植物內(nèi)生菌的生態(tài)學(xué)作用與天然產(chǎn)物研究現(xiàn)狀及展望

郭賓會

摘要：植物內(nèi)生菌是指生活史中某一時期生活在植物內(nèi)而對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的一類微生物。內(nèi)生菌普遍存在于多種植物中，具有豐富的生物多樣性。近年來，內(nèi)生菌內(nèi)逐漸發(fā)現(xiàn)一些天然活性代謝產(chǎn)物，并了解到其較為重要的生理、生態(tài)學(xué)作用?；诳蒲泄ぷ髡邔?nèi)生菌研究的關(guān)注，主要就國內(nèi)外在內(nèi)生菌的多樣性、內(nèi)生菌與宿主植物的生態(tài)學(xué)作用、內(nèi)生菌一些重要的活性代謝產(chǎn)物等方面的研究進(jìn)展及報道進(jìn)行綜合評述，并對目前內(nèi)生菌研究所存在的問題和展望進(jìn)行討論，以期望對現(xiàn)在內(nèi)生菌的研究有所借鑒，在原有的基礎(chǔ)上有所突破。

關(guān)鍵詞：植物內(nèi)生菌;生物多樣性;生物防治;代謝產(chǎn)物;生態(tài)學(xué)作用;固氮作用;生物降解;宿主植物

中圖分類號：Q143+.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）20-0013-06

內(nèi)生菌（endophyte）一詞由德國科學(xué)家de Bary首先提出，是指生活在植物組織內(nèi)的微生物，用以區(qū)分那些生活在植物表面的附生菌（epiphyte）[1]。后來，“內(nèi)生菌”這一詞匯的定義和解釋先后多次被不同的研究人員修改和解釋。Petrini將“內(nèi)生菌”定義為那些在其生活史中的某一段時期生活在植物內(nèi)而對植物組織沒有引起明顯病害癥狀的菌，這個定義包括那些在其生活史中的某一階段營附生的腐生菌和對宿主暫時無傷害的潛伏性病原菌（Latent pathogens）和菌根菌[2]。Bills認(rèn)為，一些類型的菌根菌，如內(nèi)外生菌根菌、杜鵑菌根菌和假菌根菌等也應(yīng)歸類為內(nèi)生菌[3]。盡管目前關(guān)于內(nèi)生菌的概念范疇還有爭議，但Petrini的觀點得到普遍認(rèn)可[4]。不過，須要指出的是內(nèi)生菌只是一個生態(tài)學(xué)上的概念，而非分類學(xué)單位。

內(nèi)生菌主要包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌三大類微生物[5]。對內(nèi)生菌的分離和研究工作主要集中在內(nèi)生真菌（endophytic fungi）方面。植物內(nèi)生真菌多數(shù)屬于雙核菌門子囊菌亞門中的核菌綱（Pyrenomyetes）、盤菌綱（Discomycetes）和腔菌綱（Loculoascomycetes）及其無性態(tài)的多種真菌，也包括少數(shù)擔(dān)子菌（Basidiomycotina）和接合菌（Zygomycotina），主要分布于植物的葉鞘、種子、花、莖、葉片和根等組織、器官的細(xì)胞或細(xì)胞間隙[6-7]。內(nèi)生真菌的傳播途徑一方面通過菌絲生長進(jìn)入子房和胚珠，經(jīng)寄主植物種子傳播，或者產(chǎn)生孢子，通過風(fēng)、降水等途徑傳播[8]。

