不同基質(zhì)載體表面微生物種群特性分析

呂宣惠

摘要：水溫9.3～14℃、水交換周期為168h的條件下，構(gòu)建了兩組平行的玉米麩基質(zhì)組合式浮床（Integrated floating bed with corn flakes，簡稱IFB - CF）和輕質(zhì)陶?；|(zhì)組合式浮床（Integrated floating bed with light ceramsite，簡稱IFB - LC），研究了不同載體表面微生物種群特性差異。結(jié)果表明：采用Miseq高通量測序表征方法對IFB - CF和IFB - LC上基質(zhì)表面微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行表征：玉米麩表面有15個門類，165個屬類，78個科類，豐度最高的門類、屬類、科類分別是Proteobacteria（48.29%）、Trichococcus（10.39%））、Comamonadaceae（12.45%）。輕質(zhì)陶粒表面有15個門類、144個屬類、93個科類，豐度最高的門類、屬類、科類分別是Proteobacteria（46.10%）、Dyadobacter（22.67%）、Cytophagaceae（28.75%）。IFB - LC和IFB - CF的Chao，ACE，Shannon和Simpson指數(shù)分別為4081，6295，5.10 和0.05;4938，7461，5.77和0.02。

Abstract： To investigate the effect of combined floating beds on nutrient removal under low temperature， an integrated floating bed with corn flakes （IFB-CF） and an integrated floating bed with light ceramsite （IFB-LC） were constructed in parallel. IFB-LC was used as control group under water temperatures of 9.3～14℃ and a water exchange time of 168h. The microbial population characteristics of the combined floating bed were investigated. Using the MiSeq high throughput sequencing method， we analysed microbial community structure and diversity on the base material surface of the IFB-CF and IFB-LC. The results showed 15 phyla， 165 genera， and 78 families on the surface of the IFB-CF. The phylum， genus， and family with the highest abundances were Proteobacteria （48.29%）， Trichococcus （10.39%）， and Comamonadaceae （12.45%）， respectively. We identified 15 phyla， 144 genera， and 93 families on the surface of the IFB-LC. The phylum， genus， and family with the highest abundances were Proteobacteria （46.10%）， Dyadobacter （22.67%）， and Cytophagaceae （28.75%）， respectively. The Chao， ACE， and Shannon & Simpson indices for the IFB-LC were 4081， 6295， and 5.10， and 0.05， respectively.

關(guān)鍵詞：組合式浮床;高通量測序;微生物多樣性分析

Key words： combined floating bed;high throughput sequencing;microbial community structure

中圖分類號：X703? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：1006-4311（2019）35-0238-03

0? 引言

因過量的營養(yǎng)鹽排入江河湖庫等地表水體，使地表水體呈現(xiàn)出較嚴重的富營養(yǎng)化污染[1，2]。全球30%-40%的湖泊和水庫正在遭受不同程度水體富營養(yǎng)化污染，并有少數(shù)湖泊存在黑臭現(xiàn)象、植物種類減少和水空間萎縮等問題。例如：西班牙800座水庫中，有1/3處于重度富營養(yǎng)化。我國湖泊富營養(yǎng)化發(fā)展速度很快，進入21世紀后，水體富營養(yǎng)化問題全面爆發(fā)，如：太湖、滇池和巢湖等我國重要湖泊藻類瘋漲備受關(guān)注。至今，我國重度富營養(yǎng)化湖泊達66%以上，超富營養(yǎng)化湖泊達22%以上。富營養(yǎng)化水體處理刻不容緩，富營養(yǎng)化水體在外源污染截留以后，內(nèi)源污染仍然會起作用，引起生態(tài)失調(diào)、多樣性退化和修復(fù)能力弱化問題。常見的方法有物理的、化學的和物化的以及生物-生態(tài)的等方法，從工程造價、可持續(xù)凈化和運行維護等角度出發(fā)，生物-生態(tài)技術(shù)是最廉價、最成熟和環(huán)境友好程度最高的工藝[3-5]，如：活性污泥法、生物膜法、人工濕地法和土地處理法等等，采用生物-生態(tài)技術(shù)進行富營養(yǎng)化水體具有水質(zhì)提升和生態(tài)改善雙重效果，有利于協(xié)同解決水體富營養(yǎng)化問題。其中生物膜法是地表水體水質(zhì)凈化的首選工藝，具有微生物濃度高、凈化效果好、產(chǎn)泥少等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于富營養(yǎng)化水體的凈化處理[6-8]。

