γ分泌酶抑制劑DAPT對過敏性鼻炎小鼠模型的影響及作用機(jī)制

劉亮亮，祝 康，夏 翠，莊鵬暉，鄭國璽，王正輝

過敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是發(fā)生在鼻黏膜的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病,是鼻炎中最常見的類型。其發(fā)病機(jī)制涉及大量細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，是多因素多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。有研究證實(shí):AR患者體內(nèi)存在龐大的細(xì)胞因子、黏附分子和炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生長、代謝、增殖和凋亡等功能活動，其中Th1和Th2細(xì)胞間因子的失衡變化是引起和影響過敏性鼻炎發(fā)生發(fā)展的生理學(xué)基礎(chǔ)[1],且細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)生成和釋放與輔助性T淋巴細(xì)胞的分化方向有關(guān)[2]。研究表明Notch是一條影響細(xì)胞命運(yùn)的、保守而重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，參與多種組織細(xì)胞的信號識別、增殖、分化和凋亡等活動，尤其在T細(xì)胞的發(fā)育和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。γ-分泌酶抑制劑DAPT可以通過阻止Notch胞內(nèi)區(qū)(intracellular domain of notch，ICN)釋放至核內(nèi)，有效地治療由Notch信號調(diào)節(jié)的疾病。γ分泌酶抑制劑DAPT可能作為宮頸癌[3]和阿爾茨海默病新的治療手段曾受到廣泛關(guān)注[4]。本實(shí)驗(yàn)通過建立過敏性鼻炎小鼠模型，以 Notch 受體為靶點(diǎn)，研究DAPT對過敏性鼻炎小鼠的影響，進(jìn)一步通過測定Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子，闡明其可能的作用機(jī)制，為過敏性鼻炎尋求新的藥物治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

7～8周齡的SPF級BALB/c小鼠32只，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，購買于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心的SPF級實(shí)驗(yàn)室，并按照中心管理規(guī)定飼養(yǎng)動物。飼養(yǎng)條件為25 ℃恒溫，無特殊病原體(SPF)級層流室，每天光照和黑暗時(shí)間為1∶1交替，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料(SPF級的固體飼料)及飲水。

1.2 試劑

高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf)，卵清蛋白(Sigma)、氫氧化鈉鋁(天津市無力化學(xué)試劑有限公司)，DAPT(Sigma Aldrich),DMSO(Sigma)，小鼠IL-4和IFN-γ Elisa試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司)。

1.3 主要溶液配制

PBS溶液：將 PBS 干粉一包溶解在900 ml 三蒸水中，用HCl調(diào)節(jié)pH值(7.2～7.4)，加入三蒸水至1 000 ml，用一次性濾器過濾，分裝200 ml/瓶，4 ℃保存。

卵清蛋白混懸液：(1)腹腔注射液：卵清蛋白(ovalbumin,OVA)250 μg，氫氧化鋁25 mg，溶于10 ml PBS中，配置成pH 7.4的OVA混懸液，每只小鼠腹腔注射0.4 ml/次。(2)鼻部激發(fā)液：OVA 100 mg溶于10 ml PBS中，滴鼻10 μl/側(cè)/次/只。

DMSO混懸液：取純DMSO液體5 ml溶解到已配制好的 PBS水中，使其終濃度為5 μmol/L混勻待用，使用前15 min內(nèi)配置。

DAPT混懸液：取100 ml已配好的DMSO溶液，加入使DMSO終濃度為5 μmol/L的DAPT，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4 實(shí)驗(yàn)小鼠分組和處理

采用隨機(jī)對照原則將BALB/c小鼠等分成4組，分別為過敏性鼻炎模型組、對照組、DMSO組、DAPT組。致敏階段：模型組小鼠第1、5、9、12天腹腔注射OVA混懸液0.4 ml/只;對照組采用PBS，其注射部位和劑量同與模型組。激發(fā)階段：第13～20天，用含10%OVA的PBS溶液滴鼻，每天10 μl/側(cè)。小鼠出現(xiàn)流鼻涕、打噴嚏、撓鼻子為陽性反應(yīng)；對照組用等量的PBS滴鼻，方法同模型組。DMSO組和DAPT組小鼠在每次處理前(致敏和激發(fā)階段)30 min腹腔注射DMSO和DAPT混懸液0.4 ml，其余處理方法同模型組。最后一次激發(fā)后12 h收集四組小鼠標(biāo)本。