關(guān)于內(nèi)生菌的研究最早可追溯至1833年從小麥葉片中發(fā)現(xiàn)的不明銹狀物，其后來被證實為真菌的一種結(jié)構(gòu)。Wilson從黑麥草（Lolium temulentum L.）的種子內(nèi)分離出第1株內(nèi)生真菌[9]，至今關(guān)于內(nèi)生菌的研究已經(jīng)有100多年的歷史。經(jīng)過科學(xué)家們長期以來的工作積累，內(nèi)生菌的研究已經(jīng)奠定了比較深厚的基礎(chǔ)，內(nèi)生菌在菌種的分離與鑒定中對宿主植物的侵染及相互作用、內(nèi)生菌株的培養(yǎng)及代謝產(chǎn)物的提取等方面都已經(jīng)建立了行之有效的方法。基于科研工作者對內(nèi)生菌研究的關(guān)注，筆者主要就國內(nèi)外在內(nèi)生菌的多樣性、內(nèi)生菌與宿主植物的生態(tài)學(xué)作用、內(nèi)生菌相關(guān)重要的活性代謝產(chǎn)物等方面的研究進(jìn)展及報道進(jìn)行綜合評述，并對目前內(nèi)生菌研究所存在的問題和展望進(jìn)行討論，以期對現(xiàn)在內(nèi)生菌的研究有所借鑒，在原有的基礎(chǔ)上有所突破。

1?內(nèi)生菌的多樣性

內(nèi)生菌普遍存在于目前已研究過的各種陸生及水生植物中，具有豐富的生物多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，對于一種植物而言，從中可分離到的內(nèi)生真菌和（或）細(xì)菌通常為數(shù)種至幾十種，有的甚至多達(dá)數(shù)百種[10]。在熱帶雨林中，同一植物內(nèi)生菌的種類多樣性更為突出。Anorld 等分析了巴拿馬中部雨林中2種植物葉子中的內(nèi)生菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離自83個健康葉片上的內(nèi)生菌多達(dá)418個形態(tài)學(xué)種（其中基因型不同的分類元至少有347個），這些內(nèi)生菌同時也表現(xiàn)出一定的宿主專化性和地域?qū)；訹11];Suryanarayanan等研究了Nilgiri生物圈保護(hù)區(qū)里分屬于17科的24株樹木中內(nèi)生菌的分布和多樣性，總共分離到81個不同的內(nèi)生菌[12];Suryanarayanan等繼續(xù)研究了位于美國亞利桑那州不同地理位置的21種仙人掌中的內(nèi)生菌，結(jié)果分離到900個內(nèi)生菌，分屬于22個不同的種[13]。Glynou 等最新的一項研究證實，185株植物根部的內(nèi)生真菌分屬于5個不同的執(zhí)行分類單元[14]?，F(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)研究也表明，許多形態(tài)學(xué)上一致的同一種內(nèi)生菌往往還具有多樣化的遺傳型[15-17]，進(jìn)一步豐富了內(nèi)生菌的多樣性?？紤]到內(nèi)生菌對宿主的專一性，按照現(xiàn)在已經(jīng)知道的地球上超過25萬種植物統(tǒng)計，微生物學(xué)家Hawksworth等指出，地球上內(nèi)生菌的種類應(yīng)該在100萬左右，然而有記錄的僅占其中的十分之一[18]。隨著新物種的發(fā)現(xiàn)和證據(jù)積累，人們對內(nèi)生菌總數(shù)的估計也在不斷改變。Dreyfuss等估計，地球上僅內(nèi)生真菌就至少有100萬種[19]。2001年，Hawksworth在他的研究報告中指出，熱帶植物中的內(nèi)生真菌種類應(yīng)該能達(dá)150萬種[20];同年，Arnold等在研究了新熱帶地區(qū)的9種林木后推斷，熱帶植物中的內(nèi)生真菌150萬種的數(shù)量可能被低估了[21]。

