TRPM2在H9N2豬流感病毒感染小鼠PMVEC損傷中的表達(dá)與作用*

羅 強(qiáng)， 高晶萍， 梁 亭， 張雅琪， 李珮瑤， 王少華， 李 軍， 張瑞華， 徐 彤， △

(河北北方學(xué)院 1預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 2生命科學(xué)研究中心, 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 河北 張家口 075000)

瞬時(shí)受體電位陽離子通道M2(transient receptor potential cation channel M2,TRPM2)作為氧化應(yīng)激敏感性離子通道在某些疾病致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TRPM2參與腫瘤、炎癥、缺血再灌注損傷以及糖尿病等致病過程[1]。氧化應(yīng)激作用通過TRPM2-PLCγ1-PKCα信號(hào)通路弱化了呼吸道上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的連接功能[2]。此外，肺泡上皮細(xì)胞TRPM2參與博來霉素誘導(dǎo)肺損傷炎癥過程[3]。因此，越來越多的研究表明TRPM2作為細(xì)胞內(nèi)部氧化還原反應(yīng)的傳感器啟動(dòng)氧化應(yīng)激/活性氧類，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增強(qiáng)和凋亡過程，TRPM2可以作為氧化應(yīng)激性疾病潛在的治療靶點(diǎn)[4-5]。

近年來，動(dòng)物源性流感病毒不斷突破種屬屏障并導(dǎo)致人類感染，已成為威脅人類健康的重要病原之一。目前研究顯示流感病毒感染引起肺損傷的主要機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。已有研究指出，氧化應(yīng)激損傷和TLR4在H5N1禽流感病毒誘導(dǎo)急性肺損傷中發(fā)揮重要作用[6]。在研究H9N2豬流感病毒(swine influenza virus, SIV)誘導(dǎo)肺損傷機(jī)制時(shí)，本課題組發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是導(dǎo)致急性肺損傷發(fā)生的重要原因之一[7-8]。鑒于氧化應(yīng)激在流感病毒致病機(jī)制中的重要作用以及TRPM2可能是氧化應(yīng)激性疾病的潛在治療靶點(diǎn)，本研究探討H9N2-SIV感染小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVEC)過程中TRPM2的表達(dá)與作用，為通過TRPM2有效干預(yù)/治療流感病毒誘導(dǎo)的肺損傷提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

A/swine/HeBei/012/2008/(H9N2)病毒由河北北方學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，其部分基因序列參見GenBank，序列號(hào)為CY063662、CY063663、CY063664和CY063665。該病毒經(jīng)10日齡SPF雞胚傳代，收集含毒尿囊液，經(jīng)紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒血凝價(jià)，將效價(jià)在8 Log2以上含毒尿囊液進(jìn)行分裝、于-70 ℃冰箱保存，待用。小鼠PMVEC購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 主要試劑

DMEM-H培養(yǎng)液、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺和青-鏈霉素購自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 購自Corning；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)檢測(cè)試劑盒、活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒、總一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)定量試劑盒、ECL試劑盒、抗GAPDH抗體、BCA蛋白定量試劑盒和總ATP酶定量試劑盒購自凱基生物公司；羊抗兔IgG購自Invitrogen；抗TRPM2抗體購自Abcam。Corning Transwell培養(yǎng)板購自上海坤肯生物化工有限公司。

3 主要方法

3.1PMVEC培養(yǎng) 將PMVEC使用含10% FBS、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉和青-鏈霉素的DMEM-H培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期使用。

3.2H9N2-SIV感染 參照李珮瑤等[9]報(bào)道方法進(jìn)行。取PMVEC已長(zhǎng)成單層的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗3次(每次3 min)，1～3列加入10-2稀釋H9N2-SIV液500 μL，4～6列加入相同體積的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2溫箱中吸附2 h(中間振蕩20 s)后，棄去病毒懸液或培養(yǎng)液，1～6列分別加入含0.3 mg/L胰酶維持液，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24 h和48 h，取樣進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

3.3H9N2-SIV感染PMVEC后SOD、GSH-Px、ROS和NOS水平的測(cè)定 將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，4 ℃ 800×g離心5 min，PBS洗滌，計(jì)數(shù)5×107個(gè)細(xì)胞，加0.8 mL緩沖液重懸，細(xì)胞懸液冰浴、超聲波勻漿；加0.2 mL Medium Buffer混勻，4 ℃、10 000×g離心10 min，去上清；立即使用，進(jìn)行蛋白定量，按照檢測(cè)試盒說明書操作步驟測(cè)定并計(jì)算PMVEC中SOD、NOS、ROS及GSH-Px水平。