1.5 臨床癥狀觀察評定指標(biāo)

造模第一天開始觀察小鼠行為、狀態(tài)、體征、攝食、飲水、大小便、體質(zhì)量，每次激發(fā)后觀察并記錄30 min內(nèi)小鼠鼻涕量、噴嚏及撓鼻的次數(shù)。采用疊加法計(jì)算總分，總分大于5分為造模成功(表1)。

表1 小鼠癥狀分析評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria for symptom analysis in mice

1.6 Elisa檢測不同組小鼠外周血清IgE及血清和鼻腔盥洗液上清中IL-4、IFN-γ含量

按照Elisa試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測定后計(jì)算各組IgE、IL-4及IFN-γ的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠鼻部臨床癥狀評定結(jié)果及記分統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)前四組小鼠體重、外觀、行為以及對刺激的反應(yīng)活動均無明顯的差異。模型組小鼠于激發(fā)第3天開始每次激發(fā)后出現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)的躁動、打噴嚏、抓耳撓鼻端兩側(cè)等癥狀，清水樣鼻涕較多，20 min后逐漸好轉(zhuǎn)。隨著激發(fā)次數(shù)的增加，上述癥狀逐漸加重，并出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍和精神不振。模型組小鼠在

最后一次激發(fā)后30 min內(nèi)的癥狀記錄評分都大于5分。對照組和DMSO組僅有輕度的抓鼻，且噴嚏少，無流涕，評分均小于5分，30 min內(nèi)的撓鼻、打噴嚏次數(shù)在激發(fā)后顯著低于模型組。DAPT組小鼠的癥狀介于兩者之間，評分均小于3分(表2)。

2.2 鼻黏膜病理結(jié)果

模型組小鼠鼻黏膜上皮脫落、壞死而不連續(xù)，纖毛排列紊亂，炎細(xì)胞浸潤明顯，組織間隙出血、腺體增生、腫脹，杯狀細(xì)胞增生，黏膜表面分泌物增多，鼻黏膜下組織間質(zhì)充血水腫，小血管擴(kuò)張。對照組小鼠鼻黏膜纖毛上皮完整光滑、無斷裂，未見明顯的炎性細(xì)胞浸潤。DAPT組小鼠鼻黏膜較模型組小鼠有明顯的改善，組織間隙炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，腺體輕度增生，黏膜上皮部分脫落、壞死，纖毛光滑不連續(xù)，黏膜表面可見少量分泌物。DMSO組小鼠鼻黏膜組織病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與模型組相似(圖1)。

表2 各組小鼠癥狀記分、撓鼻、打噴嚏次數(shù)比較Table 2 Comparison of the number of scratching andsneezing in each group n=8)

2.3 各組小鼠外周血血清IgE表達(dá)

DAPT組小鼠外周血血清IgE表達(dá)量(6.741 2±0.52)ng/ml，較模型組(12.132 7±0.50)ng/ml明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組(6.007 7±0.91)ng/ml比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而DMSO組小鼠IgE的表達(dá)量(12.073 8±1.30)ng/ml與模型組相近(P>0.05)，與對照組和DAPT組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

2.4 各組小鼠IL-4表達(dá)

模型組小鼠鼻腔盥洗液和外周血血清IL-4表達(dá)量較其余各組升高，與DAPT組和對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與DMSO組相近(P>0.05)。DAPT組小鼠IL-4表達(dá)量較DMSO組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組相近(P>0.05)(表4，表5)。

圖1各組小鼠鼻黏膜病理改變(×40)

Fig1Pathological changes of nasal mucosa in each group(×40)