影響內(nèi)生菌多樣性的因素很多。Arnold等的研究表明，寄居于熱帶地區(qū)植物宿主中的內(nèi)生菌的種類和數(shù)量要遠(yuǎn)高于溫帶地區(qū)植物中的種類和數(shù)量[11，22]。Seena等研究分析了海灘沙丘上生長的2種豆科植物小刀豆（Canavalia cathartica）和海刀豆（C. maritima）不同的發(fā)育時期，種子、幼苗、成熟植株及不同的組織（子葉、種皮、根、莖和葉）中的內(nèi)生真菌情況，他們采用平板培養(yǎng)的方法，在麥芽瓊脂培養(yǎng)基上共分離得到包括子囊菌和接合菌在內(nèi)的46種內(nèi)生真菌;在不同的發(fā)育階段和組織材料中，內(nèi)生真菌主要（>90%）分布在苗期和成熟的組織如根、莖和葉中;研究還發(fā)現(xiàn)小刀豆中內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量高于海刀豆中的內(nèi)生菌[23]。Muller等研究表明，開始腐爛的挪威云杉針葉中內(nèi)生真菌的種類比正常生理狀態(tài)下針葉中內(nèi)生真菌的種類急劇下降[24];Danti等研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用十二烷基磺酸鈉鹽（SDBS，sodium dodecylbenzene sulphonate）氣霧劑對歐洲山毛櫸（Fagus sylvatica L.）的嫩枝長時間處理以后，也觀察到植物體內(nèi)內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量下降的現(xiàn)象[25];Rasmussen等研究表明，多年生黑麥草（Lolium perenne）在高氮和高糖條件下其共生內(nèi)生真菌的濃度及生物堿產(chǎn)量都大幅度下降[26]。Gao等采用RFLP和rDNA ITS文庫序列分析等分子生物學(xué)手段，在研究百合科植物肖菝葜（Heterosmilax japonica Kunth）不同季節(jié)里內(nèi)生菌的分布情況后發(fā)現(xiàn)，肖菝葜（Heterosmilax japonica Kunth）中內(nèi)生菌在春季的豐度高于秋季[27]。眾多研究表明，內(nèi)生菌多樣性的影響因素與宿主植物所處的地球緯度、地理方位、具體的小生態(tài)環(huán)境和季節(jié)因素等有關(guān)，而且宿主植物的不同器官、組織，生長周期中不同的發(fā)育階段，植物材料的不同處理等均可影響到植物體內(nèi)寄居的內(nèi)生菌數(shù)量和種類。

2?植物-內(nèi)生菌的生態(tài)學(xué)作用

植物與內(nèi)生菌的關(guān)系在多數(shù)情況下是共生互惠的。一方面植物體作為內(nèi)生菌的宿主，為后者提供了生活、棲息的環(huán)境;另一方面很多內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生大量的活性代謝產(chǎn)物[28-29]，這些物質(zhì)在某種程度上對植物的生長、發(fā)育及逆境環(huán)境（如干旱脅迫、病害和蟲害等）的抗逆等方面起到了重大的生態(tài)學(xué)作用。

2.1?內(nèi)生菌的固氮作用

作為植物生長的大量元素之一，氮對植物而言是必需的?？諝庵屑s80%的氮?dú)獠荒鼙恢参镏苯永?，只有固氮微生物具有將氮?dú)廪D(zhuǎn)化成氨的能力，人們稱為生物固氮。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO） 1995年粗略估計，全球每年由生物固定的氮量約占全球植物需氮量的3/4。從1862年發(fā)現(xiàn)生物固氮現(xiàn)象到目前為止，生物固氮的研究已經(jīng)有100多年了，其間的研究領(lǐng)域涉及到形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞水平、分子水平及遺傳等諸多領(lǐng)域。其中，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上較廣泛、意義較重要的固氮資源主要是豆科植物共生固氮、紅萍和固氮藍(lán)藻、結(jié)瘤的非豆科植物、聯(lián)合固氮和自生固氮等[30]。

某些作物（如水稻和甘蔗等）體內(nèi)內(nèi)生固氮菌的發(fā)現(xiàn)，為作物生物固氮增添了新途徑。Baldani等報道，從玉米、水稻和高粱的根部均分離出固氮細(xì)菌織片草螺菌（Herbaspirillum seropedicae）[31]。此后，他們又相繼從多年生作物甘蔗根莖分離到一些具有獨(dú)特生理生態(tài)特征的固氮菌，這類固氮菌即內(nèi)生固氮菌，它們可提供給宿主相當(dāng)數(shù)量的氮素，在土壤中不能生存或生存能力很差，但能以相當(dāng)高的數(shù)量存在于植物組織內(nèi)，并不會引起宿主任何不良反應(yīng)。Barraquio 等研究報道，從菲律賓濕地水稻根、莖中成功分離到具有固氮能力的內(nèi)生菌[32]。Robert等從巴西產(chǎn)的甘蔗中分離出多株內(nèi)生固氮菌醋桿菌（Gluconacetobacter diazotrophicus）、織片草螺菌、接種草螺菌（H. rubrisubalbicans）和伯克霍爾德菌（Burkholderia sp.）[33] 。固氮弧菌屬（Azoarcus sp.）株系 BH72是一類能夠為水稻和其他草類植物提供生物固氮能力的內(nèi)生菌，Krause等完成了對該內(nèi)生菌的全基因組測序，他們研究結(jié)果表明，BH72株系基因組全長為4 376 040個堿基對，含3 992個可預(yù)測的蛋白編碼序列，這為今后從分子水平上了解該類內(nèi)生菌的固氮機(jī)制打下了基礎(chǔ)[34]。

