一株高效降解羽毛廢棄物菌株的篩選及表達(dá)條件優(yōu)化

張鈺文 袁航 于江悅 馬曉曉 史超碩 李玉

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

羽毛中90%的蛋白是由富含半胱氨酸的β-角蛋白組成的，是重要的蛋白質(zhì)資源。由于β-角蛋白含有大量二硫鍵而難被降解，導(dǎo)致其無法直接被利用［1]。目前，羽毛廢棄物處理通常采用高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿和擠壓膨化等物理化學(xué)方法［2]，不僅破壞羽毛中重要的氨基酸，使某些氨基酸的消化率和利用率降低［3]，還造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［4]。因此，利用生物酶解法可使羽毛廢棄物的處理過程更加清潔、高效。

角蛋白酶（Keratinase，E.C 3.4.21/24/99.11）是細(xì)菌［5]、放線菌［6]和真菌［7]等微生物產(chǎn)生的一種金屬或絲氨酸蛋白酶［8-9]，可破壞角蛋白二硫鍵使其順利分解為氨基酸及多肽，從而提高角蛋白利用率。目前角蛋白酶生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶水平普遍偏低、發(fā)酵周期較長(zhǎng)、生產(chǎn)成本較高、研究技術(shù)不夠成熟［10]等問題，致使只有少數(shù)具備商業(yè)開發(fā)價(jià)值。因此，不斷篩選和優(yōu)化角蛋白酶生產(chǎn)菌株，降低生產(chǎn)成本，對(duì)實(shí)現(xiàn)角蛋白酶的工業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

本研究從全國(guó)5個(gè)不同地方的豬、羊圈土壤中篩選分離了一株降解羽毛的菌株，通過菌株形態(tài)特征觀察和16S rDNA序列分析法對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定，并克隆了角蛋白酶基因序列。在此基礎(chǔ)上，通過篩選信號(hào)肽來提高角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，旨為探索信號(hào)肽與靶蛋白表達(dá)效率之間的關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于實(shí)現(xiàn)重組角蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣 來自新疆、河南、內(nèi)蒙古、河北、山東地區(qū)的羊圈或豬圈的土壤。羽毛：來自寧夏好水川養(yǎng)殖有限公司。菌株與質(zhì)粒：B.subtilisWB600和質(zhì)粒pWB980均由本實(shí)驗(yàn)室保存。試劑與培養(yǎng)基：DNA限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA片段純化回收試劑盒、DNA片段切膠回收試劑盒，購自O(shè)MEGA公司。

1.1.2 LB培養(yǎng)基 1.0%蛋白胨、0.5%酵母粉、1.0%NaCl、2.0%瓊脂粉；富集培養(yǎng)基：0.3%牛肉膏、1.0%蛋白胨、0.5% NaCl、pH自然；牛奶培養(yǎng)基：1.0%蛋白胨、1.0% NaCl、0.5%酵母粉、1.5%脫脂牛奶、2.0%瓊脂粉；羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基：1%羽毛粉、0.05% KH2PO4、0.12% K2HPO4、0.05% NaCl、0.01%MgSO4、0.02% CaCl2、pH 7.5-8.0；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：2.0%蛋白胨、1.0%酵母粉、1.0%葡萄糖、0.3%KH2PO4、0.6% Na2HPO4、0.03% MgSO4、pH 7.5。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)角蛋白酶菌株的篩選 稱取1 g土壤放入富集培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h。吸取5 mL上述菌懸液梯度稀釋至10-8，每個(gè)稀釋度取100 μL涂布至牛奶平板，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d。挑出產(chǎn)透明圈的單菌落，并進(jìn)行多次傳代培養(yǎng)。

挑取1個(gè)傳代純化多次的單菌落，接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min培養(yǎng)12 h后，按照2%的接種量，接種于100 mL羽毛粉發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、220 r/min中培養(yǎng)48 h，觀察羽毛降解情況并測(cè)其角蛋白酶酶活。

1.2.2 菌落和菌體形態(tài)觀察 將分離純化的菌株分別劃線于LB平板和牛奶平板中，37℃恒溫培養(yǎng)18-24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、顏色、菌落邊緣和表面質(zhì)地等特征。挑取單菌落，制片，革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的個(gè)體形態(tài)。