3.4H9N2-SIV感染PMVEC超微結(jié)構(gòu)的觀察 PMVEC培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在細(xì)胞達(dá)到70%融合時(shí)，加入10-2稀釋H9N2-SIV液500 μL進(jìn)行感染，在感染后24 h和48 h，PBS緩沖液洗2次，用胰酶消化收集細(xì)胞,4 ℃、 800×g離心5 min，細(xì)胞沉淀經(jīng)固定、脫水、包埋等處理后使用Leica EM UC7超薄切片機(jī)切片，切片經(jīng)醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡(H-7650，120KV)觀察。

3.5單層PMVEC跨膜電阻和通透性測(cè)定 參照劉亞楠等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行。根據(jù)單層PMVEC對(duì)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)通透性的變化來反映單層PMVEC通透性的改變。即按105個(gè)/cm2細(xì)胞數(shù)將PMVEC接種于1%明膠包被的Transwell頂層小室微孔膜上，長(zhǎng)至細(xì)胞融合后，將培養(yǎng)液更換為無血清無酚紅DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞同步生長(zhǎng)并處于靜止期。用確定的最佳感染劑量的H9N2-SIV感染PMVEC，每個(gè)雙層小室的頂室內(nèi)加入3.4×10-6mol/L HRP，5%CO2、37 ℃孵育45 min；在病毒感染后24 h和48 h，采用WPIEVOM2電阻儀(WPI)測(cè)定Transwell小室上、下室之間的電阻，以此反映單層內(nèi)皮細(xì)胞跨膜電阻值。同時(shí)，從每個(gè)雙層小室底室內(nèi)取2 μL樣品，放于96孔板中，然后加入TMB顯色液，使用多功能酶標(biāo)儀在379 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以其占加入總HRP量的百分比(%)表示HRP濃度。

3.6H9N2-SIV感染PMVEC中TRPM2 mRNA的表達(dá) 收獲PMVEC，將相同數(shù)量細(xì)胞移入離心管內(nèi)1 600×g離心5 min去上清液, 倒置控干，按試劑盒說明書要求進(jìn)行RNA提取，RNA濃度要求A260/A280大于2.0。根據(jù)Reverse Transcription System試劑盒說明書要求進(jìn)行總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。TRPM2的上游引物序列為5’-GGCACCUUUAUAUCAUUAATT-3’，下游引物序列為5’-UUAAUGAUAUAAAGGUGCCTT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-GTGGAGTCATACTGGAACATGTAG-3’，下游引物序列為5’-AATGGTGAAGGTCGGTGTG-3’。加入上述引物，進(jìn)行real-time PCR，條件：95 ℃ 10 s和55 ℃ 40 s為一個(gè)循環(huán)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在55 ℃條件下檢測(cè)熒光信號(hào)，檢測(cè)熔解曲線。用2-ΔΔCt法計(jì)算TRPM2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

3.7H9N2-SIV感染PMVEC中TRPM2蛋白的表達(dá) 收獲細(xì)胞，在冰上進(jìn)行裂解60 min；4 ℃、14 000×g離心5 min，取上清進(jìn)行BCA蛋白定量。加入5×上樣緩沖液，煮沸10 min，蛋白樣品收集。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE：條件為80 mA恒流4 h；將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；TBST溶液配制的5%脫脂奶粉室溫封閉60 min；抗TRPM2抗體 (1 ∶300釋稀)和抗GAPDH抗體 (1 ∶1 000釋稀) 4 ℃孵育過夜；TBS溶液洗2次，再用TBST溶液洗1次，每次10 min；II抗室溫孵育1 h；TBS溶液洗2次，再用TBST溶液洗1次，每次10 min；ECL顯色系統(tǒng)顯影檢測(cè)目的蛋白。

3.8H9N2-SIV感染PMVEC凋亡的觀察 采用Annexin V/PI雙染色法觀察H9N2-SIV感染對(duì)PMVEC凋亡的影響。移出培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化成單個(gè)細(xì)胞，以預(yù)冷PBS潤洗3次后，棄PBS液體，收集細(xì)胞。將收集的各組PMVEC懸浮于1×Annexin V/PI結(jié)合緩沖液中，細(xì)胞密度約為2×108/L，加入5 μL的Annexin V染色液和5 μL的PI染色液，輕輕混勻避光室溫孵育15 min，立即在激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1200)下觀察細(xì)胞凋亡情況。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 H9N2-SIV感染PMVEC對(duì)NOS、ROS、GSH-Px和SOD水平的影響

