重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白10的表達(dá)純化及其心臟保護(hù)功能

王若璋, 金 堅(jiān)

(江南大學(xué) 藥學(xué)院, 江蘇 無錫, 214122)

2003年的流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)結(jié)果[1-3]顯示，中國成人(35～74歲)的心力衰竭(心衰)患病率約為0.9%, 已成為65歲以上患病人群住院的首要原因。病毒性心肌炎、高血壓、缺血性心臟病、使用具有心臟毒性的藥物等因素均可導(dǎo)致心衰的發(fā)生。心衰的病理進(jìn)展包括心肌細(xì)胞的死亡、成纖維細(xì)胞的募集和細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，最終可導(dǎo)致心臟功能的嚴(yán)重?fù)p傷[4-7]。目前研究[4-5, 8]認(rèn)為，心肌細(xì)胞的死亡對(duì)心力衰竭的發(fā)展具有關(guān)鍵的影響。采取措施預(yù)防或拮抗心肌細(xì)胞死亡是阻止或減慢心力衰竭進(jìn)展的關(guān)鍵。

多柔比星(DOX)是一種經(jīng)典的蒽環(huán)類抗腫瘤化療藥物，可用于治療實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)腫瘤[6]。20世紀(jì)60年代，隨著蒽環(huán)類抗生素在腫瘤臨床治療中的使用，人們第一次意識(shí)到化療過程可能對(duì)心臟功能產(chǎn)生影響[9-11]。DOX介導(dǎo)的心臟毒性的機(jī)制被認(rèn)為主要與自由基產(chǎn)生、線粒體功能障礙、DNA損傷和肌原纖維變性等因素有關(guān)[12]。DOX的使用可引起充血性心力衰竭、左室射血分?jǐn)?shù)的下降、高血壓、心律失常、QTC期延長(zhǎng)以及心肌缺血等現(xiàn)象，造成可逆或不可逆的心臟損傷[13]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白10(BMP10)是一種腫瘤壞死因子-β(TGF-β)超家族的分泌型細(xì)胞外信號(hào)多肽，在哺乳動(dòng)物胚胎心臟發(fā)育過程中起到關(guān)鍵作用[14-16]。BMP10的表達(dá)可以在特定的心臟病理情況下被重新激活[16]。為了研究BMP10在成年動(dòng)物心臟中的作用，作者前期研究構(gòu)建了條件型轉(zhuǎn)基因小鼠模型，發(fā)現(xiàn)BMP10在成年動(dòng)物心臟中的過表達(dá)可以有效降低β-腎上腺素類似物長(zhǎng)期過度刺激引起的心肌細(xì)胞死亡，并保護(hù)受損心臟。此外，BMP10通過旁分泌的方式來發(fā)揮其作用，這一特性賦予了其全身給藥的能力。

在這項(xiàng)研究中，作者制備了一種關(guān)鍵的心源性生長(zhǎng)因子BMP10, 并測(cè)試其是否可以減輕由DOX誘導(dǎo)的心臟損傷。作者研究證明，在注射DOX后，與使用生理鹽水處理的野生型小鼠相比, BMP10處理小鼠具有更好的心臟功能，證明BMP10可以有效地保護(hù)心臟免受DOX介導(dǎo)的心臟毒性影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

CHO-S細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室留存細(xì)胞株, C2C12細(xì)胞株購自ATCC。高保真酶, Takara; DMEM/F12培養(yǎng)基，胎牛血清, G418, DMEM等, Gibco; M2/M4 CHO無血清培養(yǎng)基, Feed4補(bǔ)料培養(yǎng)基，蘇州康聚生物有限公司; anti-BMP10 antibody, R&D; Dual luciferase reporter assay system, Promega。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建: 通過融合PCR的方法除去重組人BMP10(rhBMP10) cDNA序列中的EcoRI識(shí)別位點(diǎn)(GAATTC), 突變后的序列為GAGTTC, 不影響其編碼的氨基酸序列和翻譯效率。修改后的cDNA被EcoRI和Not I酶切，并使用T4連接酶插入到pMH3質(zhì)粒中。融合PCR所使用的引物和PCR程序見表1。

