基于線粒體DNA控制區(qū)序列的團(tuán)頭魴3個(gè)選育群體遺傳變異分析

唐首杰 畢詳 張飛明 張友良

摘要：為從遺傳多樣性的角度來(lái)了解團(tuán)頭魴3個(gè)選育群體的選育潛力，以團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育奠基群體（F0）為對(duì)照組，采用線粒體DNA控制區(qū)標(biāo)記評(píng)估團(tuán)頭魴3個(gè)選育群體的遺傳多樣性，分析它們的選育潛力。結(jié)果顯示，在3個(gè)選育群體的72條序列中共確定40種單倍型，群體間存在5種共享單倍型，3個(gè)選育群體線粒體DNA控制區(qū)序列的單倍型多樣性（H）范圍為0.670～0.978，核苷酸多樣性（π）范圍為0.004 16～0.006 23，平均核苷酸差異數(shù)（K）范圍為3.935～5.960，群體內(nèi)核苷酸序列間平均遺傳距離范圍為0.003 561～0.004 538，3個(gè)選育群體的遺傳多樣性水平（H、π、K）略高于F0群體。3個(gè)選育群體間Kimura雙參數(shù)遺傳距離和遺傳分化指數(shù)（FST）范圍分別為0.004 039～0.004 700 和0.046 4～0.138 6。3個(gè)選育群體間成對(duì)FST值差異均顯著（P<0.05），3個(gè)選育群體與F0群體間成對(duì)FST值差異均極顯著（P<0.01）。說(shuō)明3個(gè)選育群體的遺傳多樣性較高，選育潛力較大;同時(shí)，選育群體間均存在顯著的遺傳分化，可見(jiàn)不同方向上的累代人工選育已在一定程度上改變了選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：團(tuán)頭魴;選育群體;遺傳變異;線粒體DNA;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)： S931.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0191-05

在魚類育種過(guò)程中，維持魚類選育群體遺傳多樣性，一方面可提高選育群體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和對(duì)疾病的抵抗力[1]，另一方面足夠的遺傳變異水平對(duì)保持長(zhǎng)期選育過(guò)程中的選擇反應(yīng)具有重要作用[2]。在實(shí)際的魚類選育工作中，育種工作者通常采用科學(xué)合理的方案對(duì)魚類的重要經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行有計(jì)劃、有目的的選擇，如保持足夠大的親本群體、創(chuàng)造適宜的養(yǎng)殖環(huán)境等。然而，選育條件下魚類的繁殖多是在人工控制條件下進(jìn)行的，在進(jìn)行人工繁殖的過(guò)程中，親本對(duì)的選擇不可能是完全隨機(jī)的，因此，封閉的選育群體仍可能受到非隨機(jī)交配、遺傳漂變等因素的影響，從而導(dǎo)致遺傳多樣性的下降和稀有等位基因的喪失，并進(jìn)一步增加近交衰退的風(fēng)險(xiǎn)[3]。近年來(lái)許多研究顯示，累代人工選育致使魚類選育群體遺傳多樣性逐代降低[4-5]。Gallardo等的研究表明，銀大馬哈魚（Oncorhynchus kisutch）經(jīng)連續(xù)4代人工選育后，選育群體近交率高達(dá)9.5%，平均每代近交率約為2.45%，近交導(dǎo)致選育群體繁殖力顯著下降[6]。因此，在長(zhǎng)期的魚類選育過(guò)程中，及時(shí)監(jiān)測(cè)選育群體內(nèi)遺傳變異水平，保持選育群體的遺傳多樣性，是長(zhǎng)期選育工作獲得最終成功的保證[7-8]。

團(tuán)頭魴浦江1號(hào)是經(jīng)16年6代高強(qiáng)度系統(tǒng)選育而成的首例草食性魚類選育良種[9]。自浦江1號(hào)審定以來(lái)，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源研究室堅(jiān)持繼續(xù)選育，至今已達(dá)第10代（F10）。鑒于沒(méi)有永遠(yuǎn)的良種這一理念和推陳出新的時(shí)代要求，筆者所在研究室在浦江1號(hào)良種（F10）的基礎(chǔ)上，基于配套系育種理念[10]，以不同選育目標(biāo)分別建立3個(gè)團(tuán)頭魴配套選育系，并對(duì)這3個(gè)配套育種群體進(jìn)行連續(xù)多代的選育純化，而連續(xù)世代的選育對(duì)選育群體遺傳多樣性影響程度、3個(gè)選育群體是否存在繼續(xù)選育的潛力，至今尚未有精確的遺傳檢測(cè)手段來(lái)進(jìn)行定量評(píng)估。

