藥用植物毛狀根研究體系及應用方向△

朱智慧，晁二昆，錢廣濤，孫偉，薛建平*，師玉華，3*

1.淮北師范大學 生命科學學院，安徽 淮北 235000；2.中國中醫(yī)科學院 中藥研究所，北京 100700；3.中國中醫(yī)科學院 青蒿素研究中心，北京 100700

藥用植物在植物資源中占據(jù)了相當重要的地位，是中醫(yī)藥傳承和發(fā)展的物質基礎和寶貴財富，有著巨大的市場潛力。我國藥用植物種類繁多，《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草綱目》等古籍中記載了大量藥用植物發(fā)現(xiàn)和使用的歷史。藥用植物中產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物包括生物堿、萜類、黃酮類、有機酸、木質素等，具有很好的藥用或保健價值，因此市場需求量非常大。如黃花蒿Artemisiaannua中的青蒿素，是治療瘧疾的一線藥物，已在全球范圍內使用并挽救了數(shù)百萬人的性命。然而，藥用植物中的天然次生代謝產(chǎn)物含量一般較低，合成不穩(wěn)定，且由于長期開發(fā)利用，野生藥用資源破壞嚴重，導致可持續(xù)利用的資源日趨減少，有些珍稀物種甚至瀕臨滅絕，因此亟需尋求有效的可持續(xù)植物天然產(chǎn)物合成手段[1]。

毛狀根(hairy roots)又稱發(fā)狀根，是指利用發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriomrhizogenes侵染植物后，其Ri質粒的轉移脫氧核糖核酸(T-DNA)區(qū)整合進植物細胞核基因組，誘導植物細胞產(chǎn)生的一種冠癭組織[2]。早在1982年，Chilton等[3]就報道利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物能夠產(chǎn)生毛狀根。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌能侵染并誘導幾乎所有的雙子葉植物、少數(shù)單子葉植物以及個別裸子植物產(chǎn)生毛狀根。與傳統(tǒng)植物栽培、組織培養(yǎng)等技術相比，毛狀根培養(yǎng)具有激素自主性、生長周期短、次生代謝成分積累能力強且穩(wěn)定、能合成新化合物、生長繁殖能力快等優(yōu)點，因此被廣泛應用于藥用植物的基礎研究和應用領域[4]。

1 藥用植物毛狀根研究體系

藥用植物毛狀根研究體系是利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導藥用植物產(chǎn)生毛狀根，研究藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、基因功能驗證和種質資源改良與繁育等的方法體系，是藥用植物分子遺傳學研究的重要手段之一[5]。本文從藥用植物毛狀根的誘導方法、影響毛狀根誘導的主要因素和毛狀根的鑒定方法等方面系統(tǒng)介紹了藥用植物的毛狀根研究體系(圖1)，為藥用植物的毛狀根誘導研究提供參考。