1.2.2 CHO-BMP10細(xì)胞株構(gòu)建: 取懸浮培養(yǎng)的狀態(tài)良好的CHO-S細(xì)胞，計(jì)數(shù)，取約3.0×106cells/mL細(xì)胞，離心，用200 μL PBS重懸，加入40 μg質(zhì)粒和10 μg Salmon sperm混勻，將電轉(zhuǎn)體系加入預(yù)冷的2 mm電擊杯中，置冰上5 min, 160 V, 15 ms電擊共3次。取2個(gè)100 mm dish, 分別加入10 mL D/F完全培養(yǎng)基，將電擊后的體系均勻分至2個(gè)dish中，置于濕式二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)(37 ℃, 5% CO2)。

表1 融合PCR引物

CHO-S轉(zhuǎn)染第2天，換液，加入終濃度為4.5 mg/mL的G418進(jìn)行壓力篩選，靜置培養(yǎng)約10 d。取96孔板，每孔加入200 μL D/F完全培養(yǎng)基。取壓力篩選后，生長(zhǎng)出克隆的dish, 用10 μL tip挑取克隆，并轉(zhuǎn)移至96孔板中。約1周后，鏡檢可觀察到明顯克隆，棄上清，加入100 μL D/F基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 2 d后取上清，Dot blot檢測(cè)BMP10表達(dá)水平，選取高表達(dá)的3個(gè)克隆，使用dish擴(kuò)大培養(yǎng)后，再挑去克隆至96孔板中，重復(fù)上述步驟，共3次。最后，取表達(dá)量最高的1株細(xì)胞，稀釋至約3.5 cells/mL, 每孔200 μL鋪96孔板，選擇單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，命名為CHO-BMP10細(xì)胞系。

1.2.3 CHO-BMP10流加培養(yǎng): 將CHO-BMP10細(xì)胞株懸浮馴化，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的種子接種于250 mL搖瓶中，密度為1.0×106cells/mL, 體積150 mL, 100 轉(zhuǎn)/min, 37 ℃培養(yǎng)。至密度為(5.0～6.0)×106cells/mL時(shí)，將二級(jí)種子接入3 L搖瓶中, 100轉(zhuǎn)/min, 37 ℃培養(yǎng)。根據(jù)生長(zhǎng)情況將培養(yǎng)體積逐漸補(bǔ)充至1.5 L, 停止補(bǔ)加培養(yǎng)基后，待細(xì)胞密度上升至(9.0～10.0)×106cells/mL時(shí)，降溫至34 ℃培養(yǎng)。根據(jù)葡萄糖濃度添加Feed 4補(bǔ)料培養(yǎng)基，維持體系中葡萄糖的濃度在3 g/L左右。至細(xì)胞直徑≥16 μm時(shí)，密切關(guān)注細(xì)胞活率，當(dāng)活率突然下降時(shí)(90%左右)，結(jié)束培養(yǎng)。

1.2.4 純化: 將5 L培養(yǎng)上清8 000轉(zhuǎn)/min離心30 min。用0.22 μm微孔濾膜過濾上清，然后使用Millipore Pellicon超濾系統(tǒng)和10 kDa膜包進(jìn)行緩沖液置換。將體積超濾濃縮至500 mL, 然后加入50 mmol/L苯丁酸鈉(NaPB) 4.5 L , 超濾濃縮至500 mL, 然后再加入50 mmol/L NaPB 4.5 L , 超濾濃縮至500 mL。

將3個(gè)5 mL HiTrap Q HP柱串聯(lián)，接入AKTA avant 25。所使用的流動(dòng)相中, A液為50 mmol/L NaPB, B液為1 mol/L 氯化鈉(NaCl), 系統(tǒng)流速為1 mL/min。用A液沖平UV280, 調(diào)零后上樣，然后用A液淋洗，直至沖平UV280, 用25% B液洗脫并收集洗脫峰。

用10 kDa超濾管將Q柱純化產(chǎn)物濃縮。Loop環(huán)上樣至采用50 mmol/L NaPB+150 mmol/L NaCl平衡過的Superdex 200 10/300色譜柱上，并收集洗脫峰。所使用的流動(dòng)相為50 mmol/L NaPB+150 mmol/L NaCl, 系統(tǒng)流速為0.5 mL/min。