A.模型組：黏膜纖毛排列紊亂、倒伏(←)；炎細(xì)胞浸潤明顯(△)，鼻黏膜下組織間質(zhì)水腫，小血管擴(kuò)張(◆)；腺體增生明顯(↑); B.對照組：黏膜纖毛排列整齊，完整、光滑(←)；少量炎性細(xì)胞浸潤(↑); C.DMSO組：鼻黏膜纖毛斷裂、倒伏，排列紊亂(←)；黏膜層大量炎性細(xì)胞浸潤(▲)，間質(zhì)出血、水腫(△)； D.DAPT組：較模型組(圖A)有明顯的改善：復(fù)層纖毛開始修復(fù)(←)；組織間隙炎性細(xì)胞浸潤明顯減少(▲)，腺體增生減輕(↑)；間質(zhì)水腫、出血明顯減輕(△)

表3 各組間血清IgE兩兩比較的LSD-t統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果Table 3 LSD-t statistical results of pairwise comparison of serum IgE between groups

2.5 各組小鼠IFN-γ表達(dá)結(jié)果

模型組小鼠鼻腔盥洗液和外周血血清中的IFN-γ表達(dá)量較其余各組明顯下降。DAPT組小鼠表達(dá)量較模型組明顯升高，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與對照組接近(P>0.05)；DMSO組表達(dá)量與模型組相近(P>0.05)，與對照組DAPT組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表6，表7)。

表4 各組小鼠IL-4表達(dá)量變化Table 4 Change of IL-4 expression in mice of each n=8)

表5 各組間IL-4兩兩比較的Dunnett-T3統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果Table 5 Dunnett-t3 statistical results of pairwise comparison of IL-4 between groups

表6 各組小鼠IFN-γ表達(dá)量變化 Table 6 Change of IFN-gamma expression in mice of each n=8)

表7 各組之間兩兩比較的Dunnett-T3統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果Table 7 Statistical results of pairwise comparison of dunnett-t3 between groups

3 討論

Notch基因于1919年首次發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)。已知的Notch受體有4種，Notch1～4表達(dá)于多種組織器官，其中Notch1的表達(dá)更為廣泛。目前認(rèn)為Notch受體在不同物種之間(果蠅到人)以及同一物種的不同成員之間都有高度的結(jié)構(gòu)同源性。脊椎動物Notch配體分為Delta-like與Jagged,前者包括Delta 1/3/4,后者包括Jagged 1和2。Notch配體N端有一個(gè)結(jié)合Notch受體所必需的DSL(the ligand of Notch, Delta、Serrate、 Lag-2)基序，當(dāng)配體(如Delta)和相鄰細(xì)胞的Notch受體結(jié)合后, Notch受體被蛋白酶體切割，釋放出具有核定位信號的胞質(zhì)區(qū)ICN(intracellular domain of Notch)，進(jìn)入細(xì)胞核與DNA結(jié)合蛋白CSL(CBF-1，suppressor of hairless，Lag的合稱)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。Notch信號的靶基因多為堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子(basic helix-Ioop-helix, bHIH)，它們又調(diào)節(jié)其他與細(xì)胞分化直接相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。Notch 2由一組高度保守的蛋白質(zhì)組成，它們是細(xì)胞膜上的受體。Notch2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不需第二信使和蛋白激酶的參與，可直接接收鄰近細(xì)胞的信號并傳到細(xì)胞核，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。這些配體與相同或者不同的受體相互作用，激活Notch信號通路，參與調(diào)控多種器官、組織及細(xì)胞的生長發(fā)育，同時(shí)介導(dǎo)Ⅱ型炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[5]。Guo等[6]通過測定哮喘模型小鼠肺組織及肺T細(xì)胞中Notch mRNA 的表達(dá)初步判定Notch 受體在哮喘發(fā)病中發(fā)揮一定作用, 并證明Notch主要參與調(diào)節(jié)哮喘發(fā)病中T 細(xì)胞的Th2 反應(yīng), 在哮喘發(fā)病中可能起促進(jìn)作用。而過敏性鼻炎與哮喘密切相關(guān)，是同一疾病在不同部位的反應(yīng)，有“一個(gè)氣道，一種疾病”之說，共同點(diǎn)是有大量的炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的參與。前期研究中，筆者通過測定過敏性鼻炎模型鼻中隔黏膜中Notch信號通路相關(guān)基因Notch1-4 mRNA的表達(dá)初步判定Notch受體與過敏性鼻炎的發(fā)病有一定關(guān)系[7]。