生物載體（簡稱：載體）是生物膜增殖的介質(zhì)，其特性決定了生物膜特性，包括生物膜形成速度、生物膜質(zhì)量、微生物種群多樣性等等，載體的研發(fā)和優(yōu)化是國內(nèi)外廣泛關(guān)注的重點[9]。水體凈化研究和工程實踐過程中選擇合適的載體非常重要，它決定了目標污染物的去除效果、凈化速率和動力消耗以及二次污染問題等等諸多問題，備受關(guān)注[10，11]。

本試驗選的水芹是冬春季節(jié)凈化重污染河道的經(jīng)濟有效生物材料，水芹浮床在9.3～14℃水溫下對氮磷污染物都可以保持較高的去除率和較強的生命力。同時選用玉米麩（農(nóng)業(yè)廢棄物）作為基質(zhì)，并對系統(tǒng)進行微曝氣，改善傳質(zhì)效果。本試驗的目的研究玉米麩和陶粒表面微生物物種多樣性特征，為相關(guān)理論研究提供參考。

1? 材料和方法

1.1 浮床基質(zhì)

玉米麩：取自徐州市云龍區(qū)周邊農(nóng)村地區(qū)玉米棒芯通過人工剪裁成約為1cm×1cm×1cm方形，表面粗糙較好，用自來水連續(xù)浸泡兩周（每天換水1次），消除玉米麩表面容易脫落的有機顆?；蚪M織內(nèi)含物，防止試驗過程中出現(xiàn)二次污染，孔隙率約為68%，比表面積約為380m2/m3。輕質(zhì)陶粒：表面粗糙，粒徑為5-8mm、孔隙率約為65%、比表面積約為360m2/m3。

1.2 生態(tài)浮床植物的選取與種植

水芹（Oenanthe javanica）試驗前將購自植物培育基地的水芹根系洗凈，并曝氣培育15天，試驗時將水芹育苗統(tǒng)一修剪為15cm，并移栽到生態(tài)浮床基質(zhì)中。水芹露出填料高度約為8cm，其余埋在基質(zhì)中，兩組生態(tài)浮床中水芹栽種間距（3cm）均相同。

1.3 原水

取自徐州工程學院中心校區(qū)二期學生公寓樓下的湖水，在湖水中加入一定量的氯化銨、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、葡萄糖和奶粉（雀巢牌），使COD為76.50～88.40mg/L，NH4+-N為13.60～14.60mg/L，TN濃度為19.70～21.80mg/L，TP濃度為0.95～1.25mg/L，pH值為7.36～8.63。試驗日期為2016年11月22日至2017年2月13日，水溫9.3～14℃，1月1日在生態(tài)浮床基質(zhì)上剝落下的生物膜中發(fā)現(xiàn)了較為豐富的鐘蟲和少量的輪蟲。

1.4 浮床組成和試驗方法

生態(tài)浮床由床體框架、水芹、基質(zhì)組成。生態(tài)浮床床體框架使用能過水的塑料圓柱形水培籃，內(nèi)徑為20cm，深度為18cm，每個水培籃內(nèi)玉米麩或輕質(zhì)陶粒填充量分別為3.5升，共2個。將其移入有效容積為100L的長方體水箱，構(gòu)建生態(tài)浮床系統(tǒng)。

每組生態(tài)浮床設(shè)置3個平行的生態(tài)浮床，每個生態(tài)浮床中的基質(zhì)、水芹、水質(zhì)等保持相同，其中一組是以玉米麩為基質(zhì)的組合式浮床（Integrated floating bed with corn flakes，簡稱IFB-CF），另一組是以輕質(zhì)陶粒為基質(zhì)的組合式浮床（Integrated floating bed with light ceramsite，簡稱IFB-LC）。使用風機進行水面微曝氣，使溶解氧維持在2.23～3.25mg/L;采用序批式處理的方法，分別于每次換水后的12h，24h，48h，72h，96h，120h，144h，168h取樣測量。在水箱的5處不同位置采集表層水樣，取混合后水樣裝入已滅菌的采樣瓶中，2小時內(nèi)完成檢測分析。