魚類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）具有分子小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度快、遵從母系遺傳等特點(diǎn)[11]，而mtDNA控制區(qū)是整個(gè)mtDNA序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域，已被成功應(yīng)用于褐鱒（Salmo trutta）[12]、鯉（Cyprinus carpio L.）[13]、紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）[14]等養(yǎng)殖魚類種群遺傳多樣性的檢測(cè)和評(píng)估。

本研究以團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育奠基群體（F0）為對(duì)照組，通過(guò)mtDNA控制區(qū)序列變異來(lái)評(píng)估團(tuán)頭魴3個(gè)選育群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，分析它們的選育潛力，為選育群體遺傳性能的保護(hù)提供依據(jù)，并為下一步配套系選育工作提供理論指導(dǎo)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

對(duì)照組為團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育奠基群體（F0），系1985年淤泥湖團(tuán)頭魴原種在上海海洋大學(xué)魚類種質(zhì)研究試驗(yàn)站自繁的后代;試驗(yàn)組為3個(gè)團(tuán)頭魴選育群體，其來(lái)源和性質(zhì)如下：（1）選育群體A（以下簡(jiǎn)稱A），團(tuán)頭魴浦江1號(hào)選育系F10;（2）選育群體B（以下簡(jiǎn)稱B），以人工誘導(dǎo)異源四倍體群體（團(tuán)頭魴浦江1號(hào)♀×三角魴[XZ（20#]♂[XZ）]）[15]為奠基群體，經(jīng)群體選育的第3代（F3）;（3）選育群體C（以下簡(jiǎn)稱C），以團(tuán)頭魴連續(xù)2代人工誘導(dǎo)減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體[16]為奠基群體，經(jīng)群體選育的第3代（F3）。對(duì)照組群體采自上海海洋大學(xué)魚類種質(zhì)研究試驗(yàn)站，試驗(yàn)組群體均采自上海市松江區(qū)水產(chǎn)良種場(chǎng)。群體A、群體B和群體C的采樣數(shù)均為24尾，F(xiàn)0群體采樣12尾，剪取每尾試驗(yàn)魚的尾鰭，編號(hào)后于95%乙醇中保存?zhèn)溆?。前期采樣工作?017年1月完成，后續(xù)實(shí)驗(yàn)室分析工作于2017年7—9月在上海海洋大學(xué)淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?基因組DNA提取

基因組DNA提取采用常規(guī)的酚/三氯甲烷法[17]進(jìn)行。

1.2.2?線粒體DNA控制區(qū)引物設(shè)計(jì)

團(tuán)頭魴線粒體DNA控制區(qū)（D-loop區(qū)）位于轉(zhuǎn)脯氨酸（tRNA-Pro）基因和轉(zhuǎn)苯丙氨酸（tRNA-Phe）基因之間，根據(jù)GenBank中已報(bào)道的團(tuán)頭魴線粒體DNA全序列（登錄號(hào)為NC_010341.1），利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer3[18]設(shè)計(jì)D-loop區(qū)的正向引物和反向引物。引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。所有引物均由生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.3?PCR擴(kuò)增及檢測(cè)

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler gradient PCR儀上進(jìn)行，樣品的反應(yīng)總體積為 50 μL，包括正向引物2.5 μL（5 μmol/L）、反向引物2.5 μL（5 μmol/L）、2×PCR Reagent 25 μL、DNA模板1 μL、無(wú)菌水19 μL;PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56.4 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%進(jìn)口分子生物學(xué)級(jí)瓊脂糖凝膠（含0.5 g/mL EB）電泳，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓為 5 V/cm，經(jīng)1.5 h后，用Gene Genius凝膠成像系統(tǒng)拍照、記錄和分析。

1.2.4?DNA序列測(cè)定

所有樣品委托生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行純化和單向測(cè)序，測(cè)序引物為控制區(qū)的正向引物（F），序列測(cè)定儀為美國(guó)ABI公司PRISM 3730型全自動(dòng)序列分析儀。

