白藜蘆醇通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1/核因子κB通路改善大鼠急性心肌梗死后炎癥反應(yīng)的研究

何忠開 鄭玉菡 姚峰 鄭重洲 陳燦

524001 湛江，廣東醫(yī)科大學(xué)院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(何忠開、姚峰、鄭重洲、陳燦)，腫瘤中心(鄭玉菡)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是常見的心血管疾病，發(fā)病率高、致死率高，且死亡率總體呈現(xiàn)上升趨勢[1]，而院內(nèi)病死率無顯著降低。我們前期研究顯示，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)通路參與AMI的發(fā)生發(fā)展，而白藜蘆醇(resveratrol，RES)通過抑制NF-κB信號(hào)通路表達(dá)起到心臟保護(hù)作用[2]，但具體機(jī)制未知。RES是一種強(qiáng)效的沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator，SIRT)1激動(dòng)劑，通過激動(dòng)SIRT-1來發(fā)揮作用。因此，本研究擬采用SD大鼠制作AMI模型，并采用RES干預(yù)，以觀察RES對(duì)AMI后SIRT-1/NF-κB信號(hào)通路及炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型和標(biāo)本采集

30只清潔級(jí)雄性SD大鼠(6月齡)，體重180～220 g，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字將實(shí)驗(yàn)SD大鼠分成3組：假手術(shù)組(Sham組)、AMI組和RES組(RES，10 mg·kg-1·d-1，腹腔注射)。通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支制作AMI模型。所有SD大鼠按50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉，并行面罩通氣支持呼吸；AMI和RES組通過左側(cè)第3或第4肋間隙開胸暴露心臟，打開心包，用6-0絲線結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支，通過心電圖ST-T改變證實(shí)心肌缺血或者梗死；而Sham組只穿線不結(jié)扎，術(shù)閉后逐層縫合關(guān)胸；術(shù)后第1天RES組即給予腹腔注射RES(10 mg·kg-1·d-1)，Sham組和AMI組給予同等體積生理鹽水。觀察4周后，處死各組大鼠，獲取其心臟組織。

1.2 HE染色檢測

每組取3只大鼠心臟組織，制作石蠟切片(厚度5 μm)，脫蠟后蘇木精染色10 min，用自來水洗滌，直至不再有紅色液體流下，用1%的鹽酸乙醇溶液分化1 min，自來水洗滌1 min，再用伊紅染色約3 min，自來水洗滌1 min，將組織切片逐級(jí)脫水后，二甲苯透明，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察RES對(duì)大鼠心臟組織病理學(xué)變化的影響。

1.3 qRT-PCR檢測

取約50 mg心肌組織，加入1 ml的Trizol試劑(Invitrogen公司，美國)，按照說明書操作步驟提取組織總RNA，分光光度計(jì)法測定總RNA的純度及質(zhì)量，以光密度在1.8～2.1視為合格，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書將所提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書對(duì)相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量。大鼠IL-1β、IL-6及SIRT-1以及內(nèi)參β-actin的 PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)和合成(表1)。結(jié)果分析采用2-ΔCt相對(duì)定量分析方法：ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因)-Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)；ΔCt(對(duì)照組)=Ct(對(duì)照組目標(biāo)基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參)。

表1 基因PCR引物

1.4 Western blot檢測

采用RIPA裂解液(碧云天生物公司)提取心肌組織總蛋白質(zhì)，進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉TBST溶液封閉1 h后，加入大鼠單克隆β-actin (1∶1 000，Abcam公司)、IL-1β一抗(1∶500，Abcam公司)、IL-6一抗(1∶500，Abcam公司)、SIRT-1一抗(1∶500 ，Abcam公司)、IKK一抗(1∶500，Abcam公司)、p-IKK一抗(1∶500，Abcam公司)、p56一抗(1∶500，Abcam公司)、p-p56一抗(1∶500，Abcam公司) 后 4℃過夜；第二天復(fù)溫1 h后，二抗孵育2 h； ECL顯影，暗房曝光。以目的條帶與內(nèi)參β-actin條帶灰度值比值評(píng)定蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AMI大鼠模型鑒定

較Sham組，AMI組和RES組大鼠的心電圖ST段明顯抬高，提示造模成功(圖1)。

圖1 3組大鼠造模后心電圖表現(xiàn)

2.2 HE染色檢測RES對(duì)大鼠心臟組織病理學(xué)變化的影響

HE染色結(jié)果顯示，Sham組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)分明，心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常；AMI組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，且細(xì)胞著色不均，心肌纖維腫脹、斷裂；與AMI組相比，RES組心肌細(xì)胞和肌纖維排列相對(duì)整齊(圖2)。

圖2 3組大鼠心臟組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

2.3 qRT-PCR測定IL-1β、IL-6、SIRT-1 mRNA的表達(dá)

