電針對慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激抑郁模型大鼠血清炎癥因子及單胺類物質(zhì)的影響*

趙 俊，田會玲，宋洪濤，王 旭，羅 彤，艾麗雅，房毓敏，趙江豪，賽音朝克圖，李志剛△

(1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100029; 2.內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古人民醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)國際蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010065； 4.北京中醫(yī)藥大學東方學院,廓坊 065001)

抑郁癥(depression)被歸類為精神疾病。 臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)性抑郁、孤獨、焦慮、認知功能障礙和高自殺率，這給患者和家庭帶來嚴重的精神壓力和經(jīng)濟負擔[1-2]。 與此同時，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示全球約有3.5億人患有抑郁癥，而且人數(shù)正在逐年增加[3-4]。 世界衛(wèi)生組織(WHO)預(yù)測到2030年抑郁癥將成為全球慢性疾病的第一殺手，威脅人類的心理健康[5]。 選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)如鹽酸氟西汀通常是用于治療抑郁癥的首選藥物，但臨床上約有50%的患者對治療無效[6]。 因此，替代治療方案可能提供新的抗抑郁藥策略[7]。

針灸治療抑郁癥療效確切并可以緩解抗抑郁藥物的副作用[8]，臨床治療應(yīng)用日益受到關(guān)注。近年來，針刺治療抑郁癥的機制探討逐步深入，根據(jù)抑郁癥發(fā)病的“細胞因子假說”[9]，認為慢性應(yīng)激因素刺激后可以引起免疫激活，釋放各種炎性細胞因子，如白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[10]。此外，20世紀科學家還提出了抑郁癥的“單胺類假說”，認為抑郁癥的發(fā)生與中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)單胺類遞質(zhì)如去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-羥色胺(5-HT)水平或功能下降有關(guān)[11]。已有臨床研究發(fā)現(xiàn)，針刺百會、足三里等穴能顯著降低抑郁癥患者血清IL-6和TNF-α的水平[12-13]；針刺肝俞、腎俞等穴能顯著升高女性更年期抑郁癥患者血清NE、DA及HIAA的含量[14]。另有報道[15]指出百會穴(GV20)對神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)有良性調(diào)節(jié)作用；印堂穴(GV29)同樣對神經(jīng)系統(tǒng)也有調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)釋放，參與抑郁癥的發(fā)生。百會與印堂被認為是治療抑郁癥的首要穴位[16]，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針百會、印堂穴對抑郁癥治療有效[17]，并且電針能調(diào)節(jié)中樞炎癥因子及神經(jīng)遞質(zhì)水平[18-19]，但電針對血清中炎性細胞因子和單胺類物質(zhì)的影響尚不明確。本實驗擬采用慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激(CUMS)抑郁大鼠模型，觀察電針刺激百會、印堂穴后對血清IL-6 、TNF - α 、NE 、DA及HIAA含量的影響，探討電針治療抑郁癥的可能機制及潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，8～9周齡，體質(zhì)量為160～220 g。由北京維通利華實驗動物公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0006。將所有大鼠置于溫度(22±2)℃和相對濕度(35±2)%的環(huán)境中，飼養(yǎng)室通風良好且自然光充足，條件相對穩(wěn)定，飼養(yǎng)7天以適應(yīng)環(huán)境。實驗程序經(jīng)北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2 主要實驗試劑及藥物 IL-6和TNF-α ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)標準品：去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)(美國Sigma公司);色譜級甲醇(fisher)、L-半胱氨酸(amresco)、磷酸二氫鈉(merck)、辛烷磺酸鈉(Alfa)、乙二胺四乙酸二鈉(Alfa)、氯化鉀(Alfa)都是進口分析純(美國Sigma公司);氟西汀(禮來蘇州制藥有限公司，批號:J20170022)。一次性針灸針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；韓氏電針儀(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)有限公司，LH202)；超聲破碎儀(美國SONICS)；臺式冷凍離心機(德國HERAEUS)。

1.2 分組、造模及干預(yù)方法

為確保實驗造模刺激之前基線特征的一致性，在應(yīng)激前1天測量了體質(zhì)量，并進行高架十字迷宮實驗(Elevated plus maze,EPM)。踢除4只基線特征不一致的大鼠，將具有相似體重和EPM基線特征的24只大鼠隨機分為4組，即正常組、模型組、氟西汀組與電針組(每組6只)。除應(yīng)激刺激期外，所有大鼠可自由進食和飲水。 干預(yù)均于每日上午10點進行，模型組、氟西汀組和電針組每日隨機接受1種應(yīng)激刺激方式，造模期為第8～36天，共28天。見圖1。

圖1 CUMS刺激方式造模實驗時間表

本研究結(jié)合慢性不可預(yù)見性溫和應(yīng)激建立CUMS模型[20]。應(yīng)激刺激方法包括4℃冷水游泳5 min；禁或禁食24 h；晝夜顛倒24 h；束縛3 h；夾尾3 min；籠位傾斜24 h；潮濕環(huán)境24 h。為了確保刺激方式不可預(yù)測，每天的刺激順序隨機抽簽產(chǎn)生，且同一刺激不連續(xù)應(yīng)用，共持續(xù)28天。

