蘆柑果皮2，4-二氯苯氧乙酸丁酯殘留的GC-ECD快速篩查

鄭志福 翁文婷 謝曉蘭

摘要：旨在建立氣相色譜-電子俘獲檢測(cè)器快速測(cè)定蘆柑果皮2，4-二氯苯氧乙酸丁酯（2，4-DB）殘留量的方法。以乙酸乙酯為溶劑超聲波萃取果皮中的2，4-DB，蒸干后用丙酮定容至50.00 mL，氣相色譜-電子俘獲檢測(cè)器法（GC-ECD）檢測(cè)。方法的檢出限為0.20 μg/L，定量限為1.00 μg/L，加標(biāo)回收率為71.0%～95.2%，變異系數(shù)為1.4%～9.9%。在所有樣品中均檢出2，4-DB殘留，蘆柑浸泡2，4-DB后，48 h內(nèi)吸收降解了92.7%。

關(guān)鍵詞：蘆柑;2，4-二氯苯氧乙酸丁酯;氣相色譜-電子俘獲檢測(cè)器法（GC-ECD）

中圖分類號(hào)： TQ450.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0218-03

“中國(guó)蘆柑之鄉(xiāng)”福建省永春縣是全國(guó)唯一的蘆柑出口食品農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全示范區(qū)?，F(xiàn)有果園約6 667.67 hm2，年產(chǎn)量約18.5萬t，產(chǎn)值14億元以上，2015—2016年產(chǎn)季出口蘆柑超4萬t。因柑橘存在農(nóng)藥殘留的問題，難以進(jìn)入歐美等高端市場(chǎng)，一些國(guó)家更是憑借現(xiàn)代分析技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，提出更高的農(nóng)藥殘留限量要求。印度尼西亞從2012年起對(duì)我國(guó)柑橘出口采取嚴(yán)格限制，2017—2018年產(chǎn)季更是被全面禁入。2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）類農(nóng)藥長(zhǎng)期用于柑橘采摘前后的保鮮和防腐[1]。2，4-D溶解性小，較早使用的2，4-D鈉鹽水溶性及穩(wěn)定性較差，近年來果農(nóng)普遍改用57% 2，4-D丁酯（2，4-DB）乳油。2，4-DB醇基只有4個(gè)碳原子，沸點(diǎn)146～147 ℃，相比2，4-D的丁氧基乙酯（BEE）、2-乙基己基酯（2-EHE，異辛酯）等長(zhǎng)鏈酯，2，4-DB更易汽化揮發(fā)，在大氣中飄散，對(duì)其他雙子葉農(nóng)作物造成毒害[2]。GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[3]中規(guī)定，2，4-D在柑橘中的最大殘留限量為 0.1 mg/kg。2，4-DB只允許在谷類和大豆中檢出，最大殘留限量為0.05 mg/kg，未允許在柑橘中使用。2016年農(nóng)業(yè)部停止2，4-DB的田間試驗(yàn)及產(chǎn)品登記[2]，2023年起，我國(guó)將全面禁止2，4-DB的生產(chǎn)和銷售。大多數(shù)國(guó)家禁止使用 2，4-DB，2000年以后國(guó)內(nèi)外只有11篇關(guān)于2，4-DB的研究報(bào)道[4-14]，且主要集中在其作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及除草劑的應(yīng)用上，尚未發(fā)現(xiàn)2，4-DB防止柑橘果實(shí)脫落及腐爛的研究報(bào)道。2，4-DB的檢測(cè)方法主要有氣相色譜-電子俘獲檢測(cè)器法（GC-ECD）[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[9-12]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）[13-14]等，而國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法GB/T 5009.165（GC-ECD、填充柱）在2003年頒布后未再更新。柑橘是我國(guó)產(chǎn)量第二大水果，蘆柑等寬皮柑橘占了出口量的70%，2，4-DB在寬皮柑橘中已非法使用近10年，卻缺乏專門的研究。本研究建立了蘆柑果皮乙酸乙酯超聲波提取、GC-ECD快速檢測(cè)方法，并對(duì)果皮中 2，4-DB 的降解速度進(jìn)行了初步研究。

1?材料與方法

1.1?儀器與設(shè)備

氣相色譜（島津GC2014C，配置PECD檢測(cè)器、AOC-20i自動(dòng)進(jìn)樣器、LabSolutions LE V5.81工作站）;超聲波清器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)為KQ-300VDB）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京萊伯泰科儀器有限公司，型號(hào)為EV321）;電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號(hào)為BS 224S）。

1.2?材料和試劑

2，4-DB對(duì)照品（阿拉丁，100 μg/mL，正己烷），用正己烷分別稀釋到10.00、20.00、60.00、80.00、100.00 μg/L作為標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。2，4-DB農(nóng)藥（57%乳油，大連松遼化工有限公司）。甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷均為色譜純。蘆柑鮮果于2017年11月18日采摘于永春縣一都鎮(zhèn)果園，市售4批樣品于2017年12月購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及超市。