生物固氮是生命科學(xué)中的重大基礎(chǔ)研究課題之一，它在生產(chǎn)實際中發(fā)揮著重要作用，即為植物特別是糧食作物提供氮素、提高產(chǎn)量、降低化肥用量和生產(chǎn)成本、減少水土污染和疾病、防治土地荒漠化、建立生態(tài)平衡和促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。內(nèi)生固氮菌的發(fā)現(xiàn)為生物固氮的研究增添了新的內(nèi)容。

2.2?內(nèi)生菌的生物降解及生物防治作用

近代工業(yè)的發(fā)展不可避免地造成了土壤和水資源的污染，導(dǎo)致環(huán)境的惡化及生物多態(tài)性的降低，其影響程度有越來越嚴(yán)重的趨勢。為了降低種種不利因素對環(huán)境和資源的人為破壞，生態(tài)學(xué)家們提出了多項保護(hù)環(huán)境資源的有利措施，其中利用微生物或植物內(nèi)生菌對環(huán)境中的污染物進(jìn)行生物降解或取代化學(xué)藥劑對植物病蟲害進(jìn)行有效防治成為生物學(xué)家和生態(tài)學(xué)家研究的熱點之一，并取得了較好的進(jìn)展。

研究表明，植物內(nèi)生菌對周圍環(huán)境中的毒素起到部分的降解作用。愛荷華州立大學(xué)的一項研究證實，1株新發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生菌Methylobacterium populum sp. BJ001能有效降解三硝基甲苯（TNT）和硝基三嗪（HMX）等化合物[35-36]。改造過的內(nèi)生菌洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cepacia） VM1330能夠增加宿主植物對甲苯的忍受能力和降低植物向外界大氣環(huán)境釋放甲苯的能力[37]。在抵御植物病蟲害方面，Coombs等研究表明，一些從健康的谷類作物中分離到的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)離體、活體試驗證實能夠有效抑制引起植物根部病變的致病真菌，38株不同的內(nèi)生菌中有64%的菌株被證實至少對某一種真菌有強(qiáng)烈的抑制作用，4種內(nèi)生菌具有較強(qiáng)的廣譜抗菌作用[38]。Cao等從表面殺過菌的香蕉根部成功分離出131株內(nèi)生放線菌，其中18.3%的分離菌能抑制植物致病菌香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）的生長[39]。丁婷等研究證實，杜仲內(nèi)生真菌抗性突變株DZJ07-2能誘導(dǎo)小麥植株根部的多酚氧化酶、過氧化物酶和苯丙氨酸酶的活性提高，從而增強(qiáng)小麥對紋枯病的抗性[40]。相關(guān)研究表明，植物內(nèi)生菌在一定程度上能很好起到生物防治的作用，對生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和可持續(xù)資源的利用開發(fā)有著潛在的深遠(yuǎn)意義。