1.3?數(shù)據(jù)處理和分析

用BLAST軟件[19]搜索GenBank中團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala ，序列登錄號(hào)為NC_010341.1）的線粒體DNA控制區(qū)序列，與本試驗(yàn)測(cè)得的團(tuán)頭魴相應(yīng)序列結(jié)果進(jìn)行同源性比較;然后用BioEdit軟件[20]對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，用Clustal W軟件[21]進(jìn)行序列重排和同源比較，并進(jìn)行人工核對(duì)校正。用DNAsp 4.10軟件[22]計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性（haplotype diversity，H）[23]、核苷酸多樣性（nucleotide diversity，π）[24]和平均核苷酸差異數(shù)（average number of nucleotide differences，K），序列變異中性檢驗(yàn)（neutrality test）用Tajima的D統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)[25]。單倍型多樣性（H）和核苷酸多樣性（π）計(jì)算公式如下：

式中：n為群體樣本大小;pi為第i個(gè)單倍型在群體中出現(xiàn)的頻率;k為單倍型數(shù)目;xij為第i個(gè)核苷酸（A、G、C或T）在序列中的第j位點(diǎn)上的頻率;L為序列的長(zhǎng)度。

用Arlequin 3.01軟件[26]估測(cè)群體間成對(duì)FST值[27]，并利用置換檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（重復(fù)次數(shù)為1 000）。

采用分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）估算各群體間和群體內(nèi)的遺傳變異及分化水平。通過(guò)3種分子遺傳變量進(jìn)行分析：FST為群體內(nèi)個(gè)體之間的遺傳變異;FSC為組內(nèi)各群體間的變異程度;FCT為不同組別之間的遺傳變異程度。并用置換檢驗(yàn)法進(jìn)行1 000次重復(fù)模擬計(jì)算，以上運(yùn)算在Arlequin 3.01軟件[26]中完成。

用MEGA 4.0軟件包[28]根據(jù)Kimura Two-Parameter法[29]計(jì)算群體內(nèi)和群體間核苷酸序列的兩兩間遺傳距離，用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）和鄰接法（neighbour-joining method，NJ）構(gòu)建群體間的分子系統(tǒng)樹（kimura two-parameter法估算遺傳距離）。

2?結(jié)果與分析

2.1?PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定及排序結(jié)果

4個(gè)團(tuán)頭魴群體共84個(gè)個(gè)體的線粒體DNA控制區(qū)片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，各擴(kuò)增片段經(jīng)同源重排后的長(zhǎng)度（不包括插入/缺失）為962 bp。

2.2?4個(gè)團(tuán)頭魴群體的遺傳結(jié)構(gòu)

2.2.1?群體內(nèi)遺傳多樣性分析

4個(gè)團(tuán)頭魴群體內(nèi)的單倍型分布及頻率見(jiàn)表2。在所分析的84條序列中，確定了46種單倍型，F(xiàn)0群體與其他3個(gè)選育群體間無(wú)共享單倍型，3個(gè)選育群體間存在5種共享單倍型，其中單倍型H1為A群體、B群體和C群體所共享，單倍型H10為A群體和C群體所共享，單倍型H13、H17和H18為B群體和C群體所共享。F0群體中出現(xiàn)頻率最高的單倍型為H41，H1分別為A群體、B群體和C群體中出現(xiàn)頻率最高的單倍型。

4個(gè)團(tuán)頭魴群體內(nèi)的遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表3。各群體內(nèi)單倍型數(shù)范圍為6～19，其中C群體的單倍型數(shù)最多，F(xiàn)0群體的單倍型數(shù)最少。4個(gè)團(tuán)頭魴群體內(nèi)線粒體DNA控制區(qū)的單倍型多樣性（H）在0.670～0.978之間，其中C群體的單倍型多樣性最高，A群體的單倍型多樣性最低，單倍型多樣性在4個(gè)群體中的變化趨勢(shì)由高到低依次為C群體>B群體>F0群體>A群體。

4個(gè)團(tuán)頭魴群體內(nèi)線粒體DNA控制區(qū)核苷酸多態(tài)位點(diǎn)數(shù)在11～22之間，核苷酸多樣性（π）在0.00267～0.00623之間，平均核苷酸差異數(shù)（K）的范圍為2.485～5.960;群體內(nèi)個(gè)體間平均核苷酸差異數(shù)和核苷酸多樣性在4個(gè)群體中的變化趨勢(shì)一致，即C群體>B群體>A群體>F0群體。A群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最多（22個(gè)），F(xiàn)0群體的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)最少（11個(gè)）。3個(gè)團(tuán)頭魴選育群體Tajima's D中性檢驗(yàn)均不顯著，符合中性突變。