1.1 毛狀根的誘導方法

不同藥用植物，選擇的毛狀根誘導方式也不盡相同。根據(jù)轉化受體的不同，毛狀根的誘導方法分為：外植體共培養(yǎng)法、直接感染法和原生質體共培養(yǎng)法。在實際應用中以外植體共培養(yǎng)法為主，主要步驟分為：1)外植體的準備。外植體的選擇對于藥用植物的毛狀根誘導至關重要。同一藥用植物的不同部位與不同植物的相同部位誘發(fā)毛狀根的頻率均有差異。一般來說，在誘導毛狀根的過程中，采用幼嫩的葉片、莖或葉柄作為外植體組織進行轉化。2)農(nóng)桿菌的侵染。Ri農(nóng)桿菌的類型和菌的活力是毛狀根誘導效率的重要影響因素。轉化時，選擇適合藥用植物的Ri農(nóng)桿菌類型，并將保存好的菌株在固體培養(yǎng)基上活化2次，隨后轉接至液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌吸收度A600值為0.5左右，以確保菌的活力，再用MS培養(yǎng)基懸浮菌體至適宜的吸收度A600值(根據(jù)不同藥用植物，0.1～0.5不等)，然后再用活化好的農(nóng)桿菌懸浮液浸染準備好的無菌的外植體15～20 min。3)共培養(yǎng)。將浸染后的外植體吹干，放置在共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于25 ℃黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)2～3 d。4)除菌誘導培養(yǎng)。將共培養(yǎng)后的外植體移至除菌誘導培養(yǎng)基上(MS+400 mg·L-1頭孢霉素)，每2周更換一次培養(yǎng)基，一般藥用植物大約2～4周即可觀察到毛狀根的產(chǎn)生。5)毛狀根的擴繁：待誘導出的毛狀根長至2 cm左右，剪取生長狀態(tài)良好的毛狀根于液體MS培養(yǎng)基中，25 ℃，120 r·min-1搖床中擴繁，約每10 d收集繼代一次。丹參Salviamiltiorrhiza[6]、冬凌草Rabdosiarubescens[7]等藥用植物毛狀根誘導均采用該方法。此外，直接注射法是將發(fā)根農(nóng)桿菌直接注射活體無菌苗的莖、葉或者感染其傷口后誘導毛狀根，如何首烏Fallopiamultiflora[8]。與外植體共培養(yǎng)法相比，直接感染法易操作更簡單，但其誘導率相對較低。同時也有些藥用植物采用原生質體共培養(yǎng)的方法誘導毛狀根，如胡誠等[9]用纖維素酶和果膠酶處理人參Panaxginseng根愈傷組織獲取原生質體，并使用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染共培養(yǎng)后得到人參毛狀根。

圖1 藥用植物毛狀根研究體系

1.2 影響毛狀根形成的因素

毛狀根的誘導是一個連續(xù)的過程，不同的外植體、菌株、誘導部位、培養(yǎng)基以及誘導方法對毛狀根的產(chǎn)生和誘導效率均有影響[10]。

1.2.1 外植體類型 不同藥用植物毛狀根的誘導效率不同。雙子葉植物被認為是農(nóng)桿菌的傳統(tǒng)受體，因此在發(fā)根農(nóng)桿菌誘導植物產(chǎn)生毛狀根中雙子葉植物占多數(shù)。由于宿主因素限制，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的單子葉植物和裸子植物起步晚，所以單子葉植物和裸子植物占少數(shù)。大部分的雙子葉藥用植物如人參、丹參、菘藍Isatisindigotica、西洋參Panaxquinquefolius、黃花蒿和長春花Catharanthusroseus等均能成功誘導毛狀根[11]；單子葉藥用植物中的石斛Dendrobiumnobile、水母雪蓮Saussureamedusa、露水草Cyanotisarachnoidea、栝樓Trichosantheskirilowii等和裸子植物的短葉紅豆杉、紅豆杉、銀杏等也均有毛狀根的研究報道。另外，同一種植物不同部位分化出毛狀根的頻率也不同。如苦蕎Fagopyrumtataricum毛狀根誘導過程中子葉分化出毛狀根的頻率明顯高于下胚軸。幼嫩的外植體細胞處于旺盛的分裂狀態(tài)，更易接受外源DNA，因此外植體一般選擇苗期的幼嫩組織。

1.2.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的類型與活力 農(nóng)桿菌誘導毛狀根產(chǎn)生的能力與菌中的Ri質粒類型有關。Ri質粒將發(fā)根農(nóng)桿菌主要分為四類：黃瓜堿型、甘露堿型、農(nóng)桿堿型、米奇矛型。不同發(fā)根農(nóng)桿菌對植物誘導毛狀根的能力也是大不相同的。有研究利用5種發(fā)根農(nóng)桿菌(ATCC31798、ATCC43057、AR12、A4和A13)誘導黃金果Solanummammosum，雖均有毛狀根的產(chǎn)生，但AR12和A13誘導產(chǎn)生毛狀根最早，A4和A13誘導率最高[12]。目前主要采用的發(fā)根農(nóng)桿菌主要有ACCC10060、R1000、R1500、1855、8196、R1601、LBA9402和R1200等。此外，發(fā)根農(nóng)桿菌的活性與浸染時菌液的濃度(吸收度A600值)對毛狀根的轉化效率也有著很大影響。