1.5 樣品采集及分析

微生物多樣性表征：將取自IFB-CF和IFB-LC中的具有完整生物膜的玉米麩和陶粒放入經(jīng)滅菌后的具塞玻璃瓶中（內(nèi)置冰盒）快遞給江蘇中宜金大分析檢測有限公司，通過高通量DNA測序儀（Illumina Hiseq、Miseq）、高通量蛋白測序儀（Orbitrap）對輕質(zhì)陶粒和玉米麩表面的微生物進行測定。首先完成對填料表面微生物基因組DNA的提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。按指定測序區(qū)域，設(shè)計合成帶有“5barcode -引物- barcode 3”的特異引物，通過PCR擴增技術(shù)，要求產(chǎn)物純化，定量，均一化。為保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的準確性及可靠性，需滿足兩個條件：①盡可能使用低循環(huán)數(shù)擴增;②保證每個樣品擴增的循環(huán)數(shù)一致。隨機選取具有代表性的樣品進行預(yù)試驗，確保在最低循環(huán)數(shù)中使絕大多數(shù)樣品能夠擴增出濃度合適的產(chǎn)物。全部樣品按照正式試驗條件進行，每個樣品3個重復(fù)，將同一樣品的PCR產(chǎn)物純化混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物用Qubit進行檢測定量，之后按照每個樣品的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。最后加入TruSeq DNA HT Sample Prep Kit;MiSeq Reagent Kit v2試劑建立文庫，進行Miseq高通量測序。

2? 結(jié)果與分析

COD濃度隨時間的變化如圖1所示。IFB-LC和IFB-CF對COD的平均去除率分別為86.89%和66.06%。相對于IFB-CF而言，IFB-LC的去除效果較好。IFB-CF中有機物在被水芹、玉米麩表面生物膜吸收和降解的同時，玉米麩自身釋放有機物，相比于IFB-LC，IFB-CF增加了有機物的產(chǎn)出量，所以IFB-LC比IFB-CF對COD的降解效果要明顯。

3? 微生物多樣性分析

3.1 多樣性分析

IFB-CF和IFB-LC的微生物種群多樣性表征結(jié)果見表1所示。

從表1可知，玉米麩表面微生物的OTUs值明顯高于輕質(zhì)陶粒，說明玉米麩表面的微生物種類比陶粒表面的微生物種類相似度要高。Chao是度量物種豐富度的指標，它和豐度、均勻度無關(guān)，但是它對稀有的物種很敏感。并結(jié)合OTUs，玉米麩表面微生物的Chao大于輕質(zhì)陶粒，說明玉米麩表面微生物群落豐富度高于輕質(zhì)陶粒。同樣ACE指標，玉米麩表面微生物大于輕質(zhì)陶粒，這兩個指標都說明玉米麩表面微生物群體豐富度大于輕質(zhì)陶粒都表明IFB-CF對微生物量的積累是遠遠優(yōu)于IFB-LC。玉米麩表面微生物的Shannon值高于輕質(zhì)陶粒陶粒及玉米麩表面微生物的Simpson指數(shù)低于輕質(zhì)陶粒，說明玉米麩表面微生物多樣性優(yōu)于輕質(zhì)陶粒。由此可見，玉米麩表面微生物的OTUs，Chao，Shannon，ACE的四個指標都高于輕質(zhì)陶粒，Simpson的指數(shù)小，反映微生物物種多樣性越高，說明玉米麩表面微生物豐度和多樣性都高于輕質(zhì)陶粒。就群落水平而言，IFB-CF中種群多樣性高的群落包含更多具有不同生物學和生態(tài)學特性的種群，系統(tǒng)穩(wěn)定性更強。

3.2 稀釋曲線

OTU是將序列按照一定的相似性分歸為許多分類單元，一個單元就是一個OTU，通常在97%的相似水平下對序列進行OTU聚類分析。隨著樣品序列條數(shù)的增長，OTU數(shù)量也隨之增長。其增長趨勢可以用來比較不同樣品中微生物群落復(fù)雜程度。玉米麩和輕質(zhì)陶粒表面微生物表征結(jié)果見圖2，輕質(zhì)陶粒表面微生物稀釋曲線趨勢較玉米麩平緩，代表著陶粒表面的微生物群落復(fù)雜程度比玉米麩表面的微生物群落低。

3.3 門/屬/科水平上的分類

根據(jù)高通量測序和微生物種群表征結(jié)果，玉米麩表面細菌由15個門、165個屬、78個科組成，輕質(zhì)陶粒表面細菌由15個門、144個屬、93個科組成。玉米麩和陶粒表面細菌分布特性。