除正常組大鼠群養(yǎng)以外，其余各組單籠飼養(yǎng)。正常組自由飲水食，不接受任何刺激。模型組每日接受隨機慢性應(yīng)激造模刺激處理后，不接受任何治療。 氟西汀組每日應(yīng)激刺激后1 h，用生理鹽水配制1 mg/mL的氟西汀稀釋藥液，按照2 mg/kg灌胃給藥。電針組應(yīng)激1 h后，固定于自制鼠套中，參照張露芬主編《實驗針灸學》選取相當于人體解剖部位的 “印堂”和“百會”穴[21]。局部消毒后，選用0.25 mm×25 mm一次性針灸針，針刺深度約為5～10 mm，且針體與皮膚保持15°夾角，“印堂”穴針尖向下傾斜，“百會”穴針尖向上傾斜，小幅度輕捻轉(zhuǎn)后，針柄接韓氏電針儀，頻率2 Hz，電流強度1 mA，連續(xù)波，刺激強度維持在頭部肌肉輕微振動且不嘶叫為宜，持續(xù)20 min，每天1次，治療28天。

1.3 檢測方法

1.3.1 高架十字迷宮實驗(EPM) 評價動物抑郁樣行為的首要裝置，利用動物對新高懸敞開臂環(huán)境的好奇心和恐懼心理(開臂)以及嗜暗天性(閉臂)，形成動物的探究與回避的矛盾沖突來考察動物的抑郁焦慮狀況[22]。實驗將每只大鼠于十字迷宮中央平臺處放入，使其頭部正對其中1個封閉臂，釋放后計時5 min并記錄以下指標:進入開放臂次數(shù)(Open arm entry,OE)、 進入封閉臂次數(shù)(Close arm entry,CE)、進入開放臂時間(Open arm time,OT)和進入封閉臂時間(Close arm time,CT)。根據(jù)上述指標計算：開放臂的次數(shù)比例OE(%)=OE/(OE+CE)×100%；和開放臂停留時間比例OT(%)=OT/(OT+CT)×100%。

1.3.2 ELISA法檢測血清IL-6 和TNF-α含量 實驗第36天，大鼠稱重后予10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔麻醉后迅速腹主動脈取血5 mL，靜置后離心(4℃，3 000 rpm，15 min)，取上清液于-80℃保存?zhèn)溆?。每只大鼠取?0 μL，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作測定血清IL-6和TNF-α的水平。

1.3.3 HPLC法檢測血清中NE、DA和5-HIAA含量 HPLC設(shè)備包括Agilent 1 100 LC高效液相色譜儀和DECADE II SDC電化學檢測器。 Skyam?的Atlantis C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3 μm)。使用由0.1 mol/L KH2PO4和甲醇(10∶1，V/V；pH=3)組成的流動相進行色譜分離，流速為0.2 mL/min，柱溫30℃，檢測電極電位為500 mV。

配制裂解液：稱取(0.05 g 0.01%L-半胱氨酸，0.1 g 0.5 mmol/L EDTA二鈉，9 mL 0.2 mol/L高氯酸)并用超純水稀釋成100 mL的血清裂解液。每只大鼠取樣250 μL，將裂解液以1∶5的比例加入血清中(即50 μL血清中加入10 μL裂解液)。冰浴條件下超聲破碎10 s。4℃，15 000 r/min離心30 min，取上清液-80℃凍存以析出蛋白，檢測前再15 000 r/min離心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸過濾器過濾后，將10 μL注入HPLC系統(tǒng)進行分析。待檢血清單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA和5-HIAA，各神經(jīng)遞質(zhì)濃度含量以ng/L表示。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 實驗結(jié)果

2.1 高架十字迷宮實驗(EPM)結(jié)果

實驗應(yīng)激前，各組大鼠在開放臂的次數(shù)比例(OE%)和開放臂停留時間比例(OT%)均無顯著性差異(P>0.05)。實驗應(yīng)激后，與正常組比較，模型組OE%和OT%明顯下降(P<0.01)，表明造模成功；與模型組比較，氟西汀組大鼠OE%和OT%值上升(P<0.01或P<0.05)，電針組OE%和OT%值亦存在顯著差異(P<0.01),提示經(jīng)過氟西汀和電針干預(yù)后可以改善這種焦慮抑郁樣行為。見表1。

表1 高架十字迷宮實驗開放臂次數(shù)和停留時間比較

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與氟西汀組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 ELISA檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清IL-6和TNF-α含量均升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。經(jīng)氟西汀和電針治療后，與模型組比較，氟西汀組IL-6和TNF-α含量均降低(P<0.01),電針組IL-6和TNF-α含量同樣顯著降低(P<0.01)；與氟西汀組比較，電針組IL-6和TNF-α含量減少，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

表2 ELISA檢測結(jié)果

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與氟西汀組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.3 HPLC檢測結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清NE含量顯著降低(P<0.05)。經(jīng)氟西汀和電針治療后，與模型組比較，電針組DA含量變化最為顯著(P<0.01)，NE、5-HIAA含量升高，接近正常水平，但無統(tǒng)計學差異；與模型組比較，氟西汀組5-HIAA含量升高(P<0.01)；與氟西汀組相比，電針組DA、5-HIAA含量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 HPLC檢測結(jié)果