總體而言，C群體遺傳多樣性水平最高，F(xiàn)0群體遺傳多樣性水平最低，3個(gè)團(tuán)頭魴選育群體遺傳多樣性水平高于F0群體。

2.2.2?群體間遺傳距離和遺傳分化

如表4所示，4個(gè)團(tuán)頭魴群體內(nèi)線粒體DNA控制區(qū)核苷酸序列間的平均遺傳距離在0.002 526～0.004 538之間，在4個(gè)群體間的變化趨勢(shì)為C群體>B群體>A群體>F0群體，這與上文中的核苷酸多樣性（π）、平均核苷酸差異數(shù)（K）的分析結(jié)果一致。

4個(gè)團(tuán)頭魴群體間的平均遺傳距離在0.004 039～0.006 140 之間，F(xiàn)0群體與C群體間的遺傳距離最大，為 0.006 140，A群體與B群體間的遺傳距離最小，為 0.004 039。對(duì)于3個(gè)選育群體而言，A群體與C群體間遺傳距離最大，為0.004 700。

如表5所示，群體間的遺傳分化指數(shù)（FST）在0.046 4～0.396 7之間，F(xiàn)0群體與C群體之間的遺傳分化指數(shù)最高，為0.396 7，B群體與C群體之間的遺傳分化指數(shù)最低，為 0.046 4。從群體間顯著分化的P值（0.000 0～0.036 0）可以推斷，群體間成對(duì)FST值差異均顯著（P<0.05），表明所有群體間均存在顯著的遺傳分化。

2.2.3?分子方差分析（AMOVA）

本研究對(duì)4個(gè)團(tuán)頭魴群體進(jìn)行分組（1個(gè)組、2個(gè)組、3個(gè)組），從不同角度對(duì)群體遺傳變異進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）。結(jié)果（表6）顯示，在任何一種分組條件下，F(xiàn)ST值都達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），說(shuō)明群體內(nèi)個(gè)體間的遺傳分化極顯著。當(dāng)把所有群體分成2個(gè)組或3個(gè)組時(shí)，F(xiàn)SC值均達(dá)到顯著（P<0.05）或極顯著水平（P<0.01），表明群體間存在顯著或極顯著的遺傳分化，這證實(shí)了群體間遺傳分化指數(shù)（FST值）的分析結(jié)果。將4個(gè)群體分成2個(gè)組時(shí)，4個(gè)群體在2種分組模式下（模式1：F0群體為一組，其余群體為另一組;模式2：F0群體和A群體為一組，B群體和C群體為另一組），F(xiàn)CT值達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），表明組別之間存在極顯著的遺傳分化。將4個(gè)群體分成3個(gè)組時(shí)，僅在1種分組模式下（F0群體為第1組，A群體為第2組，B群體和C群體為第3組），F(xiàn)CT值達(dá)到顯著水平（P<0.05）。此外，在其他分組模式下，F(xiàn)CT值均未達(dá)到顯著水平。

2.2.4?聚類分析

如圖1所示，因聚類方法的差異，2種聚類圖顯示了各自的特點(diǎn)，很難說(shuō)哪種聚類圖最能反映真實(shí)的群體間遺傳關(guān)系，但2種聚類圖均顯示，B群體和C群體可被聚為一類，F(xiàn)0群體和B群體間聚類關(guān)系較遠(yuǎn)，這也驗(yàn)證了上文中分子方差分析的結(jié)果。

3?討論與結(jié)論

3.1?團(tuán)頭魴3個(gè)選育群體的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性是魚類育種群體具有選育潛力的物質(zhì)基礎(chǔ)，只有保持選育群體的遺傳多樣性，才能獲得持續(xù)的遺傳進(jìn)展，從而保證魚類選育工作的可持續(xù)開展。線粒體DNA標(biāo)記是評(píng)價(jià)魚類群體遺傳多樣性水平的有效工具之一[30]，以線粒體DNA序列變異為基礎(chǔ)估算的單倍型多樣性、核苷酸多樣性等參數(shù)是衡量群體遺傳多樣性的重要參數(shù)。單倍型多樣性是指從樣本中隨機(jī)抽取到2個(gè)不同單倍型的頻率[23]，單倍型多樣性越高，說(shuō)明群體內(nèi)遺傳多樣性水平越高。Nei等將核苷酸多樣性定義為給定群體中隨機(jī)選取的DNA序列間平均每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)目，其值越大，表明群體內(nèi)的遺傳多樣性越高[24]。