1.3?樣品前處理

將蘆柑皮切成0.3 cm×2.0 cm的小條，稱取5.00 g于 100 mL 圓底燒瓶中，加25.00 mL乙酸乙酯，超聲波20 min，取上清液，各用5.00 mL乙酸乙酯洗果皮3次。合并乙酸乙酯，45 ℃減壓蒸干，丙酮+超聲波溶解并定容至50.00 mL。

1.4?氣相色譜條件

汽化室290 ℃，進(jìn)樣量0.5 μL，分流比1 ∶2;載氣（N2）恒流1.00 mL/min。色譜柱：Agilent HP-5Ms（19091J-433，30 m×250 μm×0.25 μm）。程序升溫：150 ℃保持2 min，15 ℃/min 上升至225 ℃保持2 min，20 ℃/min上升至310 ℃保持4.5 min;ECD 310 ℃，電流1.00 nA，N2尾吹30 mL/min，溶劑延遲3 min。

1.5?標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限、回收率及蘆柑2，4-DB殘留量的測(cè)定

取“1.2”節(jié)的2，4-DB標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，按“1.4”節(jié)方法進(jìn)行分析（n=5），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2，4-DB用正己烷逐級(jí)稀釋后按“1.4”節(jié)方法進(jìn)行分析，計(jì)算檢出限和定量限，平行3次。蘆柑鮮果添加100、500 μg/kg 2，4-DB;市售蘆柑樣品4批，按“1.3”節(jié)方法前處理，按“1.4”節(jié)條件分析（n=3），計(jì)算回收率及2，4-DB殘留量。

1.6?蘆柑果皮2，4-DB降解速度

蘆柑鮮果采摘7 d后，用比例為10 g ∶10 L的2，4-DB農(nóng)藥水浸泡5 min，撈出后在陰涼處晾干，1.5、24、48、72、96 h后按“1.3”節(jié)、“1.4”節(jié)方法分析檢測(cè)（n=3）。

2?結(jié)果與分析

2.1?前處理

2，4-DB作為保鮮劑使用主要?dú)埩粼诠け砻?，蘆柑果皮含多種有機(jī)物，用甲醇、乙酸乙酯、石油醚3種不同極性溶劑提取2，4-DB，石油醚提取效果最差，甲醇的提取率只有乙酸乙酯的43%～51%，且雜質(zhì)含量高于乙酸乙酯，本研究采用5倍橘皮質(zhì)量的乙酸乙酯，超聲波提取20 min。乙酸乙酯提取液中含大量有機(jī)物（圖1），色譜檢測(cè)前常采用固相萃取、QuEChERS等方法凈化。ECD為選擇性檢測(cè)器，果皮2，4-DB殘留量較大，在最佳柱溫條件下，2，4-DB與其他雜質(zhì)完全分開（圖2），無需凈化處理。果皮中含較多水分，乙酸乙酯提取液中含微量水，影響ECD檢測(cè)。乙酸乙酯提取液于 45 ℃ 減壓蒸干后用丙酮定容，過0.25 μm濾膜，用GC-ECD檢測(cè)。2，4-DB在果皮中不得檢出，快速篩查時(shí)，提取液不蒸干，乙酸乙酯定容至50 mL，過濾時(shí)加無水硫酸鈉脫水，響應(yīng)值下降 25%～40%。

2.2?GC分離

蘆柑皮用乙酸乙酯提取、定容后，不經(jīng)凈化處理直接進(jìn)樣。盡管ECD為選擇性檢測(cè)器，提取液中含大量雜質(zhì)，特別是13～14 min有2個(gè)含量很高的雜質(zhì)（圖1）。最佳柱溫條件下，2，4-DB在保留時(shí)間8.37 min處，與雜質(zhì)完全分離（圖2），提取液無需凈化處理。

2.3?2，4-DB標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限

2，4-DB對(duì)照品（阿拉丁，100 μg/mL，基體正己烷），用正己烷分別稀釋到10.00、20.00、60.00、80.00、100.00 μg/L，按“1.3”節(jié)方法進(jìn)行GC-ECD檢測(cè)。濃度由低到高，每個(gè)濃度測(cè)定5次，以峰面積（A）的平均值對(duì)濃度（C）作圖（圖3）。