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，AMI組的IL-1β、IL-6在mRNA表達(dá)顯著升高(均為P<0.01)，SIRT-1 mRNA表達(dá)顯著降低(均為P<0.001)；較AMI組相比，RES組的IL-1β、IL-6在mRNA表達(dá)均顯著降低(均為P<0.01)，SIRT-1 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.001)，但RES組和Sham組的IL-1β、IL-6、SIRT-1 mRNA表達(dá)比較無明顯差異(均為P>0.05)(圖3)。

(ns：P>0.05；aP<0.01；bP<0.001)圖3 3組大鼠IL-1β、IL-6、SIRT-1的mRNA水平表達(dá)情況

2.4 Western blot檢測 IL-1β、IL-6、SIRT-1、p-p56、p56、p-IKK及IKK蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，AMI組IL-1β、IL-6在蛋白水平顯著升高(均為P<0.01)，SIRT-1蛋白水平表達(dá)顯著降低(P<0.001)；與AMI組相比，RES組IL-1β、IL-6蛋白水平均顯著減少(P<0.01)，而與Sham組相比沒有差異(均為P>0.05)，SIRT-1蛋白水平顯著升高(P<0.001)，但仍顯著低于Sham組(P<0.01)。與Sham組和RES組相比，AMI組的p-IKK/IKK 和p-p56/p56比值顯著升高(P<0.01)；但RES組和Sham組的p-IKK/IKK 和p-p56/p56比值無明顯差異(均為P>0.05)(圖4)。

圖4 3組大鼠IL-1β、IL-6、SIRT-1、p-p56、p56、p-IKK及IKK蛋白表達(dá)情況

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激[3]和炎癥反應(yīng)[4]參與AMI后心肌重構(gòu)。IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和單核細(xì)胞趨化蛋白1是慢性炎癥主要參與者，均參與NF-κB信號(hào)路徑調(diào)節(jié)[5-6]。P65是NF-κB的重要亞基，磷酸化后導(dǎo)致NF-κB二聚體從IκB α/p50/p65 復(fù)合物中解離，活化移至細(xì)胞核，與核內(nèi)多種基因的啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因的表達(dá)。前期研究結(jié)果提示，AMI后NF-κB信號(hào)通路會(huì)激活，NF-κB、IκBα、IKKα在基因和蛋白水平的表達(dá)均升高，而RES有改善NF-κB信號(hào)通路高表達(dá)的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，SIRT-1是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵酶，能明顯減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激作用[7]。RES具有抗氧化應(yīng)激、抗炎癥反應(yīng)和抑制凋亡等作用[8]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心肌梗死區(qū)的炎癥因子IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白水平表達(dá)顯著升高，p-p65/p65與p-IKK/IKK比值顯著升高；而RES可降低IL-1β、IL-6 mRNA及蛋白水平及p-IKK/IKK和p-p65/p65比值；進(jìn)一步證實(shí)RES可改善心肌梗死后炎癥反應(yīng)，通過抑制NF-κB激酶IKK磷酸化、抑制NF-κB的活性，達(dá)到抗氧化、保護(hù)心肌的作用。研究顯示，RES是最強(qiáng)的SIRT-1的激動(dòng)劑之一[9]。最近文獻(xiàn)報(bào)道，其通過激活肝AMP激活的蛋白激酶和SIRT-1表達(dá)，增加肝臟和肌肉線粒體生物合成及抑制NF-κB的活性，改善能量代謝[10]。SITR-1通過增強(qiáng)IKK磷酸化促進(jìn)IκBα降解，抑制NF-κB活性[11]。另外，SITR-1通過誘導(dǎo)NF-ΚB p65的磷酸化或者乙?；瘉戆l(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AMI后SIRT-1 mRNA及蛋白表達(dá)顯著降低，p-p65/p65與p-IKK/IKK比值顯著升高；RES卻能顯著提高SIRT-1 mRNA及蛋白水平表達(dá)，降低p-IKK/IKK和p-p65/p65比值。因此，我們推測RES保護(hù)心肌的機(jī)制可能與激動(dòng)SIRT-1活性、抑制IKK及p65酸化激化、最終阻止NF-κB信號(hào)通路的啟動(dòng)有關(guān)。

綜上所述，SIRT-1/NF-κB信號(hào)通路參與RES對(duì)大鼠AMI后炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)來保護(hù)心肌，其可能與SIRT-1激活I(lǐng)KK/NF-κB磷酸化有關(guān)，為我們下一步應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)體外細(xì)胞培養(yǎng)、驗(yàn)證RES通過SIRT-1/NF-κB通路改善大鼠AMI后炎癥反應(yīng)提供理論依據(jù)。

利益沖突：無