新疆某規(guī)模化驢場(chǎng)奶驢乳房炎的臨床及實(shí)驗(yàn)室診斷

高靜雯 曾宗波 武磊 張莉 齊亞銀

摘要：為查明導(dǎo)致新疆某規(guī)模化驢場(chǎng)奶驢乳房炎的主要致病菌及其發(fā)病原因，首先進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查，后對(duì)20頭奶驢（13頭患乳房炎、7頭健康）的血常規(guī)進(jìn)行檢測(cè)，并無菌采集13頭臨床型奶驢乳房炎的奶樣，采用常規(guī)微生物學(xué)方法進(jìn)行病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)。研究結(jié)果表明，本次乳房炎的發(fā)生與奶驢營(yíng)養(yǎng)不良和養(yǎng)殖環(huán)境差息息相關(guān)，其中乳房炎組與健康組相比，血紅蛋白、紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞比例等均有所下降，其余指標(biāo)變化不明顯。同時(shí)，從乳汁中共分離鑒定到16株細(xì)菌，其中大腸桿菌13株，鏈球菌3株;藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌對(duì)鏈霉素、恩諾沙星、氟苯尼考的敏感率都在75%以上，對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率在60%以上;鏈球菌對(duì)青霉素、氨芐西林、氟苯尼考的敏感率都在60%以上，但對(duì)恩諾沙星耐藥率達(dá)到100%。研究結(jié)果揭示，盡管關(guān)于奶驢乳房炎發(fā)病率的報(bào)道較少，但通過本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中各種細(xì)菌對(duì)奶驢乳房炎的威脅不容小覷，且本次分離到的病原菌已經(jīng)表現(xiàn)出比較嚴(yán)重的耐藥性。

關(guān)鍵詞：驢;乳房炎;生化鑒定;藥敏試驗(yàn);血細(xì)胞分析

中圖分類號(hào)： S858.22?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0196-04

乳房炎是奶牛和奶山羊的常見高發(fā)病，產(chǎn)奶驢也有發(fā)生，以乳房發(fā)熱、腫脹、疼痛、乳汁不通為主[1]。驢乳房炎，主要是由于驢乳腺受微生物、物理、化學(xué)和環(huán)境等因素刺激從而產(chǎn)生的一類炎癥反應(yīng)。驢和其他馬屬動(dòng)物一樣，哺乳期能產(chǎn)奶，奶驢泌乳期一般可達(dá)到7～8個(gè)月，驢的產(chǎn)乳量：驢產(chǎn)奶因品種不同標(biāo)準(zhǔn)不一，產(chǎn)后1.5～4個(gè)月處于高產(chǎn)期，日單產(chǎn)最高可達(dá)3.5～4.0 kg，平均1.5～1.8 kg[2]。驢奶具有較高的開發(fā)利用價(jià)值，Malacarne等發(fā)現(xiàn)驢奶具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其主要成分與人奶非常相近，可作為人乳的替代品，同時(shí)還具有較高的藥用價(jià)值，《本草綱目》中記載：“驢乳，氣味甘，冷利，無毒，熱頻飲之可治氣郁，解小兒熱毒，不生痘疹”[3]。因此，驢乳房炎不僅對(duì)養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，更對(duì)動(dòng)物性食品安全與畜牧行業(yè)的發(fā)展造成了巨大的安全隱患。

2018年6月，新疆某規(guī)模化驢場(chǎng)在采集驢奶時(shí)發(fā)現(xiàn)驢奶出現(xiàn)異常，其中有13頭驢出現(xiàn)典型乳房炎癥狀，奶汁呈絮狀，黃褐色泛黑。驢乳房炎給驢場(chǎng)帶來了奶產(chǎn)量和奶質(zhì)量降低、驢奶的廢棄，甚至患驢的淘汰等較大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對(duì)該規(guī)?；H場(chǎng)中病驢進(jìn)行驢乳房炎致病菌的分離鑒定，并對(duì)這13頭采樣驢和7頭健康驢進(jìn)行血細(xì)胞成分分析測(cè)定，旨在明確引起驢乳房炎的主要病原菌種類，并探討乳房炎患驢和健康驢血細(xì)胞成分的關(guān)系。

1?試驗(yàn)材料

1.1?病料來源

采集新疆某規(guī)模化驢場(chǎng)明顯發(fā)作驢乳房炎的13頭驢的奶樣。采集時(shí)，先對(duì)乳頭進(jìn)行消毒，棄掉前5～10 mL驢乳后無菌采集乳樣5 mL左右。

1.2?主要試劑和儀器

培養(yǎng)基：LB肉湯、LB瓊脂、伊紅-美蘭瓊脂（EMB）;麥康凱培養(yǎng)基（MAC）均購自北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司;腦心浸出液肉湯（BHI）（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）;羊血瓊脂;鏈球菌選擇培養(yǎng)基。