2.3?內(nèi)生菌對宿主植物生長的促進(jìn)作用和對環(huán)境脅迫的抗性

內(nèi)生菌對宿主植物生長的促進(jìn)作用主要因素為：一方面許多內(nèi)生菌可產(chǎn)生IAA、GA以及細(xì)胞激動素等植物生長激素;另一方面內(nèi)生菌可增進(jìn)宿主植物對氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收。禾本科農(nóng)作物如水稻、甘蔗、玉米、高粱上的內(nèi)生細(xì)菌具有很強(qiáng)的固氮能力[31-34]，感染內(nèi)生真菌的牧草對氮、磷的攝取能力也有所提高[41-43]，另外感染內(nèi)生菌的牧草、玉米對環(huán)境脅迫如干旱[44-45]以及鋁的毒害[46]等具有更強(qiáng)抗性，揭示出其內(nèi)在生理、生態(tài)學(xué)方面的多效作用。Marquez 等研究證實，一種熱帶草Dichanthelium lanuginosum及其內(nèi)生真菌突彎孢霉（Curvularia protuberata）的共生關(guān)系可使雙方能在65 ℃的地?zé)釡囟认麓婊?，而分離開來的2種生物在38 ℃以上就無法生長了;研究結(jié)果還表明，某種病毒分子在植物與內(nèi)生菌的共生關(guān)系中起著至關(guān)重要的作用[47]。陳水紅等評述了內(nèi)生真菌對宿主禾草植物抗鹽堿性影響的研究，指出內(nèi)生真菌具有促進(jìn)禾草分泌抗氧化劑、增強(qiáng)抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)有機(jī)滲透物質(zhì)的作用[48]。

眾多的研究表明，植物內(nèi)生菌何以產(chǎn)生諸如固氮作用、促生作用、提高對環(huán)境的脅迫抗性等生態(tài)學(xué)功能與內(nèi)生菌產(chǎn)生豐富多樣的具有生物活性的代謝產(chǎn)物密不可分。

3?植物內(nèi)生菌的活性代謝物質(zhì)

植物內(nèi)生菌可產(chǎn)生豐富多樣的具有生物活性的代謝產(chǎn)物，按其功能主要分為抗生素類、殺蟲劑類、抗腫瘤物質(zhì)及其他類等。

3.1?抗生素類

抗生素是一類由微生物產(chǎn)生的具有極高活性的小分子量天然產(chǎn)物，在非常低的濃度下即可抑制、殺死其他類微生物。自1928年Alexander Fleming發(fā)現(xiàn)第1例抗生素——青霉素至今，人們對抗生素的研究和利用已經(jīng)超過180多年的歷史了。近來研究表明，從植物中分離的內(nèi)生菌也可產(chǎn)生具有天然功效的抗生素類物質(zhì)。

cryptocandin 是Strobel等從衛(wèi)矛科著名藥用植物雷公藤中分離到的1株內(nèi)生真菌Cryptosporiopsis quercina中分離提取的1種獨(dú)特的抗菌多肽，試驗證明其對一些人類真菌病原體如白色念珠球菌（Candida albicans）和發(fā)癬菌屬（Trichophyton spp.）、植物致病真菌菌核菌（Sclerotinia sclerotiorum）和灰霉菌（Botrytis cinerea）等均具有高效的抑制、殺死活性[49]。目前，cryptocandin 及其相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)被應(yīng)用于真菌引起的人類皮膚病和指甲炎的治療。Miller等從1種內(nèi)生于草本植物葉中的假單孢菌Pseudomonas viridiflava中分離出分子量為1 153 和1 181的脂多肽類物ecomycins，該多肽除了含正常的氨基酸外，還有高絲氨酸等特別氨基酸參與其結(jié)構(gòu)組成。研究證明，ecomycins對人類致病真菌如新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）和白色隱球菌（C. albicans）等具有生理抗性[50]。研究人員從黃花蒿和蒙古蒿的莖內(nèi)分離到10多種內(nèi)生真菌，其體外培養(yǎng)液的乙酸乙酯提取物幾乎全部含有抗瓜枝孢（Cladosporium cucumerinum）和黑曲霉（Aspergillus niger）2種真菌的代謝產(chǎn)物。從其中2 株炭疽菌（Colletotrichum spp.）的發(fā)酵物中分離出了一系列對人畜和植物病原真菌和（或）細(xì)菌有良好抑制作用的化合物，其最低抑菌濃度（MIC，minimal inhibitory concentration） 值一般在10～60 μg/mL，分離出的炭疽菌酸（colletotric acid）等3種活性物質(zhì)是首次報道的新化合物[51-52]。Singh等從1株未鑒定的內(nèi)生真菌CR115的發(fā)酵液中分離到1個二萜化合物guanacastepene，該化合物對多種革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌以及白色念珠菌有活性[53]。Castillo等研究分析了從植物蛇藤中分離出來的1株內(nèi)生鏈霉菌株NRRL 30562，他們通過質(zhì)譜、高效液相色譜（HPLC）及病理等試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株溶劑抽提物中含有多種具有廣譜抗性的化合物，研究表明，這些化合物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有明顯抗性，同時還發(fā)現(xiàn)植物致病真菌終極腐霉（Pythium ultimum）對該類化合物敏感[54]。