1.2.3 轉化過程及培養(yǎng)條件 毛狀根的每一個轉化過程都對其轉化效率具有一定影響。研究表明，外植體的預培養(yǎng)可促進細胞分裂，提高外源基因的瞬時表達和轉化率，對外植體起到馴化作用。同時預培養(yǎng)可使外植體提前適應離體條件的培養(yǎng)。不同預培養(yǎng)時間也存在一定的差異[12]。外植體經(jīng)預培養(yǎng)達到最佳狀態(tài)可提高轉化效率，但時間過長并不利于農(nóng)桿菌的感染。另外，超聲輔助、共培養(yǎng)時間、外源誘導物乙酰丁香酮(Acetosyringone)、抗生素的濃度等均影響毛狀根的誘導效率[13-16]。物理因素如光照、培養(yǎng)溫度、pH值等也是影響毛狀根形成的因素之一。因此，實際應用中只有結合藥用植物的自身特點，優(yōu)化轉化過程中的眾多因素，才能摸索出植物最佳的毛狀根誘導體系。

1.3 藥用植物毛狀根的鑒定

經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物產(chǎn)生的毛狀根均由一個細胞發(fā)育而來，具有很強的遺傳穩(wěn)定性。鑒定毛狀根是否由發(fā)根農(nóng)桿菌感染后產(chǎn)生，方法主要由形態(tài)鑒定、抗性鑒定、基因鑒定和報告基因鑒定。

1.3.1 形態(tài)學鑒定 毛狀根與正常植物根系在形態(tài)上有明顯的差異。首先，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染產(chǎn)生的毛狀根可在無激素的培養(yǎng)基上迅速生長，呈白色并具有白色絨毛、多根毛、多分枝和失去向地性等正常根系不具有的特點，其次毛狀根在液體培養(yǎng)基中生長速度大于正常根。這些特殊的形態(tài)為鑒別毛狀根提供了有力的依據(jù)。

1.3.2 抗性篩選 若Ri質粒上攜帶有外源抗性基因，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌介導轉化植物后會產(chǎn)生帶抗性的毛狀根，則可通過在毛狀根誘導培養(yǎng)基中添加一定濃度的抗生素來篩選陽性毛狀根。目前常用于植物遺傳轉化載體中的抗性基因有卡那霉素(kanamycin)和潮霉素(hygromycin)等。

1.3.3 報告基因檢測 為了更為直觀、快速地鑒定毛狀根，研究人員在Ri質粒的T-DNA區(qū)插入GFP、GUS等報告基因，這樣可以直接通過觀察熒光、GUS染色反應等來鑒定陽性的毛狀根，可用于陽性毛狀根的早期鑒定[17]。

1.3.4 基因鑒定 提取毛狀根基因組DNA，設計特異引物，通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增Ri質粒中的冠癭堿合成基因，或者外源基因、目的基因和報告基因，然后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察目標DNA片段，直接從基因水平鑒定陽性的毛狀根。

2 藥用植物毛狀根的應用

目前，能夠成功誘導毛狀根的藥用植物已不下百種。毛狀根研究體系已經(jīng)被廣泛應用在藥用植物的次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)、基因功能驗證和種質資源改良與繁育等方面。

2.1 次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)