1.2.5 蛋白電泳: CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清或純化后的蛋白，適當(dāng)稀釋后，加入不含還原劑的5× Loading Buffer, 常規(guī)制樣，并使用4%～20%梯度膠板進(jìn)行電泳。根據(jù)需要進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或Western blot。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告檢測(cè): 取C2C12細(xì)胞鋪24孔板，每孔7×104cells。培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)染pGL6質(zhì)粒, 6 h后換液，每孔加入適當(dāng)稀釋的BMP10標(biāo)準(zhǔn)品或樣品，培養(yǎng)12 h, 用PBS洗滌1次，棄上清，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 動(dòng)物模型構(gòu)建: 70只雄性健康C57BL/6J小鼠被隨機(jī)分為4組，其中2組為每組15只(Saline組, rhBMP10組)，其他2組為每組20只(DOX組, DOX +rhBMP10組)。在實(shí)驗(yàn)開始前3 d, Saline組、DOX組每天注射PBS 200 μL; rhBMP10組、DOX+rhBMP10組每天注射200 μL rhBMP10 (2 μg), 直至第5周結(jié)束。Saline組、rhBMP10組每周注射1次PBS，共5次; DOX組、DOX+rhBMP10組每周注射1次DOX(5 mg/kg), 共5次[17]。第5周結(jié)束后，每組隨機(jī)選取4只動(dòng)物檢測(cè)超聲心動(dòng)圖; 隨后處死動(dòng)物，分離血清檢測(cè)血清心肌肌鈣蛋白和肌紅蛋白水平; 取心臟組織切片并使用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平。

1.2.8 超聲心動(dòng)圖: 采用Visual Sonics公司的Vevo 2100小動(dòng)物超聲系統(tǒng)，在第5周實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)。使用Vaporizer霧化罐，將小鼠置于密閉透明亞克力箱中，使其吸入異氟烷麻醉，在小鼠左胸涂抹適量脫毛膏，稍等片刻后用濕棉球擦去毛發(fā)。采用仰臥位將小鼠固定至恒溫手術(shù)臺(tái)，套上異氟烷呼吸面罩。固定四肢以采集心電及呼吸信號(hào)，待心率穩(wěn)定后在左胸涂抹耦合劑，接入探頭采集數(shù)據(jù)。選取短軸切面進(jìn)行采集。自B mode超聲心動(dòng)圖中截取M mode超聲，并以此為基礎(chǔ)計(jì)算短軸縮短率(FS)。

1.2.9 TUNEL: 取小鼠心臟組織，常規(guī)脫水包埋，并切片。常規(guī)脫蠟至水，用索萊寶TUNEL試劑進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CHO-BMP10細(xì)胞株的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pMH3質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染至CHO-S空細(xì)胞，并加入終濃度為4.5 mg/mL的G418壓力篩選。約10 d后，可在dish底部觀察到肉眼可見的白色半透明細(xì)胞克隆。將克隆挑至96孔板并培養(yǎng)至圓形克隆長(zhǎng)出后，換用D/F基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d, 并用Dot blot檢測(cè)上清中rhBMP10的表達(dá)水平。第1次克隆檢測(cè)中(圖1A), 背景較深，一方面說明rhBMP10的表達(dá)水平較低，另一方面說明單孔中的細(xì)胞為非單一來源細(xì)胞，有一定比例的細(xì)胞不能表達(dá)rhBMP10。第2次克隆中(圖1B), rhBMP10的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)。選取第2次克隆中表達(dá)最高的3個(gè)孔，將細(xì)胞消化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，用有限稀釋法接種至96孔板，待克隆長(zhǎng)出后再次進(jìn)行Dot blot檢測(cè)(圖1C)。選取表達(dá)量最高的孔，擴(kuò)大至24孔板培養(yǎng)并再次檢測(cè)，將表達(dá)量最高的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，得到穩(wěn)定表達(dá)rhBMP10的CHO-S工程細(xì)胞株CHO-BMP10。

2.2 rhBMP10的流加培養(yǎng)

細(xì)胞在0～3 d呈現(xiàn)快速增長(zhǎng)狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，細(xì)胞增殖旺盛，存活率高且細(xì)胞直徑小。在4 d開始進(jìn)行補(bǔ)料，同時(shí)將培養(yǎng)溫度下調(diào)至34 ℃, 以延長(zhǎng)平臺(tái)期，維持細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)狀態(tài)。由于養(yǎng)分的消耗和空間的擠占，細(xì)胞生長(zhǎng)速度下降，活率也緩慢下降，最終在8 d達(dá)到最大密度(9.1×106cells/mL)。從第3天開始，細(xì)胞直徑逐步增大，到第9天達(dá)到16.4 μm, 提示細(xì)胞衰老，同時(shí)存活率下降至94.0%, 故選擇在第10天結(jié)束培養(yǎng)。見圖2。