玉米麩表面優(yōu)勢菌種有Proteobacteria，Acidobacteria，Chloroflexi和Chloroplast相對豐度分別占細菌群落的48.29%，0.06%，0.01%和0.07%。而輕質(zhì)陶粒以Proteobacteria最為豐富，其次是Bacteroidete。Bacteroidete中里還有Cytophaga，Cytophaga可以有效降解纖維素等復(fù)雜有機物，使水體中纖維素水解，更高效的提供碳源。

玉米麩表面上的優(yōu)勢菌屬為Rhizobium、輕質(zhì)陶粒表面上的優(yōu)勢菌屬為Psedomonas，其相對豐度分別為3.52%和2.32%，它們都具有脫氮固氮功能。輕質(zhì)陶粒表面的Nitrospira，其相對豐度為0.02%，它能夠?qū)喯跛嵫趸上跛?，而玉米麩表面的Paenibacillus，其相對豐度為0.09%，它能夠?qū)⑾跛猁}還原到亞硝酸鹽，與上述IFB-LC的NO3--N濃度要高于IFB-CF的NO3--N濃度現(xiàn)象吻合。

玉米麩和輕質(zhì)陶粒表面的微生物優(yōu)勢種類有相似之處。例如：基于屬水平上的物種組成結(jié)果，兩種載體填料都含有Hydrogenophaga（氫噬胞菌屬），Hydrogenophaga內(nèi)有的種具有厭氧硝酸鹽呼吸作用，從而具備反硝化作用。玉米麩表面含量為3.33%高于輕質(zhì)陶粒表面的1.60%，從而IFB-CF的脫氮效果要優(yōu)于IFB-LC。從門、屬、科三個層面來看，IFB-LC微生物種類要略多于IFB-CF微生物種類，其原因是陶粒表面比玉米表面的比表面積大，有利于水芹根系在其載體表面生成生物膜，促使微生物的富集。對比研究發(fā)現(xiàn)，IFB-CF的Flavobacterium（解磷菌）含量為2.12%明顯優(yōu)于IFB-LC的1.52%;IFB-CF具有的Pseudomonas（桿菌，具有較強的脫氮能力）的數(shù)量要比IFB-LC少。

4? 結(jié)論

①IFB-LC對COD的去除率為87%，IFB-CF對COD的去除率為66%，采用含有碳源來源的浮床對水體營養(yǎng)鹽的去除優(yōu)于人工合成材料的浮床。

②從物種多樣性及系統(tǒng)穩(wěn)定性的角度分析，玉米表面的物種量確實要豐富輕質(zhì)陶粒表面，系統(tǒng)更加穩(wěn)定。

參考文獻：

[1]李瑩杰，王麗婧，李虹，等.不同水期洞庭湖水體中磷分布特征及影響因素[J].環(huán)境科學，2019，40（5）：2170-2177.

[2]張雁秋，曹文平.人工濕地污水處理應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展前景展望[J].徐州工程學院學報（自然科學版），2016，31（4）：1-4，14.

[3]路娜.引江濟太對太湖水體堿性磷酸酶影響的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2009.

[4]曾凡歸，張璐，馬學坤，等.夏季池塘藍藻爆發(fā)的原因分析及防治技術(shù)[J].當代水產(chǎn)，2011，10：40-43.

[5]曹慶穗，褚芳，白強，等.城市代表性內(nèi)部河段原位水體治理研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44（12）：496-498.

[6]沈加正.海水循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中生物膜生長調(diào)控與水體循環(huán)優(yōu)化研究[D].杭州：浙江大學，2016.

[7]張振雷.鎖磷劑與藻類生物膜聯(lián)用處理喻家湖湖水的實驗研究[J].武漢：華中科技大學，2017.

[8]雷振宇.組合生態(tài)技術(shù)在梁灘河原位修復(fù)技術(shù)中的中試研究[D].成都：西南大學，2011.

[9]張雁秋，曹文平，劉莉，等.基質(zhì)對生態(tài)浮床凈化效果和大型水生植物生長的影響[J].徐州工程學院學報（自然科學版）， 2013，28（4）：18-23.

[10]V. V. Bogatov， T. V. Nikulina.Near-Bottom Water Eutrophication in Estuaries of Primorye， Russia[J].Russian Journal of Ecology， 2018， 49 （5）：456-458.

[11]Huyong Yan， Yu Huang， Guoyin Wang， et al. Water eutrophication evaluation based on rough set and petri nets： A case study in Xiangxi-River， Three Gorges Reservoir[J].Ecological Indicators， 2016， 69： 463-472.