1.2.3 角蛋白酶活力的測(cè)定 本研究參照 Yamamura等［11]的測(cè)定方法，將發(fā)酵液4℃、12 000 r/min，離心 10 min，取 250 μL 粗酶液，加入 250 μL 0.05 mol/L Gly-NaOH緩沖液（pH 10.0）溶解1%的底物（角蛋白），60℃反應(yīng)10 min，加入500 μL 0.4 mol/L三氯乙酸溶液終止反應(yīng)（對(duì)照組先加入三氯乙酸）。12 000 r/min，離心 5 min，取上清 500 μL， 加 入2.5 mL 0.4 mol/L Na2CO3溶液和500 μL福林酚試劑（1∶2 V/V）混合，60℃顯色20 min。在波長(zhǎng)680 nm下檢測(cè)吸光值。

酶活力定義：1 g固體酶粉（或者1 mL液體酶），在60℃，pH 10.0條件下，1 min水解角蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以U/g（U/mL）表示。

酶活力的計(jì)算，得到測(cè)酶活的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=0.01x+0.000 7，R2=0.999 7酶活計(jì)算公式：

式中：X為樣品的酶活力，U/g（U/mL）；A為樣品平行試驗(yàn)的平均吸光度；K為吸光常數(shù)；1為反應(yīng)試劑的總體積（mL）；10為反應(yīng)時(shí)間10 min，以1 min計(jì)；n為稀釋倍數(shù)。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，以菌株M的基因組DNA作為模板，用16S rDNA保守序列的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'） 和 1 429R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，純化回收PCR產(chǎn)物并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取并下載相似性99%以上的序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5 角蛋白酶基因的獲取 將篩選得到的高效降解羽毛菌株的16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，初步判定其為芽孢桿菌屬，從 GenBank 中下載芽孢桿菌中的角蛋白酶基因序列，利用軟件 DNAMAN比對(duì)后，用引物設(shè)計(jì)軟件 Snapgene在其保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，上游引物引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物引入SphⅠ酶切位點(diǎn)。引物由蘇州金維智公司合成。

以試劑盒提取的菌株M基因組為模板，PCR擴(kuò)增角蛋白酶基因，純化PCR產(chǎn)物并測(cè)序，最終確定其為角蛋白酶基因kerK。

1.2.6 表達(dá)載體的構(gòu)建 利用在線工具SignalP 5.0 Serve（http ：//www. cbs.dtu.dk/services/Signa lP/） 對(duì)角蛋白酶基因kerK進(jìn)行分析，可知其自身帶有Sec途徑的信號(hào)肽，以基因組為模板，設(shè)計(jì)引物KE1-F（5'-CGCGGATCCCAGGCGGCAGGGAAATCA-3'）；KE1-R：（5'-CATGCATGCTAAAAAAACCGGCGGG GC-3'），利用PCR的方法獲得不含信號(hào)肽的角蛋白酶基因kerK-1，進(jìn)行純化回收。

角蛋白酶基因kerK經(jīng)PCR擴(kuò)增純化后，用BamHⅠ-SphⅠ雙酶切，回收，通過Solution Ⅰ連接酶連接到 pWB980 表達(dá)載體上，連接反應(yīng)體系為（20 μL）：pWB980 載體片段 6 μL，角蛋白酶基因kerK片段 4 μL，Solution Ⅰ 10 μL，16℃連接 6 h，轉(zhuǎn)化入B.subtilisWB600。

將含有信號(hào)肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW和SPNprE的質(zhì)粒進(jìn)行試劑盒回收。分別使用KpnI -BamHⅠ雙酶切回收信號(hào)肽片段；將信號(hào)肽片段、角蛋白酶kerK1基因通過SolutionⅠ連接酶連接到 pWB980 表達(dá)載體上，連接反應(yīng)體系為（20 μL）：pWB980載體片段6 μL，信號(hào)肽-角蛋白酶基因kerK1片段4 μL，SolutionⅠ 10 μL，16℃連接 6 h，轉(zhuǎn)化入B.subtilisWB600。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩與復(fù)篩

從不同土壤中，利用牛奶培養(yǎng)基篩選得到20株能夠產(chǎn)蛋白酶的菌株，它們均能有效的分解牛奶培養(yǎng)基中的酪蛋白成分。計(jì)算得到水解圈直徑與菌株直徑的比值初步判斷菌株水解蛋白的能力。