取樣進(jìn)行Western blot, 由圖3可以看出, rhBMP10隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加逐步積累，同時(shí)呈現(xiàn)多條帶的特征。其中116 kDa的條帶在1～2 d較少，隨后逐漸增多; 68 kDa和55 kDa的條帶則在3 d開始積累，而位于26 kDa的成熟rhBMP10生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域二聚體則在7 d開始出現(xiàn)，表明CHO表達(dá)體系缺乏相關(guān)的酶切體系，不足以處理rhBMP10中存在的RIRR↓316酶切位點(diǎn)。

A: 第1次克隆篩選結(jié)果; B: 第2次克隆篩選結(jié)果; C: 單克隆化后的表達(dá)情況圖1 rhBMP10表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建免疫印跡圖

A: 細(xì)胞存活率; B: 細(xì)胞密度; C: 細(xì)胞直徑圖2 CHO-BMP10細(xì)胞株在3 L搖瓶流加培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)情況

圖3 CHO-BMP10細(xì)胞株在3 L搖瓶流加培養(yǎng)過程中的產(chǎn)物累積情況(Western blot)

對(duì)結(jié)束培養(yǎng)時(shí)的表達(dá)上清進(jìn)行ELISA定量分析，結(jié)束培養(yǎng)時(shí)的rhBMP10產(chǎn)量為35.3 mg/L。

2.3 rhBMP10的純化

本研究分別使用Q柱和分子篩對(duì)所表達(dá)的rhBMP10進(jìn)行了純化。Q柱純化中，洗脫峰的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果呈現(xiàn)多條帶的特征，主要包括116 kDa、68 kDa、43 kDa、26 kDa這4個(gè)條帶。在分子篩純化中，上述4個(gè)條帶亦未被分離。對(duì)純化后的表達(dá)上清進(jìn)行ELISA定量分析，獲得的純化rhBMP10純度≥95%, 濃度為4.5 mg/mL, 體積為15.3 mL, rhBMP10總產(chǎn)量為68.85 mg, 收率為49.8%。見圖4、5。

2.4 熒光素酶報(bào)告活性檢測(cè)

能夠被BMP家族成員特異性激活的核酸序列被稱為BMP反應(yīng)區(qū)段(BRE)。將BRE序列整合到Minimal TA promoter前，在BMP10的存在下，便可以特異性地啟動(dòng)其下游編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄。作者構(gòu)建了包含BRE元件的pGL6螢火蟲熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，將其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至C2C12細(xì)胞中，并利用這種方法對(duì)BMP10的生物活性進(jìn)行體外檢測(cè)。

在作者構(gòu)建的C2C12報(bào)告細(xì)胞株中，血清會(huì)對(duì)報(bào)告系統(tǒng)造成比較大的影響。培養(yǎng)基中0%、0.1%。1%、2%、5%、10%的胎牛血清(FBS)分別可以導(dǎo)致(1 326±200)、(3 495±270)、(10 692±1 414)、(21 933± 1 615)、(42 816±3 269)、(73 792±4 601)相對(duì)熒光素酶單位(RLU)的非特異性信號(hào)。因此將檢測(cè)過程的培養(yǎng)基血清含量降低至0.1%, 以保證較高的信噪比。

檢測(cè)過程中使用濃度10 ng/mL的rhBMP10來測(cè)定rhBMP10的生物活性。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的空白對(duì)照、加入CHO-S空細(xì)胞培養(yǎng)上清、TGF-β或是PBS的C2C12細(xì)胞幾乎不表達(dá)螢火蟲熒光素酶，其信號(hào)值依次為(22±9)、(2 652±405)、(3 585±297)、(3 315±366) RLU，說明該檢測(cè)系統(tǒng)的特異性較好，噪音值較低。從R&D購買的BMP10 GFD二聚體在10 ng/mL濃度時(shí)的信號(hào)值為(67 640±8 535) RLU。同等濃度下, CHO-BMP10表達(dá)并純化的rhBMP10可以誘導(dǎo)表達(dá)(86 367±2 685) RLU, 證實(shí)CHO-BMP10表達(dá)并純化的rhBMP10具有很好的生物活性。

A: Q柱純化色譜圖(UV280); B: Q柱純化色譜圖(B液比例); C: Gel filtration柱純化運(yùn)行圖譜圖4 rhBMP10的純化結(jié)果圖

A: Q柱純化收集洗脫峰的考馬斯亮藍(lán)染色圖, rhBMP10為含有250 mmol/L NaCl的50 mmol/L NaPB洗脫峰, BMP10(R&D)為從R&D公司購買的對(duì)照品; B: Gel filtration柱純化收集洗脫峰的考馬斯亮藍(lán)染色圖, 1為～12 mL洗脫峰,2為～19 mL洗脫峰。圖5 收集洗脫峰的考馬斯亮藍(lán)染色圖