在H9N2-SIV感染PMVEC后24 h開始，感染組中GSH-Px和SOD活性與未感染對(duì)照組相比開始出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)；至感染后48 h，GSH-Px和SOD活性下降更為明顯，與未感染的對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.01)；與之相反，ROS水平和NOS活性則從感染后24 h開始顯著高于未感染對(duì)照組(P<0.01)，至感染后48 h，仍然顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，見表1。

表1 PMVEC感染H9N2-SIV后SOD、GSH-Px、ROS和NOS的變化

2 H9N2-SIV感染導(dǎo)致PMVEC超微結(jié)構(gòu)損傷

未加H9N2-SIV感染PMVEC電鏡觀察顯示細(xì)胞形狀結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見較多線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核體積較大，雙層核膜結(jié)構(gòu)完整，染色質(zhì)分布均勻，可見核仁，見圖1A；然而，H9N2-SIV感染后24 h小鼠PMVEC可見胞漿中線粒體基質(zhì)電子密度降低，嵴數(shù)量減少，部分區(qū)域呈空泡狀，見圖1B；細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞器數(shù)量減少，在胞質(zhì)內(nèi)可見大小不等的多個(gè)空泡狀結(jié)構(gòu)，擠壓細(xì)胞核至變形，可見核仁，見圖1C；至感染后48 h，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，異染色質(zhì)聚集在核膜下，細(xì)胞核電子密度降低，部分核膜斷裂，有形成凋亡小體的趨勢(shì)，見圖1D。

Figure 1.The ultrastructural changes of PMVEC infected by H9N2-SIV. A: representative normal control PMVEC without H9N2-SIV infection; B and C: representative PMVEC infected with H9N2-SIV at 24 h after infection; D: representative PMVEC infected with H9N2-SIV at 48 h after infection. The arrow showed mitochondrial damage.

3 H9N2-SIV感染對(duì)單層PMVEC跨膜電阻和通透性的影響

H9N2-SIV感染PMVEC后，隨著病毒感染時(shí)間的延長(zhǎng)，跨膜電阻值逐漸降低(P<0.05或P<0.01)，小室內(nèi)HRP含量增多，單層細(xì)胞通透性增高(P<0.05或P<0.01),見圖2。

Figure 2.The effect of H9N2-SIV on PMVEC permeability. A: TEER； B: HRP influx. Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs PMVEC group.

4 H9N2-SIV感染顯著增加PMVEC中TRPM2 mRNA表達(dá)

real-time PCR結(jié)果顯示，H9N2-SIV感染PMVEC組TRPM2 mRNA表達(dá)量隨著病毒感染時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增加(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The mRNA expression of TRPM2 in PMVEC detected by real-time PCR. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs PMVEC group.

5 H9N2-SIV感染顯著增加PMVEC中TRPM2蛋白表達(dá)

Westren blot檢測(cè)結(jié)果顯示，未感染PMVEC組在分子量171 kD出現(xiàn)明顯的條帶；H9N2-SIV感染PMVEC組24 h和48 h時(shí)均出現(xiàn)較未感染PMVEC組更明顯的條帶，顯示病毒感染后TRPM2表達(dá)明顯增加(P<0.01),見圖4。

Figure 4.The protein expression of TRPM2 in H9N2-SIV-infected PMVEC detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs PMVEC gorup.

6 H9N2-SIV感染對(duì)PMVEC凋亡的影響

H9N2-SIV感染PMVEC后，采用Annexin V/PI>雙染色法激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果顯示未經(jīng)病毒感染的PMVEC對(duì)照組在培養(yǎng)24 h和48 h后視野內(nèi)均未見明顯的熒光；在H9N2-SIV感染PMVEC 24 h后，較多感染細(xì)胞細(xì)胞膜被染色呈現(xiàn)綠色熒光，其中部分細(xì)胞細(xì)胞核被染色呈現(xiàn)紅色熒光；隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，至感染后48 h，更多細(xì)胞被染色呈現(xiàn)綠色和紅色熒光，表明H9N2-SIV感染導(dǎo)致PMVEC出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，見圖5。

Figure 5.Apoptosis of PMVEC with H9N2-SIV infection under laser scanning confocal microscope (×400).