植物次生代謝產(chǎn)物是由植物次生代謝產(chǎn)生的一類非植物生長發(fā)育所必需的小分子有機化合物。藥用植物中次生代謝產(chǎn)物種類繁多，是天然藥物和化工原料的重要來源，有著重要的藥用價值和經(jīng)濟價值。當前研究發(fā)現(xiàn)的次生代謝產(chǎn)物有生物堿、萜類、苯丙素類、醌類、黃酮類、鞣質類、甾體及其苷類[18]。目前，藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的幾種主要途徑有：植物提取、化學合成、微生物發(fā)酵、植物組織和細胞培養(yǎng)以及基因工程等[19]。毛狀根的培養(yǎng)是一種在80年代發(fā)展起來的基因工程和細胞工程相結合的技術，具有生長迅速、周期短、激素自主、遺傳穩(wěn)定性強且具有完整的代謝通路等優(yōu)勢，已經(jīng)發(fā)展成為高效、穩(wěn)定的藥用植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)手段。目前，利用毛狀根體系已經(jīng)實現(xiàn)多種具有藥用價值的次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，如黃酮類、生物堿類、蒽醌類、皂苷類、萜類等(表1)。

提高藥用植物毛狀根中次生代謝產(chǎn)物含量的途徑主要有兩種：一方面可通過改變毛狀根培養(yǎng)的外在因子，有效刺激其體內次生代謝產(chǎn)物的積累。植物產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物本身就是為了抵御外界環(huán)境，因此通過改變毛狀根培養(yǎng)的光、溫、pH等環(huán)境因子、添加植物激素及內生菌、改變培養(yǎng)基配方等均可有效促進藥用植物毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累。王瑜等[20]研究發(fā)現(xiàn)利用水楊酸、茉莉酸甲酯、酵母提取物3種生物誘導子對王不留行Vaccariasegetalis毛狀根進行處理，能夠明顯促進其黃酮苷的產(chǎn)生；三七Panaxnotoginseng毛狀根中含有大量三七皂苷，在24 ℃條件下培養(yǎng)，皂苷產(chǎn)量值最大[21]；在決明Cassiatora毛狀根的培養(yǎng)基中添加0.05% NAA可使5種蒽醌類化合物的總和提高4倍，并且黑曲霉和茉莉酸誘導子均可促進蒽醌類化合物的形成[22]。另一方面調控毛狀根內在遺傳因素，將毛狀根技術和基因重組技術聯(lián)用，在Ri質粒中引入外源基因，通過激活目標產(chǎn)物代謝流或者抑制非藥用成分合成的通路，增加毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成效率。例如在藥用植物虎杖Polygonumcuspidatum中，構建白藜蘆醇合酶(Resveratrol Synthase，RS)基因的過表達載體，其轉基因毛狀根中的白藜蘆醇含量顯著提高，是對照組的4倍[23]；轉化甘草鯊烯合成酶基因后的甘草Glycyrrhizauralensis毛狀根比野生型中甘草酸含量提高3.6倍[24]；將嗜酸菌Ralstoniaeutropha中提取的3個基因導入甜菜Betavulgaris毛狀根基因組，可促進其聚3-羥基丁酸酯的積累[25]。

表1 藥用植物毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物

毛狀根的大規(guī)模生產(chǎn)使其成為生產(chǎn)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的一種有效途徑。1986年，Rhodes等[26]首次利用簡易的噴氣式容器培養(yǎng)毛狀根，為利用毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物奠定了工業(yè)化基礎。隨著生物反應器的發(fā)展，用于毛狀根擴大培養(yǎng)的生物反應器主要有氣升式反應器、氣泡柱反應器、攪拌槽反應器、滴流床反應器、營養(yǎng)霧反應器、噴霧反應器等，為生產(chǎn)不同代謝產(chǎn)物的多種藥用植物毛狀根的擴大培養(yǎng)奠定了基礎。據(jù)Khan等[27]統(tǒng)計，有長春花、人參、丹參、紫草Lithospermumerythrorhizon、西洋參、甜菜、黃花蒿、甘草、黃芪Scutellarialateriflora、印度苦楝Azadirachtaindica等30多種藥用植物用于擴大培養(yǎng)的研究與工藝改良。藥用植物毛狀根技術在次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)中的成功應用和規(guī)模量產(chǎn)為提供可持續(xù)利用的植物天然產(chǎn)物提供了技術支撐。