鑒定用培養(yǎng)基及試劑：硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖、七葉苷（青島高科技生物園海博生物有限公司）。

藥敏紙片：包括β-內(nèi)酰胺類3種：青霉素（10 μg，P）、氨芐西林（10 μg，AMP）、阿莫西林（10 μg，AMC）;氨基糖苷類2種：慶大霉素（10 μg，GEN）、鏈霉素（10 μg，STR）;喹諾酮類1種：恩諾沙星（15 μg，ENR）;酰胺醇類1種：氟苯尼考（30 μg，F(xiàn)FC）;大環(huán)內(nèi)酯類1種：紅霉素（10 μg，E）;均購自杭州微生物試劑有限公司。

儀器：顯微鏡（型號(hào)CX21FS1），血細(xì)胞分析儀（XFA6100A型），隔水式恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器廠），凈化工作臺(tái)（上海鴻都電子科技有限公司）。

2?試驗(yàn)方法

2.1?現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查及血常規(guī)分析

2.1.1?現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查

采用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查的手段和方法，查找導(dǎo)致該次奶驢乳房炎暴發(fā)的主要因素，包括天氣、環(huán)境、飼養(yǎng)、擠奶情況以及發(fā)病率、死亡率等。

2.1.2?血常規(guī)檢測(cè)

從該標(biāo)準(zhǔn)化驢場(chǎng)通過頸靜脈采血的方法[4]，采集13頭發(fā)病驢的血液和7頭健康母驢的血液進(jìn)行血細(xì)胞成分的檢測(cè)。

判定標(biāo)準(zhǔn)：參考《獸醫(yī)檢驗(yàn)》[5]和姜生成等的研究中驢的血細(xì)胞成分標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行分析（表1）。

2.2?細(xì)菌分離、培養(yǎng)及純化

首先加入適量采集的奶樣到普通LB肉湯進(jìn)行 12 h 搖床培養(yǎng)，然后分別接種到不同的固體培養(yǎng)基上，包括LB平板、麥康凱培養(yǎng)基及血平板上，置于37 ℃溫箱培養(yǎng) 24 h，觀察菌落及菌體的形態(tài)學(xué)特征;然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純化，保存菌株，待進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

2.3?細(xì)菌的生化鑒定

將純化后的單個(gè)菌落分別接種于硫化氫、苯丙氨酸、葡萄糖酸鹽、蛋白胨水、葡磷胨水、枸櫞酸鹽、尿素、賴氨酸、鳥氨酸、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞花醇、木膠糖、七葉苷等鑒定培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)6～48 h，觀察試驗(yàn)結(jié)果（表2）。

2.4?藥敏試驗(yàn)

藥物敏感性試驗(yàn)按照CLSI推薦的K-B（Kirby-Bauer）法進(jìn)行[7]，將純化的菌株分別在LB肉湯培養(yǎng)18～24 h，用移液槍吸取500 μL菌液置于普通LB瓊脂平板上，用涂布器進(jìn)行涂勻，反復(fù)、多次涂抹，待菌液快干燥時(shí)，在平板上均勻貼上5片不同的藥敏紙片，置于溫箱培養(yǎng)18～24 h后測(cè)量抑菌環(huán)的直徑，根據(jù)抑菌圈的大小判斷其對(duì)抗菌藥的敏感性。判定標(biāo)準(zhǔn)見表3。

3?試驗(yàn)結(jié)果

3.1?現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

養(yǎng)殖規(guī)模：擠奶驢872頭，公驢23頭。

發(fā)病時(shí)間：2018年6月份。

擠奶設(shè)備：移動(dòng)式手工輔助擠奶設(shè)備，主要依靠人工擠奶，擠奶時(shí)未做消毒處理。

發(fā)病率與死亡率：13頭驢出現(xiàn)典型乳房炎癥狀，奶汁呈絮狀，黃褐色或者黑色;無奶驢死亡。

飼養(yǎng)方式及營(yíng)養(yǎng)比例：半舍飼化飼養(yǎng)，主要飼喂玉米秸稈、玉米及少量苜蓿，均采用自由采食方式。

3.2?血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)發(fā)病驢和健康驢的血液，由表4可知，健康驢的血細(xì)胞的數(shù)據(jù)都是在驢血細(xì)胞標(biāo)注的數(shù)據(jù)范圍內(nèi)有小幅度波動(dòng);發(fā)病驢的血細(xì)胞大部分?jǐn)?shù)量相比下降了，紅細(xì)胞、血紅蛋白、粒細(xì)胞比率及淋巴細(xì)胞比率均有所下降。