在本研究中，3個(gè)選育群體的單倍型多樣性為0.670～0.978（平均值為0.869 3），核苷酸多樣性為0.004 16～0.006 23（平均值為0.005 06），均略高于F0群體，說(shuō)明長(zhǎng)期的選育并未顯著影響選育群體的遺傳多樣性。這與其他魚類選育群體遺傳多樣性研究結(jié)果不同[4-5]，已有的研究結(jié)果顯示，連續(xù)多代選育群體的遺傳多樣性水平低于選育奠基群體[4]或野生對(duì)照群體[5]。而在本研究中，F(xiàn)0群體在累代的自繁過(guò)程中，可能因隨機(jī)遺傳漂變的作用而造成群體內(nèi)近交程度不斷增加，最終導(dǎo)致群體遺傳多樣性下降。進(jìn)一步將本研究中的3個(gè)選育群體遺傳多樣性結(jié)果與國(guó)內(nèi)外其他魚類選育群體的線粒體DNA遺傳多樣性研究結(jié)果比較后可以發(fā)現(xiàn)，本研究中3個(gè)選育群體的遺傳多樣性參數(shù)（單倍型多樣性、核苷酸多樣性）均高于草魚（Ctenopharyngodon idella）[5]、松浦鯉（C. carpio ‘Songpu Carp）[31]、奧利亞羅非魚（Oreochromis aureus）[32]、褐鱒（Salmo trutta）[12]、鯉（C. carpio L.）[13]、紅大馬哈魚（Oncorhynchus nerka）[14]等魚類的選育群體的相應(yīng)參數(shù)。綜上所述，本研究中的3個(gè)團(tuán)頭魴選育群體歷經(jīng)多代選育后仍保持著較高水平的遺傳多樣性，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的選育純化和種質(zhì)資源聚合利用的潛力較大。

3.2?團(tuán)頭魴3個(gè)選育群體間的遺傳分化

遺傳分化在本質(zhì)上是基因頻率的概率變化及其雜合性變化的度量[33]，而人工定向選育通過(guò)改變?nèi)后w的基因頻率來(lái)促使遺傳分化的產(chǎn)生。遺傳分化指數(shù)（FST）常用于度量群體間遺傳分化的相對(duì)大小，其數(shù)值越大，表明2個(gè)群體間的遺傳分化水平越高。本研究中，3個(gè)選育群體間遺傳分化指數(shù)（FST）為0.046 4～0.138 6，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果均顯示（P<0.05），群體間遺傳分化已達(dá)顯著水平，此外，選育奠基群體F0與3個(gè)選育群體間的遺傳分化指數(shù)（FST）為0.257 2～0.396 7，顯著性檢驗(yàn)結(jié)果也顯示，3個(gè)選育群體與F0群體間遺傳分化已達(dá)極顯著水平（P<0.01）。以上結(jié)果表明，不同方向上的累代人工選育在一定程度上改變了選育群體的遺傳結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生了不同方向的變化，而這種現(xiàn)象正是育種工作者希望看到的結(jié)果，因?yàn)橥ㄟ^(guò)連續(xù)多代的選育純化，可以使選育群體遺傳結(jié)構(gòu)逐步趨向穩(wěn)定，為配套系育種提供優(yōu)異親本。

3.3?選育群體間種質(zhì)資源聚合利用探討

雜種優(yōu)勢(shì)利用是魚類配套系育種的重要課題之一，也是魚類優(yōu)異種質(zhì)資源聚合利用的基礎(chǔ)，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)雜種優(yōu)勢(shì)對(duì)加快配套系選育進(jìn)程具有重要意義。一般而言，雜種優(yōu)勢(shì)大小與相互雜交的2個(gè)親本群體間的遺傳差異直接相關(guān)。親本群體之間的遺傳差異越大，雜交后代就越可能獲得雜種優(yōu)勢(shì)。親本群體之間的遺傳距離是衡量親本間遺傳差異的一個(gè)重要指標(biāo)，遺傳距離越大，雜交后代的雜種優(yōu)勢(shì)就越強(qiáng)[34]。在本研究中，對(duì)于3個(gè)選育群體而言，群體間Kimura雙參數(shù)遺傳距離顯示，A群體與C群體間遺傳距離最大，為0.004 700，A群體和B群體間的遺傳距離最小，為0.004 039。由此可以預(yù)測(cè)，A群體與C群體進(jìn)行群體間雜交可能獲得較明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，然而A群體和B群體間雜交后代的雜種優(yōu)勢(shì)可能較小。以上結(jié)果為團(tuán)頭魴選育群體優(yōu)異種質(zhì)資源的聚合利用提供了參考。

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