線性方程：A=425.8C+1 911，r2=0.998 6。進(jìn)樣2，4-DB稀溶液，1.00 μg/L 2，4-DB相對(duì)誤差約為10%，0.20 μg/L 2，4-DB可手動(dòng)積分，0.10 μg/L 2，4-DB 無法確定峰位置。方法檢出限為0.20 μg/L，定量限為1.00 μg/L。使用填充柱（1.7% OV-17和2% QF-1混合固定液，2 m×3.2 mm），方法檢出限為0.025 mg/kg[15]，只比GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中2，4-DB在谷類中允許的最大殘留限量0.05 mg/kg稍低，GB/T 5009.165—2003《糧食中2，4-滴丁酯殘留量的測(cè)定》遠(yuǎn)落后于檢測(cè)要求。毛細(xì)管柱分離效果更好，檢出限及定量限降低2個(gè)數(shù)量級(jí)以上，本方法可作為谷物中2，4-DB殘留量檢測(cè)方法的參考。

2.4?蘆柑果皮2，4-DB殘留量檢測(cè)及2，4-DB降解速度

圖2中由下往上5條色譜曲線依次為20.00 μg/L 2，4-DB正己烷溶液、蘆柑鮮果、市售蘆柑、蘆柑鮮果加 100.00 μg/kg 2，4-DB、蘆柑鮮果加500.00 μg/kg 2，4-DB。2，4-DB除作為蘆柑保鮮劑使用外，還可防止落果，在開花末期與第1、第2生理落果期各要噴灑1次2，4-DB。防止落果時(shí)，2，4-DB無用藥指導(dǎo)，2，4-D鈉鹽的用藥濃度為1 g農(nóng)藥加100 kg水稀釋，而作為保鮮劑使用時(shí)，用藥濃度為1 g 2，4-D 鈉鹽加4 kg水稀釋。蘆柑種植過程需噴灑較低濃度2，4-DB防止果實(shí)脫落，從果園采摘的蘆柑鮮果果皮中可檢測(cè)出微量2，4-DB殘留（圖2-②），本底濃度為 62.5 μg/kg。如表1所示，分別添加100.0、500.0 μg/kg 2，4-DB，回收率分別為71.0%、95.2%。

市售4批蘆柑，各取3個(gè)，取果實(shí)中部果皮，按“1.3”“1.4”節(jié)方法進(jìn)行檢測(cè)（n=3），2，4-DB殘留量分別為（100.7±6.0）、（111.7±15.0）、（123.2±1.5）、（139.3±11.8） μg/kg。根據(jù)GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品中農(nóng)藥最大殘留限量》，2，4-DB在蘆柑中禁止檢出，但果園現(xiàn)采摘鮮果及市售蘆柑的果皮中均檢出2，4-DB殘留，殘留量比蘆柑（全果）2，4-D最大殘留限量100 μg/kg還高，說明在蘆柑生長(zhǎng)期噴灑2，4-DB防止落果、采摘后浸泡 2，4-DB 防止果實(shí)腐爛均是普遍行為。

在初次試驗(yàn)中，蘆柑采摘24 h后，用2.0～10 g 2，4-DB農(nóng)藥：10 kg水4個(gè)不同濃度2，4-DB藥水浸泡，晾干，5 d后檢測(cè)。不同用藥濃度的蘆柑2，4-DB殘留量在88.3～111.4 μg/kg 間，與蘆柑鮮果2，4-DB本底殘留量相差不大。蘆柑浸泡保鮮劑后，果皮表面殘留的2，4-DB在短期內(nèi)迅速被吸收并降解。剩余少量蘆柑鮮果在采摘后第7天用 1 g/1 kg 濃度藥水處理。蘆柑在藥水中浸泡5 min后晾干，1.5、24、48、72、96 h后檢測(cè)，2，4-DB殘留量依次為（1 370.3±10.7）、（449.7±21.3）、（94.7±9.0）、（94.8±10.8）、（101.5±14.5） μg/kg。2，4-DB含量在24 h內(nèi)降低了67%，48 h后含量降低到約100 μg/kg的本底水平，48 h內(nèi)2，4-DB被蘆柑果皮吸收并降解了92.7%。不同蘆柑果皮厚度及粗糙程度相差較大，造成試驗(yàn)數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差普遍較大。

