽性樣品、HAdv5 陰性樣品、其他型別腺病毒陽性樣品和其他病毒陽性樣品，用以驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性反應(yīng)情況。相關(guān)性驗(yàn)證采用螢光素酶法檢測(cè)HAdv5 陽性血清的中和抗體滴度[14]，將ELISA 法檢測(cè)的結(jié)合抗體滴度與對(duì)應(yīng)樣品的中和抗體滴度進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.6 HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)方法的應(yīng)用

用本研究建立的HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)ELISA法檢測(cè)了重組埃博拉病毒病疫苗（Ad5-EBOV）免疫小鼠血清中HAdv5 的IgG 水平。Ad5-EBOV 免疫劑量分別為每只小鼠106和107IFU，血清樣品為首次免疫后0、2、4、6、8、10、12、16 周和加強(qiáng)免疫后2、4、10 周。計(jì)算HAdv5 結(jié)合抗體滴度并對(duì)抗體滴度隨時(shí)間變化進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行制圖和數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.5～1 時(shí)具有強(qiáng)相關(guān)性。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HAdv5-Hexon 的表達(dá)、純化與鑒定

將293F 細(xì)胞稀釋至1×106/mL，調(diào)整體積至每瓶1 L。HAdv5 以5 MOI 感染293F 細(xì)胞，于5%CO2、36.5℃搖床120 r/min 搖動(dòng)培養(yǎng)約72 h，至細(xì)胞活率低于40%，收獲細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)Source 30Q和Sepharose 4FF 兩步柱層析，獲得HAdv5 抗原蛋白。Source 30Q 純化峰圖如圖1A，用高鹽進(jìn)行梯度洗脫，出現(xiàn)2 個(gè)洗脫峰。第1 個(gè)峰的出峰電導(dǎo)值為31.9 mS/cm，第2 個(gè)峰的出峰電導(dǎo)值為40.2 mS/cm。根據(jù)以往經(jīng)驗(yàn)，第2 個(gè)峰為HAdv5 病毒。SDS-PAGE 結(jié)果顯示第1 個(gè)峰中含有大量蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為120×103（結(jié)果未示），推測(cè)其主要成分為腺病毒Hexon 蛋白。用Sepharose 4FF 對(duì)第1 個(gè)峰的蛋白進(jìn)行進(jìn)一步純化，峰圖如圖1B，經(jīng)純化除去了該峰中存在的少量HAdv5 病毒，獲得更純的HAdv5 抗原蛋白樣品。

鑒于純化獲得的HAdv5 抗原蛋白與腺病毒Hexon 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量相當(dāng)，我們將其與市售的HAdv5-Hexon 進(jìn)行比較分析，同時(shí)以HAdv5 病毒作為對(duì)照。HPLC 結(jié)果顯示，純化的HAdv5 抗原蛋白與市售的HAdv5-Hexon 具有完全一致的保留時(shí)間，兩者保留時(shí)間與HAdv5 病毒不同（圖1C）。HAdv5 抗原蛋白對(duì)應(yīng)峰圖主峰面積占96.7%，市售HAdv5-Hexon 對(duì)應(yīng)峰圖主峰面積占98.5%。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，純化的HAdv5 抗原蛋白、市售的HAdv5-Hexon 和HAdv5 病毒具有相對(duì)分子質(zhì)量大小相同的主帶，為100×103～130×103，不同之處是HAdv5 病毒在相對(duì)分子質(zhì)量約25×103處有一條明顯的條帶（圖1D）。Western 印跡結(jié)果顯示純化的HAdv5 抗原蛋白、市售的HAdv5-Hexon 和HAdv5 病毒在相對(duì)分子質(zhì)量為100×103～130×103處均具有特異性條帶（圖1E）。這些結(jié)果表明，純化獲得的HAdv5 抗原蛋白其主要成分是HAdv5 的Hexon 蛋白。

圖1 HAdv5 抗原蛋白的純化和鑒定

2.2 HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)方法的建立和優(yōu)化

以純化的HAdv5-Hexon 蛋白為抗原，建立HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)ELISA 法，并對(duì)包被緩沖液和封閉液進(jìn)行篩選，對(duì)抗原包被濃度和二抗工作濃度進(jìn)行驗(yàn)證。