2.2 藥用植物基因功能驗證

毛狀根體系作為常用的天然植物遺傳轉化體系之一，具有遺傳穩(wěn)定，生長條件可控等優(yōu)勢，是藥用植物基因功能驗證和基礎研究的理想平臺之一。以藥用植物丹參為例，丹參酮是具有顯著藥理活性的二萜化合物，成熟的毛狀根體系在研究丹參酮生物合成途徑的關鍵基因和解析其代謝通路中發(fā)揮了重要的作用，也使得丹參成為藥用植物的模式研究物種之一[40]。例如在轉錄水平研究上：Guo等[41]在銀離子Ag+處理的丹參毛狀根轉錄組中篩選出6個CYP450，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)CYP76AH1能夠催化次丹參酮二烯合成鐵銹醇；高偉等[42]組合酵母提取物和Ag+誘導丹參毛狀根，結合代謝組和轉錄組研究了丹參酮類有效成分形成的分子機制和候選基因的發(fā)掘，發(fā)現(xiàn)70個轉錄因子參與了應激反應，有8個CYP450可能參與丹參酮下游的生物合成。在關鍵酶基因功能驗證研究中：Cheng等[43]利用RNAi干擾技術在丹參毛狀根中減低SmCPS(copalyldiphosphate synthase)的表達，導致丹參酮水平降低，證實了SmCPS是丹參酮生物合成的關鍵酶基因；Ma等[44]在丹參毛狀根中沉默CYP76AH1，證實該基因在丹參酮生物合成中起關鍵作用，豐富了丹參酮的合成與調控機制研究。此外，SmDXR[45]、SmJAZ8[46]、SmMYB9b[47]等基因的功能也在丹參毛狀根中被成功驗證。近幾年以毛狀根作為研究體系研究基因功能與分子機制的藥用植物還有何首烏、苦蕎、硬紫草、顛茄、甘草、北柴胡等[48]。例如：朱寬鵬[49]在何首烏毛狀根體系中過表達和RNAi技術研究芪合酶基因(FmSTS)，結果表明二苯乙烯苷含量差異較大，證實FmSTS是二苯乙烯苷合成代謝的主要合成酶基因；張棟等[29]在紅光和藍光處理苦蕎苗中發(fā)現(xiàn)MYB家族轉錄因子FtMYB116，將其轉入苦蕎毛狀根后發(fā)現(xiàn)蘆丁和槲皮素積累顯著增加。毛狀根體系出現(xiàn)成為研究基因功能和分子機制的熱點。因此，毛狀根技術為在藥用植物功能研究與次生代謝產(chǎn)物合成調控機制解析提供了有效的遺傳轉化手段，為藥用植物分子遺傳學的深入研究奠定了基礎。

2.3 藥用種質資源改良與繁育

藥用植物次生代謝產(chǎn)物豐富，但往往含量較低，不能滿足市場日益劇增的需求。因此，高藥效成分的藥用植物品種改良迫在眉睫。毛狀根由于其具有很強的再生能力且遺傳穩(wěn)定，為培育高藥效物質藥用植物品種提供了一種新方法。目前，能夠通過毛狀根再生出植株的藥用植物有長春花、香石竹、藍豬耳、雪蓮、白英、紫蘇、魔芋、蕺菜、桔梗、板藍根等。因此，可利用基因工程技術獲得目標代謝產(chǎn)物高的毛狀根，進而通過毛狀根再生體系，培育優(yōu)質藥用植物新品種。例如，長春花可以產(chǎn)生100多種具有很高藥用價值的萜類吲哚生物堿，龔一富等[11]建立長春花毛狀根再生植株快速繁育體系，篩選獲得的長春花毛狀根再生植株可促進抗癌生物堿的合成，此方法加速了長春花的品種改良；木本曼陀羅是莨菪烷類生物堿的資源植物，經(jīng)基因技術改造后由曼陀羅毛狀根再生植株的莨菪堿和東莨菪堿含量高于自然生長中的木本曼陀羅[50]；白英作為一種抗癌中草藥，能夠產(chǎn)生一種重要的藥用成分薯蕷皂苷元，白英的毛狀根和毛狀根分化的再生植株中薯蕷皂苷元均有提高[51]；北玄參以根入藥，富含許多天然生物活性物質，同樣可誘導毛狀根產(chǎn)生再生植株[52]。因此，利用基因工程技術改造后的毛狀根再生植株表現(xiàn)出的高產(chǎn)和優(yōu)質性狀，對培育藥用植物新品種具有重大意義。另外，毛狀根根尖繁殖力強，生長迅速，可在短時間內獲得大量遺傳性一致的再生植株，也被用于藥用植物的種質快繁與保存。一些生長周期較長的藥用木本植物如丹參，木本曼陀羅、茶樹等也可通過毛狀根獲得再生植株[7，51，53]。此外，也有研究報道用海藻酸鈉凝膠包裹辣根Armoraciarusticana毛狀根切段可制成人工種子，用于種質保存[54]。