2.5 超聲心動(dòng)圖

為了評(píng)價(jià)多柔比星對(duì)小鼠心臟收縮和舒張功能的損傷，作者使用經(jīng)胸廓超聲心動(dòng)圖來檢測(cè)小鼠的心功能(n=4)。通過使用超高頻率的超聲探頭，并配合M mode超聲，可以無損地對(duì)小鼠的左室功能進(jìn)行定量分析。與Saline組相比，DOX模型組的小鼠心臟功能出現(xiàn)了明顯下降，其短軸縮短率為(40.4±2.8)%, 較Saline組(58.0±2.8)%出現(xiàn)了顯著下降(P<0.01), 提示多柔比星模型組小鼠心肌的收縮功能受損，心功能下降。在rhBMP10組(52.7±2.9)%和DOX+rhBMP10聯(lián)合給藥組(52.6±4.1)%小鼠的超聲結(jié)果中，小鼠的心臟功能與Saline組相比差異無顯著性。見圖6。

圖6 超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果

2.6 血清心肌損傷標(biāo)志物檢測(cè)

在DOX處理組中，小鼠血清中的心肌肌鈣蛋白I(cTnI)和肌紅蛋白(Mb)水平分別為(138.5±23.8)、(292.2±20.4) ng/mL, 顯著高于Saline組中的(98.8±5.9)、(157.9±19.2) ng/mL和rhBMP10組中的(112.3±5.8)、(150.9±40.3) ng/mL, 提示心肌細(xì)胞受損。而DOX+rhBMP10組小鼠中, cTnI和Mb水平分別為(106.7±8.0)、(175.4±21.8) ng/mL。見表2。

表2 各組血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ、肌紅蛋白水平比較

cTnI: 心肌肌鈣蛋白Ⅰ; Mb: 肌紅蛋白。與DOX組比較, *P<0.05, **P<0.01。

2.7 TUNEL

TUNEL檢測(cè)中, DOX組小鼠的心臟凋亡比例顯著上升(P<0.01), 達(dá)到(0.236±0.082)%, 高于DOX+rhBMP10組(0.038±0.028)%和Saline組(0.011±0.020)%。在rhBMP10對(duì)照組中，心肌細(xì)胞的凋亡比例為(0.022±0.022)%。見圖7。

圖7 TUNEL檢測(cè)結(jié)果圖(標(biāo)尺20 μm)

3 討 論

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)屬于TGF-β超家族。BMP的所有成員在蛋白質(zhì)序列中具有獨(dú)特的同一性，并且具有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但具有不同的組織分布和生物學(xué)功能。在心臟中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)BMP成員的表達(dá)，其中包括BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7和BMP10, 且已被證明參與了心臟發(fā)育的多個(gè)步驟。BMP10的表達(dá)主要存在于心臟[15]。BMP2和BMP4的表達(dá)較為廣泛，并參與心源性誘導(dǎo)和心內(nèi)膜墊形成[15, 18]。

研究[19]顯示, BMP5、BMP6和BMP7在早期心臟發(fā)育中調(diào)節(jié)心室壁和腔室形成。已知BMP10可在某些心臟病發(fā)病條件下重新激活[16], 但BMP10在出生后心臟中的生物學(xué)功能尚不清楚。通常情況下, BMP通過與Ⅰ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合，磷酸化Smad1/5/8蛋白并發(fā)揮其生物學(xué)活性[20-21]。作者的前期研究表明，出生后心臟中BMP10的轉(zhuǎn)基因過表達(dá)顯著降低了心肌細(xì)胞肥大性生長(zhǎng)，同時(shí)不影響運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的心臟肥大和對(duì)β-腎上腺素能激動(dòng)劑異丙腎上腺素的肥大反應(yīng)(即模擬病理性肥大)。這些研究表明BMP10可能是一種心臟保護(hù)試劑。

本研究中，作者制備了具有高生物活性的rhBMP10蛋白，通過高劑量、多次的多柔比星注射構(gòu)建了多柔比星誘導(dǎo)的小鼠心臟病模型，并證明了rhBMP10的使用可以減輕多柔比星引起的心功能下降、心肌細(xì)胞損傷和凋亡。通過分析rhBMP10對(duì)多柔比星介導(dǎo)的心臟毒性的影響，進(jìn)一步證實(shí)了BMP10在心臟保護(hù)方面的積極意義。