從內(nèi)生真菌中分離提取的抗生素類物質(zhì)的另一奇妙功效是對病毒的抑制作用。Guo等成功地從內(nèi)生真菌Cytonaema sp.的固相發(fā)酵物中提取出2種新型的人細(xì)胞巨化病毒（cytomegalovirus）蛋白酶抑制劑cytonic acids A和cytonic acids B[55]。

3.2?殺蟲劑類

禾本科植物內(nèi)生真菌能產(chǎn)生多達(dá)數(shù)十種的生物堿，這些生物堿具有抗病原菌、抗線蟲、增強(qiáng)植物他感作用等多種生物學(xué)活性，其中大多數(shù)對食草昆蟲乃至哺乳動物（牛和羊等）具較強(qiáng)的毒性[56]。

nodulisporic acids是一類新型的吲哚二萜，它對產(chǎn)卵于腐爛創(chuàng)口的大蒼蠅幼蟲具有很強(qiáng)的殺死作用。第1個nodulisporic化合物是從植物Bontia daphnoides中分離出的1株內(nèi)生真菌多節(jié)孢屬（Nodulisporium sp.）中分離到的[57]。此項發(fā)現(xiàn)也推動了人們更廣泛的研究，意在尋求更多的多節(jié)孢屬或是功效更大的nodulisporic acids類似物。Daisy等研究發(fā)現(xiàn)，1株從藤蔓植物Paullina paullinioides中分離到的內(nèi)生真菌Muscodor vitigenus發(fā)酵液的主要成分是萘（naphthalene），一種被廣泛應(yīng)用的驅(qū)蟲劑——樟腦球的主效成分。同時，M. vitigenus 被證實對小麥莖稈葉蜂（Cephus cinctus）有強(qiáng)烈的驅(qū)除功效[58]。Ju等從內(nèi)生菌感染的1種早熟禾（Poa ampla）中分離到數(shù)個對蚊子幼蟲有毒性的黃酮類化合物[59]。

生物制劑殺蟲劑雖然生產(chǎn)的量不多，但由于其在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的優(yōu)越性和世界各國對生態(tài)環(huán)境保護(hù)的日益重視，其所占市場份額正在逐年增加。

3.3?抗腫瘤物質(zhì)

自從1993年Stierle等首次從太平洋紅豆杉中分離出第1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae以來[60]，科學(xué)家們對從內(nèi)生真菌中分離提取高效抗癌活性物質(zhì)充滿了濃厚的興趣，他們投入了大量的精力和物力來開展這方面的研究并取得了一些重大的進(jìn)展。

單就產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌而言，自第1株內(nèi)生真菌T. andreanae報道至今，先后有不同的科學(xué)家從不同的植物中分離到不同種屬的內(nèi)生真菌，經(jīng)多重試驗證明，一些內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中含有高效抗癌活性物質(zhì)紫杉醇[61-63]。研究人員已從南方紅豆杉（T. chinensis var. mairei）中成功分離到1株新的內(nèi)生真菌BT2（Ozonium sp.），經(jīng)HPLC-MS等試驗證實其發(fā)酵產(chǎn)物中有紫杉醇及其前體Baccatin Ⅲ的存在[64]。

torreyanic acid是一種抗癌的選擇性細(xì)胞毒素醌二聚物。Lee等從美洲瀕臨滅絕的樹木Taxus taxifolia中分離到1株內(nèi)生菌Phylum microspora，從中分離提取出torreyanic acid，在不同的腫瘤細(xì)胞系中驗證，它對那些對蛋白激酶C敏感的腫瘤細(xì)胞系高出其他細(xì)胞系5～10倍的功效，通過引起細(xì)胞凋亡最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的死亡[65]。