分別檢測(cè)了碳酸鹽緩沖液（Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，去離子水定容至1 L，pH9.6）、磷酸鹽緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液（Tris Base 24.2 g，NaCl 80 g，濃鹽酸調(diào)節(jié)pH 值為7.6，去離子水定容至1 L）作為包被液的檢測(cè)效果。結(jié)果如表1，以碳酸鹽緩沖液作為包被液時(shí)陽性血清樣品與陰性血清樣品的D450nm比值（P/N 值）最大。確定以碳酸鹽緩沖液作為本檢測(cè)方法的包被緩沖液。

分別檢測(cè)了以1%、2%、5% BSA 和5%脫脂奶粉作為封閉液時(shí)的檢測(cè)效果，結(jié)果如表2，以2%BSA 封閉，其檢測(cè)結(jié)果的P/N 值最大。確定2%BSA 作為本檢測(cè)方法的封閉液。

檢測(cè)不同抗原包被濃度（8、4、2、1、0.5、0.25、0.12、0.06 和0.03 μg/mL）對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如圖2。在不同血清稀釋率情況下，抗原包被濃度＜2 μg/mL 時(shí)，D450nm值隨抗原包被濃度的降低而下降；當(dāng)抗原包被濃度≥2 μg/mL 時(shí)，D450nm值達(dá)到飽和。確定抗原包被濃度為2 μg/mL。

根據(jù)說明書推薦的HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗工作濃度范圍，分別驗(yàn)證了1∶10 000、1∶20 000 和1∶50 000 等3 個(gè)工作濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果如表3，在1∶10 000 的工作濃度條件下，檢測(cè)結(jié)果P/N 值最大，確定1∶10 000 為本檢測(cè)HRP 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 二抗工作濃度。

圖2 抗原包被濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

2.3 HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)方法的驗(yàn)證

分別對(duì)該檢測(cè)方法的特異性和重復(fù)性進(jìn)行驗(yàn)證，并分析由該檢測(cè)方法獲得的結(jié)合抗體滴度與HAdv5 中和抗體之間的相關(guān)性。

重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果見表4～6。板內(nèi)重復(fù)性變異系數(shù)（CV）為1.6%～9.3%，板間重復(fù)性CV 為4.0%～13.2%，日間重復(fù)性CV 為2.8%～13.4%。這些結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性。

表1 不同包被緩沖液條件下陽性血清和陰性血清的D450nm值（x±s）

表2 不同封閉液條件下陽性血清和陰性血清的D450nm值（x±s）

表3 不同二抗工作濃度條件下陽性血清和陰性血清的D450nm值（x±s）

表4 板內(nèi)重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

表5 板間重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

表6 日間重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

特異性驗(yàn)證分別檢測(cè)了HAdv5 陽性小鼠血清樣品、HAdv5 陰性小鼠血清樣品（NC）、人4 型腺病毒（HAdv4）陽性小鼠血清樣品、人7 型腺病毒（HAdv7）陽性小鼠血清樣品和水皰性口炎病毒（VSV）陽性小鼠血清樣品在該檢測(cè)方法中的反應(yīng)情況。檢測(cè)結(jié)果如圖3A，HAdv5 陽性小鼠血清樣品具有很高的反應(yīng)水平，而HAdv5 陰性小鼠血清樣品和VSV 陽性小鼠血清樣品則無反應(yīng)。值得注意的是，HAdv4 陽性小鼠血清樣品和HAdv7 陽性小鼠血清樣品在本檢測(cè)中也具有一定的反應(yīng)水平。結(jié)果說明該檢測(cè)方法對(duì)非腺病毒病原體感染血清樣品具有良好的特異性，而對(duì)其他亞型的腺病毒陽性樣品具有一定水平的交叉反應(yīng)性。

用相同的小鼠血清樣品分別檢測(cè)了HAdv5結(jié)合抗體滴度和中和抗體滴度，并對(duì)兩者進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果如圖3B，用Spearman 相關(guān)性分析，P=0.0056，r=0.7363。結(jié)果表明HAdv5 結(jié)合抗體與HAdv5 中和抗體檢測(cè)結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性。