利用羽毛粉液體發(fā)酵培養(yǎng)基，將初篩得到的20株有較大水解圈的菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，48 h發(fā)酵后，觀察其羽毛降解情況，并以1.2.3的方法測(cè)定角蛋白酶活力。發(fā)現(xiàn)其中編號(hào)為M的菌株降解羽毛的效果最好，其酶活為21.98 U/mL，如圖1所示。將菌株M作為目的菌株，進(jìn)行下一步的研究。

圖1 20株菌的角蛋白酶活力

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及菌株鑒定

通過篩選獲得的菌株M，其在初篩平板上菌落為乳白色、邊緣不規(guī)則、扁平、表面光滑，挑起時(shí)較黏稠。革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)菌株M為革蘭氏陽性菌、短直桿狀、有芽孢，染色均勻（圖2），初步判斷其為芽孢桿菌（Bacillussp.）。

菌株M經(jīng)16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示其大小約1 500 bp，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)得分子量大小為1 463 bp。測(cè)得的16S rDNA的序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行相似性比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株基因序列與芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等幾株芽孢桿菌屬的16S rDNA同源性均達(dá)99%以上，系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖3所示，初步確定該菌為芽孢桿菌。

圖2 菌株M的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)特征

圖3 菌株M的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 角蛋白酶基因kerK及重組載體的構(gòu)建

以菌株M基因組為模板，PCR擴(kuò)增帶自身信號(hào)肽SPKerK的角蛋白酶基因（圖4），擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與B.amyloliquefaciensK11角蛋白酶基因（GenBank：KR868996.1）相似性達(dá)到了97.63%，將其命名為角蛋白酶基因kerK，按照1.2.6所述方法，構(gòu)建含有自身信號(hào)肽的重組菌株，命名該重組菌株為R1-KerK。

選取本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)堿性蛋白酶比較好的4個(gè)信號(hào)肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW與SPNprE，分別構(gòu)建重組 質(zhì) 粒 pWB980-SacB-kerK1、pWB980-DacB-kerK1、pWB980-YoaW-kerK1、pWB980-NprE-kerK1，并轉(zhuǎn)化入B. subtilisWB600，獲得重組菌株分別命名為R2-SacB，R3-DacB、R4-YoaW與R5-NprE。

圖4 角蛋白酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 重組菌株初篩

5株重組菌株R1-KerK、R2-SacB、R3-DacB、R4-YoaW與R5-NprE在牛奶平板上，37℃，培養(yǎng)18 h，觀察蛋白水解圈大小，如圖5所示，與對(duì)照A相比，5株重組菌株均產(chǎn)生水解圈，表明5株重組菌中角蛋白酶基因均已成功表達(dá)，其中重組菌株R3-DacB的HC值（透明圈直徑與菌落直徑的比值）最大，為4.5，可以初步認(rèn)為信號(hào)肽SPDacB最有利于角蛋白酶基因的表達(dá)。

2.5 發(fā)酵上清液的SDS-PAGE檢測(cè)

2.6 不同信號(hào)肽對(duì)角蛋白酶分泌的影響

5株重組菌株經(jīng)48 h搖瓶發(fā)酵，取發(fā)酵液上清測(cè)定角蛋白酶酶活（圖7），信號(hào)肽SPSacB、SPDacB、SPYoaW、SPNprE和SPKerK表達(dá)角蛋白酶水平相差較大。

圖5 重組菌株的初篩

將發(fā)酵48 h的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖6所示，從圖中可以看出5株重組菌上清液在相對(duì)分子質(zhì)量為39 kD左右均有蛋白條帶，與角蛋白酶相對(duì)分子質(zhì)量相符。說明5株重組菌株均能成功表達(dá)角蛋白酶，其中重組菌株R3-DacB的表達(dá)角蛋白酶量較高。重組菌株R1-KerK、R2-SacB、R4-YoaW、R5-NprE產(chǎn)角蛋白酶的酶活分別為68.15 U/mL、63.35 U/mL、18.35 U/mL和23.76 U/mL，其中重組菌株R3-DacB的酶活最高，達(dá)到了226.34 U/mL，為菌株M的10倍，是菌株R1-KerK的3.32倍。同時(shí)，利用不同菌株發(fā)酵降解羽毛，結(jié)果（圖8）顯示重組菌株R3-DacB完全降解羽毛的時(shí)間最短，相較于初始菌株M縮短了12 h。以上結(jié)果表明，信號(hào)肽對(duì)角蛋白酶的分泌表達(dá)有一定的影響，信號(hào)肽DacB能夠明顯提高角蛋白酶的表達(dá)活性。