生物堿是另一大類抗癌物質(zhì)，除了從植物次生代謝產(chǎn)物提取外，內(nèi)生真菌中也常有報道。一些真菌如炭角菌屬（Xylaria）、莖點霉屬（Phoma）、炭團(tuán)菌屬（Hypoxylon）和橫截霉菌屬（Chalara）等菌屬是生產(chǎn)諸如細(xì)胞松弛素類（cytochalasins）物質(zhì)的典型代表。它們產(chǎn)生的許多化合物具有抗腫瘤活性和抗菌活性，只是由于它們本身對細(xì)胞具有毒性而還沒有被應(yīng)用到醫(yī)藥中[28]。Wagenaar等從來源于傳統(tǒng)藥用植物雷公藤（Tripterygium wilfordii）的內(nèi)生菌喙枝孢屬（Rhinocladiella sp.）中發(fā)現(xiàn)了3 種新的細(xì)胞松弛素，試驗結(jié)果表明，它們對多種人腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用[66]。

長春堿（vinblastine）和長春新堿（vincristine）是與紫杉醇相類似的吲哚生物堿，對淋巴瘤和白血病有顯著療效，20世紀(jì)60年代初就在美國上市。但在抗癌藥用植物長春花中，長春堿和長春新堿含量非常低，無法大量生產(chǎn)。郭波等從長春花中分離出能產(chǎn)生長春堿和長春新堿的內(nèi)生真菌[67-68]。Kumar等也從長春花中分離到1株產(chǎn)長春堿和長春新堿的尖孢鐮刀菌AA-CRL-6[69]。Palem等從長春花中分離到的22株內(nèi)生菌中找到1株產(chǎn)長春堿和長春新堿的內(nèi)生真菌CrP20[70]。這些研究為用內(nèi)生真菌生產(chǎn)長春堿開辟了新途徑。

近年來，從植物內(nèi)生真菌特別是藥用植物內(nèi)生真菌中尋找抗癌活性化合物的研究方興未艾，從中發(fā)現(xiàn)分離到的抗腫瘤活性成分至少有數(shù)十種，其活性成分從已知結(jié)構(gòu)到全新結(jié)構(gòu)都有報道[71-73]。來源于不同植物的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生多種抗腫瘤活性物質(zhì)為尋找新的抗腫瘤活性成分開辟了新的途徑，因此具有非常廣闊的研究前景。

3.4?其他類型的活性產(chǎn)物

Lee等報道，自藥用植物雷公藤分離的鐮孢菌屬內(nèi)生真菌頂腐病菌（Fusarium subglutinans）能產(chǎn)生1種非細(xì)胞毒的二萜吡酮類化合物Subglutionol A和Subglutionol B。試驗證明，二者都具有免疫抑制活性[74]。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（mixed lymphocyte reaction，MLR）和胸腺細(xì)胞增殖（thymocyte proliferation，TP）評價系統(tǒng)的IC50都為0.1 μmol/L。與環(huán)孢菌素A（cyclosporin A）相比較，MLR 系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)二者的活性與其相當(dāng)，而TP試驗結(jié)果則顯示環(huán)孢菌素A的活性比前者高104倍。但因為Subglutionol A 和B 缺乏細(xì)胞毒性，所以二者仍具有應(yīng)用前景。

Zhang等從靠近剛果首都金沙薩的非洲熱帶雨林植物中分離到內(nèi)生真菌Pseudomassaria sp.，并從中分離提取出1種非肽類代謝物（L-783，281），該物質(zhì)具有類似胰島素的作用，能顯著降低小鼠血液中葡萄糖的含量。因該化合物在口服時不被胃腸道酶破壞、生物利用度高，因而有望開發(fā)成口服類似胰島素藥物[75]。

Harper等從巴布亞新幾內(nèi)亞生長的植物欖仁樹（Terminalia morobensis）的內(nèi)生真菌P. microspora中分離到了2種化合物pestacin和isopestacin。試驗證實，二者既具有抗菌活性，又有抗氧化活性。pestacin是一種消旋體，試驗發(fā)現(xiàn)其抗氧化活性至少比奎諾二甲基丙烯酸酯（trolox，維生素E的派生物）大1個數(shù)量級。isopestacin的結(jié)構(gòu)與黃酮類物質(zhì)（flavanoids）相似，在緩沖液中，它可以消除超氧自由基和羥基自由基[76]。