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與氟西汀組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2 NE、DA、5-HIAA檢測結(jié)果

3 討論

抑郁癥通常被認為是具有復(fù)雜病理生理學和不同信號傳導(dǎo)途徑的多系統(tǒng)疾病。中醫(yī)認為百會和印堂為督脈的要穴，百會主一身之宗，百神之會，且與足太陽膀胱經(jīng)穴相交會，通過調(diào)節(jié)太陽經(jīng)(心俞、肝俞、脾俞、腎俞；神堂、魂門、意舍)等背俞穴而與五臟六腑關(guān)系密切，故能協(xié)調(diào)陰陽、調(diào)和五臟精神、通調(diào)髓海，有百脈朝宗之效。而印堂穴能安神醒腦、益智定驚，正所謂“經(jīng)脈所過，主治所及”，與百會穴能一同發(fā)揮“近治功效”，因此本研究選取督脈上的印堂、百會穴治療神志疾病，符合中醫(yī)治病必求于本之說[23]。

臨床研究[24]表明慢性應(yīng)激可以引發(fā)患者抑郁樣行為，電針治療對抑郁癥有一定的改善作用[16]。抑郁癥的“細胞因子假說”，認為長時間的慢性應(yīng)激會導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)損傷，免疫系統(tǒng)會在應(yīng)激下持續(xù)激活，單核-巨噬細胞活動增加，致炎性細胞因子(IL-6、TNF-α等)釋放增加[25]。動物實驗表明，致炎因子IL-6、TNF-α等在抑郁模型體內(nèi)的水平顯著升高，該研究結(jié)論得到普遍認同[26]。臨床研究[27]發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者存在免疫系統(tǒng)功能的改變，中樞炎性因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等表達上調(diào)。另有報道[28]指出抑郁癥患者血清致炎性因子(IL-6、TNF-α)水平明顯增高，且隨著病情的加重炎性因子水平也隨之升高。以上研究提示中樞和外周IL-6、TNF-α水平的變化可能反映抑郁癥的嚴重程度。

另有報道[29]指出慢性應(yīng)激會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)中調(diào)節(jié)細胞功能的小分子多肽——細胞因子分泌異常，炎性細胞因子通過對神經(jīng)遞質(zhì)等方面的影響，可引起神經(jīng)遞質(zhì)的水平過低，神經(jīng)發(fā)生減少，進而導(dǎo)致抑郁癥發(fā)生[30]。既往研究發(fā)現(xiàn)，核因子-κB可介導(dǎo)外周炎性細胞因子進入中樞，結(jié)合相應(yīng)的受體，通過影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成及釋放進而影響抑郁癥的發(fā)生發(fā)展[31]。

本研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激造模后，大鼠開放臂的次數(shù)比例(OE%)和停留時間比例(OT%)明顯下降，模型大鼠表現(xiàn)抑郁焦慮樣行為，這與臨床抑郁癥患者癥狀極為相似[32]，提示本實驗成功建立抑郁模型。本次研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激可以引起抑郁大鼠血清IL-6和TNF-α含量顯著升高，既往研究發(fā)現(xiàn)[33]，IL-6、TNF-α含量升高與抑郁癥發(fā)生呈正相關(guān)，本次研究與該研究結(jié)論相似。電針治療可以顯著降低模型大鼠血清中上述炎性細胞因子水平，這與針刺可以顯著降低慢性應(yīng)激抑郁大鼠血清IL-6和TNF-α含量[34]結(jié)果一致。血清中的單胺物質(zhì)檢測結(jié)果顯示，應(yīng)激后模型組大鼠血清NE、DA和5-HIAA含量降低，經(jīng)氟西汀和電針治療后，NE、5-HIAA含量有不同程度的升高，氟西汀治療后5-HIAA較電針治療變化明顯，而電針治療后5-HIAA接近正常水平，這可能是抗抑郁藥物副作用的緣故?？挂钟羲幬镏饕且罁?jù)單胺能遞質(zhì)缺乏假說研發(fā)而成，是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平來實現(xiàn)的抗抑郁效應(yīng)[35]，特別是多巴胺受體，在抑郁癥的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，經(jīng)氟西汀治療后，大鼠DA含量升高，與藥物的功效趨勢相符合。較氟西汀治療效果而言，電針治療后DA含量變化最為顯著，這與針刺可以顯著增加DA表達結(jié)果一致[36]，表明電針治療在改善DA含量方面較單純氟西汀治療更為有效。

本實驗結(jié)果表明，電針治療可以恢復(fù)慢性輕度不可預(yù)測的輕度應(yīng)激誘導(dǎo)的大鼠抑郁樣行為，降低應(yīng)激抑郁大鼠血清IL-6和 TNF-α的表達，緩解外周免疫炎癥反應(yīng)，同時還能促進機體單胺類神經(jīng)物質(zhì)，特別是DA的分泌，這可能是電針發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機制之一。