3.3?細(xì)菌分離純化及形態(tài)學(xué)結(jié)果

將13份奶樣進(jìn)行接種培養(yǎng)，分離出16株可疑菌株，通過麥康凱培養(yǎng)基、伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基、以及鏈球菌選擇培養(yǎng)基的培養(yǎng)，觀察其菌落及菌體的形態(tài)，其中13株菌疑似大腸桿菌（圖1），3株疑似鏈球菌（圖2）。所有株菌在普通LB培養(yǎng)基上都長(zhǎng)出邊緣光滑且規(guī)則的菌落，其中13株菌落較大1.0～2.5 mm，3株菌落較小直徑為1.0～1.5 mm;13株菌在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出粉紅色圓滑的菌落（圖3），在伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出具有金屬光澤的菌落（圖4），革蘭氏染色鏡檢可見革蘭氏陰性、粉紅色、兩端鈍圓的短桿狀菌[8];剩余3株菌在鏈球菌選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出了圓形、隆起、光滑、濕潤(rùn)、露滴狀菌落（圖5），同時(shí)在血平板上長(zhǎng)出了光滑、伽馬-溶血狀、半透明邊緣的菌落[9]（圖6）。

3.4?生理生化鑒定結(jié)果

對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行生理生化特性鑒定，進(jìn)一步探究細(xì)菌的特性?觀察鑒定試劑的顏色變化情況以及是否有產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況等，結(jié)果見表5。

由表5可知，疑似為大腸桿菌的13株菌生化鑒定結(jié)果基本一致，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象，蛋白胨水和葡磷胨水都變成紅色陽性，賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)陽性，能發(fā)酵山梨醇、棉子糖、側(cè)金盞花醇和木膠糖，其生化特性符合大腸桿菌的特性[10];另外3株菌的生化鑒定顯示其能發(fā)酵山梨醇、棉子糖、木膠糖，并且不能使七葉苷水解，其特性基本符合鏈球菌的特征。

3.5?藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表6可知，2類菌同時(shí)對(duì)鏈霉素和氟苯尼考都是高敏的;大腸桿菌對(duì)氟苯尼考最敏感，敏感率92%;對(duì)恩諾沙星和鏈霉素敏感率分別84.6%和76.9%;對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物較為耐藥，氨芐西林和阿莫西林耐藥率均是61.5%，青霉素更是100%耐藥。鏈球菌則是對(duì)氨芐西林、阿莫西林和氟苯尼考有100%的高度敏感率;對(duì)青霉素和鏈霉素也較為敏感，敏感率為66.7%;對(duì)恩諾沙星則完全耐藥。

4?分析與討論

導(dǎo)致各種動(dòng)物乳房炎的最直接原因主要是病原微生物的感染[11]，例如葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、變形桿菌、沙門氏菌、腸桿菌屬、棒狀桿菌屬、酵母菌、支原體等[12]。其中大腸桿菌性乳房炎常引起急性炎癥，使乳房炎從隱性乳房炎轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型[13]，鏈球菌性乳房炎往往是由于飼養(yǎng)環(huán)境造成的。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)病驢血紅蛋白和紅細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，淋巴細(xì)胞不具有吞噬作用，其比例下降說明自身免疫力下降;粒細(xì)胞比率下降，白細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明由于有炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致其產(chǎn)生抗體來抵抗病原菌，這與張銀亮關(guān)于乳房炎的發(fā)生與免疫力之間相關(guān)性的內(nèi)容相符[14]。同時(shí)該驢場(chǎng)的飼養(yǎng)管理差、環(huán)境不良、營(yíng)養(yǎng)水平低也是導(dǎo)致發(fā)生乳房炎的誘因，而且對(duì)發(fā)病驢群也沒有采取隔離措施，擠奶設(shè)備也沒有分開使用。

近年，乳房炎在奶牛上為高發(fā)病，因此研究得也較為透徹，而驢的乳房炎鮮有報(bào)道。根據(jù)藥敏試驗(yàn)及血常規(guī)分析，分離株已經(jīng)表現(xiàn)明顯的耐藥性，建議該場(chǎng)采用中藥和高敏抗炎藥物相結(jié)合的方式進(jìn)行該病的綜合防控[1]，尤其要有“防大于治”的思維，定期對(duì)驢奶進(jìn)行乳液中體細(xì)胞數(shù)量檢測(cè)或CMT（加州乳房炎檢測(cè)法）進(jìn)行檢測(cè)，避免隱性乳房炎轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床型乳房炎[15]。

本研究通過現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查、血常規(guī)檢測(cè)和細(xì)菌的分離鑒定及藥敏相結(jié)合的方式，查明了導(dǎo)致新疆某規(guī)?；H場(chǎng)奶驢乳房炎的發(fā)病原因，為控制該場(chǎng)奶驢乳房炎的蔓延提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究驢乳房炎提供了科學(xué)支撐。

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