討 論

自1997年首次發(fā)現(xiàn)H5N1禽流感病毒感染以來，不斷出現(xiàn)新的不同亞型的動(dòng)物源性流感病毒跨越種屬屏障感染人，甚至引起較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件，如H7N9、H5N2、H9N2以及H10N8等[11]，表明動(dòng)物源性流感病毒已逐漸成為威脅人類健康的重要病原體之一。在研究H5N1和H7N9等禽流感感染人類并引起嚴(yán)重肺損傷的機(jī)制時(shí)，有關(guān)炎癥因子，尤其是氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷占有重要作用。

為了探討流感病毒誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，本研究利用H9N2-SIV感染小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果顯示病毒感染過程中ROS和NOS水平顯著升高，但是SOD和GSH-Px活性則明顯降低，表明H9N2-SIV感染由于ROS的大量產(chǎn)生以及因清除自由基消耗而導(dǎo)致SOD和GSH-Px明顯降低。同時(shí)，電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察到病毒感染細(xì)胞過程中胞漿中細(xì)胞器數(shù)量減少，可見大量的空泡結(jié)構(gòu)，擠壓細(xì)胞核至變形；線粒體基質(zhì)減少甚至消失。此外，細(xì)胞跨膜電阻顯著下降以及通透性增加等均反映H9N2-SIV感染導(dǎo)致PMEVC出現(xiàn)明顯的細(xì)胞損傷，這種損傷可能與大量ROS產(chǎn)生有關(guān)。He等[12]研究顯示H5N1禽流感病毒感染小鼠肺損傷過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧類自由基發(fā)揮重要作用，流感病毒能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原敏感性信號(hào)通路促進(jìn)病毒復(fù)制和致病作用。因此，探索抗氧化劑或干擾誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基的相關(guān)信號(hào)通路的研究，成為目前干預(yù)流感病誘導(dǎo)肺損傷的研究熱點(diǎn)之一[13]。

在研究氧化應(yīng)激導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制時(shí)，Hecquet等[4]發(fā)現(xiàn)H2O2誘導(dǎo)TRPM2表達(dá)顯著升高并參與血管內(nèi)皮細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，最終導(dǎo)致細(xì)胞通透性增高。Mayo等[14]在研究H5N1禽流感病毒致病機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)H5N1禽流感病毒可以誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生和線粒體功能異常。此外，Sun等[15]也證實(shí)TRPM2在H2O2作用導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。因此上述研究提示氧化應(yīng)激體條件下誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流增加以及線粒體損傷及細(xì)胞凋亡在致病機(jī)制中發(fā)揮了作用。TRPM2作為氧化應(yīng)激敏感性非選擇性鈣離子通道,在氧化應(yīng)激損傷誘導(dǎo)Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞凋亡等起著作用，然而，目前TRPM2在流感病毒感染致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步觀察H9N2-SIV感染過程中TRPM2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示H9N2病毒感染引起PMVEC內(nèi)TRPM2 mRNA和蛋白表達(dá)均增加，提示TRPM2參與H9N2-SIV感染導(dǎo)致的PMVEC損傷過程。此外，有結(jié)果顯示檢測(cè)H9N2-SIV感染后Na+-K+-ATP顯著下降(實(shí)驗(yàn)結(jié)果另文報(bào)道)，同時(shí)Annexin V/PI雙染色法激光共聚焦顯微鏡觀察顯示感染細(xì)胞細(xì)胞凋亡顯著增多，以上結(jié)果證實(shí)H9N2-SIV感染PMVEC過程中線粒體活性顯著下降，同時(shí)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。H2O2通過TRPM2活化Ca2+依賴性酪氨酸激酶Pyk2，引起Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致Ras GTPase放大Erk信號(hào)通路，證實(shí)TRPM2是活性氧類自由基進(jìn)一步引起炎癥反應(yīng)的重要級(jí)聯(lián)信號(hào)通路之一[16]。在H2O2導(dǎo)致的氧化應(yīng)激過程中抑制內(nèi)源性TRPM2的表達(dá)和功能，從而干擾其介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可以減緩內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，有效緩解氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4, 17]。此外，TRPM2過表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞在H2O2作用下細(xì)胞死亡顯著增加[18]。以上研究表明TRPM2在氧化應(yīng)激損傷致病機(jī)制中具有重要作用。本研究結(jié)果也提示TRPM2參與了流感病病毒在PMVEC的致病過程。這些研究為進(jìn)一步通過干預(yù)TRPM2途徑闡明流感病毒誘導(dǎo)肺損傷機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。