2.4 HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)方法的應(yīng)用

圖3 HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)方法驗(yàn)證

將本檢測(cè)方法應(yīng)用于Ad5-EBOV 免疫小鼠血清的HAdv5 IgG 抗體水平檢測(cè)。Ad5-EBOV 分別以106或107IFU 的免疫劑量肌肉注射免疫BALB/c 小鼠（n=6），16 周后進(jìn)行等劑量加強(qiáng)免疫。不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平如圖4。免疫前所有小鼠血清呈HAdv5 IgG 抗體陰性。初次免疫后107IFU 劑量組血清HAdv5 IgG 抗體水平呈逐漸升高的趨勢(shì)，至免疫后10 周達(dá)到高峰；106IFU 劑量組血清HAdv5 IgG 抗體水平很低，平均抗體滴度在100 左右。加強(qiáng)免疫后高低劑量組小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平均迅速升高，于加強(qiáng)免疫后2～4 周達(dá)到峰值。同時(shí)也可以看到，小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。

3 討論

特異性抗體檢測(cè)在臨床診斷、預(yù)防接種效果觀察以及傳染病流行病調(diào)查中具有重要意義。腺病毒有多種不同血清型，亞型之間病毒表面抗原同源性較高，結(jié)合抗體檢測(cè)在型別之間的交叉反應(yīng)性較強(qiáng)，一般情況下采用中和抗體方法檢測(cè)針對(duì)某亞型腺病毒的血清抗體水平。通常小動(dòng)物模型上的疫苗免疫學(xué)評(píng)價(jià)所涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為SPF 級(jí)，腺病毒感染陰性。因此，在SPF 級(jí)動(dòng)物模型上的腺病毒抗體檢測(cè)不涉及自然感染腺病毒而導(dǎo)致的交叉反應(yīng)的問題，可以使用結(jié)合抗體檢測(cè)方法來檢測(cè)某亞型腺病毒的抗體水平，達(dá)到快速、高效的要求。在本研究中，我們表達(dá)純化獲得了純度大于95%的HAdv5-Hexon 蛋白，并以此為包被抗原建立了操作簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好的HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)ELISA 法。

雖然中和抗體檢測(cè)是腺病毒抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但也存在著一些不方便的操作因素。中和抗體檢測(cè)需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，檢測(cè)成本高，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境要求高。相比之下，ELISA 檢測(cè)結(jié)合抗體的檢測(cè)時(shí)間短，方法簡(jiǎn)單，成本較低，可在普通實(shí)驗(yàn)環(huán)境中開展。此外，ELISA 法具有更高的靈敏性。我們?cè)谶M(jìn)行結(jié)合抗體滴度和中和抗體滴度相關(guān)性分析時(shí)，所檢測(cè)的13 份小鼠血清樣品中，其結(jié)合抗體滴度的幾何平均值約為中和抗體滴度幾何平均值的500 倍（結(jié)果未示）。這一結(jié)果說明結(jié)合抗體檢測(cè)的靈敏度更高，一些中和抗體檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣品很有可能具有較高的結(jié)合抗體水平。

圖4 Ad5-EBOV 免疫后不同時(shí)間小鼠血清HAdv5 IgG 抗體水平

關(guān)于腺病毒結(jié)合抗體檢測(cè)，羅思思等利用大腸桿菌表達(dá)4 型禽腺病毒Hexon 蛋白，并以此建立了檢測(cè)4 型禽腺病毒抗體的ELISA 方法[15]，但HAdv5 結(jié)合抗體檢測(cè)的相關(guān)方法還未見報(bào)道。我們表達(dá)純化獲得了高純度的HAdv5-Hexon，建立了適用于SPF 級(jí)動(dòng)物血清樣品的HAdv5 抗體檢測(cè)ELISA 法。該方法檢測(cè)成本較低、操作簡(jiǎn)單、快捷、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可用于以HAdv5 為載體的病原體疫苗小動(dòng)物模型免疫學(xué)評(píng)價(jià)，同時(shí)也可為其他型別腺病毒結(jié)合抗體檢測(cè)方法的建立提供思路。