3 展望

我國藥用植物資源豐富，是天然藥物的重要原料來源。然而，藥用植物的基因研究起步較晚，很多藥效成分物質的合成途徑和調控機制尚不清晰，制約了藥用植物資源的可持續(xù)發(fā)展。毛狀根轉化系統(tǒng)因其具有遺傳穩(wěn)定、生長迅速、激素自養(yǎng)、可有效提高藥用活性成分含量等優(yōu)勢，在藥用植物的基因功能研究和藥用活性成分生產(chǎn)方面有著巨大的應用潛力。

3.1 藥用植物基因功能研究

隨著本草基因組學的發(fā)展，人參、三七、罌粟、穿心蓮、丹參等一些重要的中草藥基因組陸續(xù)發(fā)布[55]，藥用植物的基因組、轉錄組、代謝組、蛋白組等組學信息得到極大豐富，為藥用植物的分子遺傳學研究提供了契機[56]。如何綜合利用好組學數(shù)據(jù)，深入挖掘藥用植物的次生代謝產(chǎn)物合成與調控、抗性機制等成為藥用植物分子遺傳學研究的核心問題[5]。遺傳轉化技術是植物基因功能研究和驗證的重要技術之一。由于很多藥用植物的植株再生技術不盡成熟，由根瘤農(nóng)桿菌Ti介導的植株轉化技術在藥用植物上的應用較少，而由發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質粒介導的毛狀根技術在藥用植物研究應用中較多，是目前藥用植物轉基因功能研究的主要技術之一。解析與藥用活性成分合成密切相關的代謝途徑是藥用植物基礎研究的熱點，毛狀根轉化體系作為藥用植物基因功能驗證的重要手段之一，在解析藥用活性成分合成中的關鍵酶、代謝通路以及其調控機制研究中發(fā)揮重要作用。

3.2 藥用活性成分生產(chǎn)

植物天然產(chǎn)物市場需求日益增長，現(xiàn)有藥用植物資源已經(jīng)供不應求，且藥用植物中的次生代謝產(chǎn)物的含量往往偏低，難以滿足工業(yè)化的需求。毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)因其是天然植物系統(tǒng)，是次生代謝產(chǎn)物合成的天然工廠，已經(jīng)成功用于多種次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。日前，研究人員利用植物代謝工程，即通過基因工程的技術，改變植物代謝流甚至重構新的代謝途徑，從而提高植物中目標藥效成分物質的含量。例如近期的研究中，德國多特蒙德技術大學的研究人員Jansing等[57]就利用CRISPR/Cas9基因編輯技術敲除煙草中的6個糖基轉移酶基因，使其尼古丁含量減少99.7%。因此，隨著藥用植物次生代謝生物合成和調控機制研究的深入和毛狀根培養(yǎng)生物反應器的日益成熟，綜合運用代謝工程和外在因子誘導技術，毛狀根有望成為次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)“工廠”，用于藥用植物活性成分的大規(guī)模生產(chǎn)，這不僅能夠有效緩解天然產(chǎn)物的市場供求壓力，且對藥用植物資源的可持續(xù)利用具有深遠意義。