圖6 不同重組菌株表達(dá)角蛋白酶的SDS-PAGE分析

圖7 重組菌株角蛋白酶酶活分析

3 討論

圖8 羽毛降解效果對(duì)比

羽羽毛廢棄物是家禽屠宰場(chǎng)中產(chǎn)量最高的自然角質(zhì)材料。根據(jù)調(diào)查，全世界羽毛廢棄物的日積累量約為5×106萬t，是巨大的資源庫，同時(shí)大量的廢棄物堆積也造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。生物降解是最合理的處理方式，角蛋白酶是生物降解羽毛的關(guān)鍵酶，目前羽毛角蛋白降解菌的研究主要集中在細(xì)菌、真菌和放線菌。侯燕燕等［12]在新疆天然鹽堿地土壤中篩選出一 株高產(chǎn)角蛋白酶的耐鹽菌Bacillussp. K-18，其發(fā)酵液的角蛋白酶活力為96.7 U/mL。劉柏宏［13]篩選出一株地衣芽孢桿菌，通過對(duì)宿主菌株、調(diào)控元件及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化，使角蛋白酶酶活比初篩菌株酶活提高了5倍。耿秀秀等［14]從新疆戈壁沙漠中篩選出一株能夠降解羽毛的戈壁異常球菌（Deinococcus gobiensis），成功構(gòu)建了表達(dá)角蛋白酶Dgker的重組菌株E.colipET22b-Dgker/BL21，其能夠在3 d內(nèi)完全降解羽毛。孫蓉等［15]篩選得到一株高效降解羽毛的菌株Bacillus subtilisBS10，并且以羽毛粉為底物測(cè)定酶活力，為（1.88±0.10）U/mL。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)篩選到的芽孢桿菌上的角蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)后其角蛋白酶酶活比初篩菌株提高了2.10倍。信號(hào)肽在蛋白質(zhì)分泌中起到的重要作用，陳景奇［16]通過篩選比較了6種信號(hào)肽，信號(hào)肽SPNprE使α-淀粉酶AmyLM2，酶活達(dá)到260 U/mL，為其自身信號(hào)肽的1.79倍。Guan等［17]篩選了19個(gè)Sec分泌途徑的信號(hào)肽，最終獲得SPYncM，使氨基肽酶的分泌效率比原始信號(hào)肽提高了1.2倍。本實(shí)驗(yàn)通過篩選比較了5種信號(hào)肽，信號(hào)肽SPDacB使角蛋白酶酶活達(dá)到226.34 U/mL，是自身信號(hào)肽SPKerK的3.32倍。研究表明，信號(hào)肽之所以能影響酶的分泌表達(dá)，可能是由于它的N區(qū)及疏水H區(qū)電荷分布的影響，還可能是由于信號(hào)肽N區(qū)稀有密碼子的缺失，從而增強(qiáng)酶的分泌表達(dá)［18]，H區(qū)疏水性殘基與信號(hào)肽其他區(qū)域相互作用也能夠影響酶的分泌［19]。同時(shí)很多實(shí)驗(yàn)表明信號(hào)肽的篩選能夠有效地提高目的蛋白的表達(dá)量，但到目前為止，最佳的信號(hào)肽仍無法預(yù)測(cè)，只能通過大量的篩選來確定目的蛋白的最佳信號(hào)肽。在未來的研究中，可在分子層面對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行進(jìn)一步改造，也可通過研究枯草芽孢桿菌分泌途徑的機(jī)制或影響分泌的其他因素，不斷提高角蛋白酶分泌表達(dá)量，以達(dá)到能夠工業(yè)化應(yīng)用的目的［20]。

4 結(jié)論

本研究以羽毛為唯一碳源，從自然界中篩選到20株產(chǎn)角蛋白酶菌株，初篩獲得的菌株接種到含有羽毛粉的復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵篩選，最終獲得對(duì)羽毛降解能力較強(qiáng)的菌株M，其酶活為21.98 U/mL。通過形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹，經(jīng)鑒定該菌株為芽孢桿菌（Bacillussp.）。克隆其角蛋白酶基因kerK，并進(jìn)行信號(hào)肽的篩選比較，成功在B. subtilisWB600中構(gòu)建重組菌株，發(fā)酵48 h，重組菌株R3-DacB發(fā)酵48 h時(shí)，發(fā)酵上清粗酶液中角蛋白酶活力為226.34 U/mL，是自身信號(hào)肽SPKerK的3.32倍。