Notch受體蛋白包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)是結(jié)合配體并激活受體的部位。Notch受體和配體結(jié)合后發(fā)生兩次分裂。γ-分泌酶催化第二次分裂，釋放出Notch受體胞內(nèi)區(qū)(NICD)，NICD進(jìn)入細(xì)胞核，然后結(jié)合到CSL，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[8]。有研究表明細(xì)胞表面的γ-分泌酶的蛋白水解作用是在細(xì)胞膜進(jìn)行的，可以裂解細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)并能釋放胞間信號片段。γ-分泌酶抑制劑DAPT阻止了 Notch信號通路的活化，進(jìn)一步抑制了其下游基因的表達(dá)[9]，這對過敏性鼻炎鼻腔黏膜的修復(fù)及體內(nèi)過敏性相關(guān)因子數(shù)量的改變可能起著重要的作用。DAPT 是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，可阻斷由γ-分泌酶介導(dǎo)的Notch 受體酶切過程，使Notch受體分子無法轉(zhuǎn)變成有效的活性片段，從而抑制Notch 信號通路的激活，阻止Notch 的活化[10]。DAPT是被人工合成的對Notch信號途徑有阻斷作用的一種γ-分泌酶抑制劑，在劑量10～20 μmol/L時(shí)可阻滯NICD的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)參照DAPT產(chǎn)品說明書的體內(nèi)建議量[5 μmol/(ml·g)]在小鼠基礎(chǔ)致敏和激發(fā)階段前給予DAPT混懸液，結(jié)果顯示：DAPT組小鼠鼻部過敏癥狀明顯減輕，和模型組相比，鼻中隔黏膜病理改變也明顯減輕，鼻黏膜損傷開始修復(fù)，血清特異性抗體IgE的濃度也明顯下降,與模型組及DOSM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)：IL-4和IFN-γ在不同組小鼠鼻腔盥洗液和外周血血清中的表達(dá)量也有不同程度的改變：模型組IL-4與DAPT組和對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與DMSO組相近(P>0.05)。DAPT組小鼠IL-4表達(dá)量較DMSO組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與對照組相近(P>0.05)。同時(shí)DAPT組IFN-γ的含量卻增加，與模型組及DMSO組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與對照組相比P>0.05。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明γ-分泌酶抑制劑DAPT可以改善過敏性鼻炎小鼠的過敏癥狀、減輕鼻黏膜病理改變及影響其血清抗體IgE的濃度；進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞平衡，抑制Th2型細(xì)胞因子分泌并促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子分泌，促使Th0細(xì)胞向Th1方向分化，從而參與過敏性鼻炎的發(fā)生發(fā)展。研究結(jié)果和Kang等[11]針對哮喘的研究結(jié)果相一致，再次驗(yàn)證了AR與過敏性哮喘的“同一氣道，同一疾病”這一學(xué)說。但本研究對過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜和外周血Notch信號通路的活化情況未進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)中γ-分泌酶抑制劑DAPT干預(yù)后模型小鼠過敏癥狀的減輕、血液抗體濃度改變及小鼠鼻腔黏膜病理學(xué)改變是否與Notch信號基因表達(dá)發(fā)生變化有關(guān)，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)由于本實(shí)驗(yàn)建模樣本量少，用于實(shí)驗(yàn)的DAPT選擇了有效范圍內(nèi)其中一個(gè)較低濃度，可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果(相關(guān)細(xì)胞因子的檢測濃度偏低，而IgE的檢測濃度偏高)與臨床研究不一致的原因，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。