2.5?蘆柑2，4-D類農(nóng)藥的使用現(xiàn)狀及后續(xù)研究計(jì)劃

2，4-D類農(nóng)藥是目前世界上使用量最大的農(nóng)藥，對(duì)其監(jiān)管日趨嚴(yán)格。2，4-D類農(nóng)藥可防止柑橘在生長(zhǎng)期果實(shí)脫落、貯藏期果實(shí)腐爛，是柑橘種植、銷售過程中必不可少的農(nóng)藥。2，4-D鈉鹽因水溶解性能不佳等原因，較早被市場(chǎng)棄用。2，4-DB 是近10年我國(guó)較常見劑型，但2，4-DB揮發(fā)性較強(qiáng)，對(duì)其他農(nóng)作物毒害性較大，2017年起被停止產(chǎn)品登記[2]。目前市場(chǎng)上新出現(xiàn)的劑型是2，4-滴二甲胺鹽（2，4-DD），GB 2763—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)?食品中農(nóng)藥最大殘留限量》還新增了2，4-滴異辛酯（2，4-DE）。2，4-DD是 2，4-D 與二甲胺形成的絡(luò)合物，相比2，4-D鈉鹽（固體，含量85%），能制成穩(wěn)定乳油劑型，易于加水稀釋。2，4-DB、2，4-DE 是2，4-D分別與丁醇、異辛醇（2-乙基己醇）形成的酯，2，4-DE沸點(diǎn)396.9 ℃，遠(yuǎn)高于2，4-DB的147 ℃，不易揮發(fā)，但目前市場(chǎng)上沒有單獨(dú)2，4-DE劑型農(nóng)藥。2，4-D類農(nóng)藥都是在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成2，4-D，進(jìn)而發(fā)揮作用。目前對(duì)2，4-DD、2，4-DE的研究基本空白，即將被禁用的2，4-DB研究也很少。蘆柑果皮2，4-DNa殘留量[16]為 1 040 μg/kg，2，4-DB比2，4-D低1個(gè)數(shù)量級(jí)。不同2，4-D類農(nóng)藥被果皮細(xì)胞吸收效率、轉(zhuǎn)化成2，4-D效率、保鮮效果、防止果實(shí)脫落等方面可能存在區(qū)別，有待進(jìn)一步研究。

3?結(jié)論

本研究建立了GC-ECD測(cè)定柑橘2，4-DB殘留量的方法，可快速篩查柑橘是否違規(guī)使用2，4-DB。盡管不被法規(guī)允許，2，4-DB在蘆柑生產(chǎn)、銷售過程中普遍使用。浸泡 1 g/kg 2，4-DB農(nóng)藥后果實(shí)表面2，4-DB殘留48 h內(nèi)被吸收分解。在加強(qiáng)監(jiān)管濫用2，4-DB的同時(shí)，應(yīng)加快對(duì) 2，4-DD、2，4-DE等替代2，4-D類農(nóng)藥使用的研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉?蕊，李德紅，李?玲. 2，4-二氯苯氧乙酸的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究，2004，8（增刊2）：71-75.

[2]第八屆全國(guó)農(nóng)藥登記評(píng)審委員會(huì)第十八次全體會(huì)議紀(jì)要[J]. 今日農(nóng)藥，2016（2）：11-13.

[3]食品中農(nóng)藥最大殘留限量：GB 2763—2016[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[4]Sun F，Zhu T，Shang J，et al. Gas-phase reaction of dichlorvos，carbaryl，chlordimeform，and 2，4-D butyl ester with OH radicals[J]. International Journal of Chemical Kinetics，2005，37（12）：755-762.

[5]張淑花，周利軍，張雪萍. 低質(zhì)量濃度除草劑2，4滴丁酯處理對(duì)土壤動(dòng)物群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2013，22（10）：1706-1710.

[6]張小衛(wèi). 2，4-D丁酯對(duì)冬小麥安全性及產(chǎn)量的影響[J]. 小麥研究，2013，34（1）：10-16.

[7]單?娟，董?嶄，王文博. 氣相色譜法測(cè)定玉米中乙草胺·莠去津·2，4-滴丁酯殘留[J]. 農(nóng)藥，2011，50（8）：582-584.

[8]楊?忠，任月梅，郭瑞鋒，等. 2，4-滴丁酯對(duì)谷子生長(zhǎng)形態(tài)指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（30）：132-138.

[9]黃修柱，季?穎. 2，4-滴丁酯原藥及其雜質(zhì)GC-MS分析研究[J]. 農(nóng)藥科學(xué)與管理，2005，26（8）：3-7.

[10]匡?華，侯玉霞，儲(chǔ)曉剛，等. 氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定大豆中14種苯氧羧酸類除草劑[J]. 分析化學(xué)，2006，34（12）：1733-1736.

[11]扎西次旦，潘?虎，代艷娜，等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定青稞中除草劑2，4-D丁酯殘留[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015，22（4）：139-142.

[12]張文華，謝?文，侯建波，等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豆芽與番茄中6種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2016，35（10）：1241-1247.

[13]姜?楠，劉思潔，崔?勇，等. 2015年吉林省市售水果中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量監(jiān)測(cè)結(jié)果分析[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2016，7（1）：33-38.

[14]李?倩，房?寧，王子劍，等. 2016年北京市大興區(qū)主產(chǎn)水果中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑殘留量監(jiān)測(cè)分析[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2017，27（14）：2089-2090，2094.

[15]糧食中2，4-滴丁酯殘留量的測(cè)定：GB/T 5009.165—2003[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

[16]鄭志福，李文杰，李國(guó)清. 衍生后SPEC18-GC-FID測(cè)定蘆柑 2，4-D 殘留[J]. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2013，9（3）：191-195.