豐富多樣的內(nèi)生菌活性代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，激發(fā)了研究者更大的研究興趣，也進(jìn)一步拓寬了從自然界中提取新物質(zhì)的渠道。

4?植物內(nèi)生菌研究存在的問題與展望

目前，對植物內(nèi)生菌的研究還處于早期水平，研究的植物類群不過數(shù)百種，相對于數(shù)量龐大的內(nèi)生菌種類來說，僅涉及了其中很小一部分。由于研究的角度、內(nèi)容不盡相同，因此不同學(xué)者也提出了一些不同的觀點。王志偉等認(rèn)為，由于缺少可靠的試驗數(shù)據(jù)支持，內(nèi)生菌的數(shù)量在100萬種以上的說法有待商榷[77-78]。植物內(nèi)生菌及其代謝產(chǎn)物的研究雖然取得了一定的成果，但其中也發(fā)現(xiàn)不少問題，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：（1）即使用不同營養(yǎng)的培養(yǎng)基，也不能保證所有生活在植物組織內(nèi)的內(nèi)生菌能夠全部被分離出來，專性寄生內(nèi)生菌不能在人工培養(yǎng)基上生長;同時，一些生長緩慢的內(nèi)生菌由于受快速生長的內(nèi)生菌的抑制也往往被遺漏。（2）內(nèi)生菌的鑒定較為困難。雖然有時分離到內(nèi)生菌，但是有的菌株在人工培養(yǎng)基上不會產(chǎn)生孢子。從已有的研究結(jié)果來看，不產(chǎn)孢菌株數(shù)占總菌株數(shù)的比例高達(dá)41.3 %，這些不產(chǎn)孢菌株是無法用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法來進(jìn)行鑒定的[4]。（3）內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物種類多但每個種類產(chǎn)量甚微，加大了新化合物分離的難度，容易出現(xiàn)漏失。即使分離到一些新化合物，往往因為量太少，不足以完成結(jié)構(gòu)鑒定和活性測定的需要，導(dǎo)致分離物無法定性。

正是這些不足和問題的存在，促使研究者在更廣的領(lǐng)域?qū)χ参飪?nèi)生菌進(jìn)行更深的研究：（1）在內(nèi)生菌的分離與鑒定方面，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，指紋圖譜分析、DGGE、DNA-DNA雜交及G+C的摩爾比例測定等分子生物學(xué)方法已經(jīng)被用來分析一些不可培養(yǎng)型內(nèi)生菌群落的結(jié)構(gòu)及差異[27，78]，內(nèi)生菌的生物多樣性也擴(kuò)展了。（2）在次生代謝產(chǎn)物方面，內(nèi)生菌有無在長期的進(jìn)化過程中形成與宿主植物的協(xié)同代謝或基因的誘導(dǎo)表達(dá)來產(chǎn)生新的生物活性物質(zhì)和接受外在調(diào)控，這些都是值得研究和讓人期待的。（3）有關(guān)植物內(nèi)生菌的起源和系統(tǒng)進(jìn)化、內(nèi)生菌在宿主中的種群組成和相互關(guān)系、內(nèi)生菌與宿主植物對外在環(huán)境的作用機(jī)制等方面尚待更深入的研究。

植物內(nèi)生菌是個巨大的微生物新資源，具有重要的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與醫(yī)藥應(yīng)用潛力。從特殊生境植物和傳統(tǒng)的藥用植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中篩選具有藥用價值的活性物質(zhì)或新型化合物以創(chuàng)制新藥，解決自然資源不足、開發(fā)緊缺藥物及新型藥物，將在很大程度上豐富人類的藥物寶庫。同時，植物內(nèi)生菌通過生物固氮、調(diào)節(jié)植物激素等作用促進(jìn)宿主植物的生長和產(chǎn)量增加，以及對病蟲害的生物防治和對污染土壤的生物修復(fù)作用，減少了化肥和化學(xué)藥劑的使用，對全球農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有深遠(yuǎn)的意義。

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