棉花多肽的分離提取方法建立及質(zhì)譜鑒定

袁娜 戴琛 楊郁文 杜建廠 張保龍

摘要：多肽是一類小分子物質(zhì)，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及抗逆等眾多生命過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。旨在探索棉花根部多肽的分離提取方法，建立基于改良尿素法的棉花多肽組樣品收集方法?；谠摲椒?，筆者在棉花根部組織中獲得809個(gè)小分子肽序列，這些多肽的大小在10～70個(gè)氨基酸之間。隨后，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，筆者進(jìn)一步對(duì)獲得的多肽進(jìn)行來(lái)源鑒定和序列分析。通過(guò)功能注釋和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些多肽來(lái)源的基因在結(jié)合和催化活性、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程功能亞類中所占比例最高，并且這些基因大多分布在細(xì)胞質(zhì)中（52%）。此外由結(jié)果還可以看出，與抗病防衛(wèi)相關(guān)的蛋白包括PR10、包含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的蛋白、過(guò)氧化氫酶、氧化還原酶等來(lái)源的多肽還伴有甲?；?、脫酰胺基化、乙基化等10種以上的氨基酸修飾方式。該技術(shù)為后續(xù)棉花多肽組學(xué)研究、棉花多肽數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，以及挖掘如抗病抗逆相關(guān)的多肽應(yīng)用于生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：棉花;多肽;蛋白質(zhì)組學(xué);質(zhì)譜分析

中圖分類號(hào)： S562.01?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）20-0095-04

多肽是一類由10～100個(gè)氨基酸組成的、由前體多肽經(jīng)過(guò)加工剪切后形成的成熟、具有特殊功能的肽類信號(hào)分子[1]。在動(dòng)物、細(xì)菌、真菌中，功能活性肽在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用，它們作為藥物、疫苗、酶抑制劑、導(dǎo)向藥物及藥物先導(dǎo)藥等已在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用，具有非常高的應(yīng)用價(jià)值[2-3]。隨著系統(tǒng)素（systemin）、植物磺肽素（phytosulfokine，簡(jiǎn)稱PSK）、CLE、SCR（SP11）、CLV3等植物多肽分子的陸續(xù)鑒定，證實(shí)了這類物質(zhì)可以作為信號(hào)分子介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞之間的短距離信息交流，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及抗逆等眾多生命過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[1，4]。

植物內(nèi)源活性多肽不僅可以通過(guò)基因工程導(dǎo)入植物中進(jìn)行過(guò)表達(dá)，以改善植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆抗病性，還可以用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、殺菌劑，用來(lái)直接外源噴施植株，以提高植物的生長(zhǎng)和抗逆能力。例如Zhang等分別將alfAFP基因及花煙草中的防御素NaD1基因轉(zhuǎn)入陸地棉后，植株對(duì)黃萎病病菌的抗性顯著增強(qiáng)[5-6]。將人工合成的抗菌肽轉(zhuǎn)入棉花中，也同樣增強(qiáng)了植株對(duì)黃萎病病菌的抗性[7-8]。此外，Huffaker等用ZmPep1多肽體外處理玉米葉片，可以減小由死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌玉米小斑病病菌（Cochliobolis heterostrophus）和半活體營(yíng)養(yǎng)型病原菌玉米莖腐病病菌（Colletotrichum graminicola）引起的死亡細(xì)胞數(shù)量和壞死斑的大小[9]。由此可見(jiàn)，植物多肽在植物應(yīng)對(duì)病原菌的侵害過(guò)程中可以起到非常重要的作用，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，多肽組學(xué)在近10年來(lái)也獲得了較多關(guān)注。然而，由于植物材料的特殊性，相較于動(dòng)物，植物多肽組學(xué)的發(fā)展仍較為緩慢。在本研究中，筆者參考動(dòng)物多肽組的純化過(guò)程[10-11]和植物蛋白質(zhì)組的提取方法[12-13]，對(duì)棉花根部的多肽提取方法進(jìn)行探索和建立，利用高分辨級(jí)色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)所提取的多肽進(jìn)行NanoLC-MS/MS（納升級(jí)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜）分析，利用已發(fā)表的棉花蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比對(duì)，并手動(dòng)驗(yàn)證質(zhì)譜的分析結(jié)果。本研究將為系統(tǒng)研究棉花多肽組的生物學(xué)信息和挖掘具有重要應(yīng)用價(jià)值的新多肽提供新的方法和思路。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

供試棉花材料為亞洲棉中棉紅莖，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所張保龍研究員提供。

1.2?試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2018年3月至2019年4月進(jìn)行，試驗(yàn)在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院完成。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?棉花根部多肽的分離提取?將亞洲棉中棉紅莖的種子用清水沖洗后，播種于盆缽中，待幼苗長(zhǎng)至2葉1心時(shí)，采集植物的根部組織進(jìn)行多肽提取。用液氮研磨葉片至粉末狀后，加入3倍體積的多肽提取液[含有7 mol/L尿素，2 mol/L硫代尿素，20 mmol/L DTT（二硫蘇糖醇），5 μL Cocktail蛋白酶抑制劑]，振蕩提取15 min后，離心（4 ℃，12 000×g，10 min），取上清。上清液通過(guò)Microcon YM-10超濾管（Millipore，USA）除去分子量大于10 ku的大分子蛋白。在過(guò)濾后的上清中加入3倍體積的預(yù)冷丙酮，于-20 ℃放置4 h。離心取沉淀（4 ℃，12 000×g，10 min），沉淀再用1倍體積的預(yù)冷丙酮洗1次，離心（4 ℃，12 000×g，5 min），棄上清，將沉淀倒置晾干。將沉淀加入70%乙腈[含0.1%TFA（三氟乙酸）]中，振蕩提取15 min，離心取上清（4 ℃，12 000×g，5 min）。用Millipore Ziptips（Merck KGaA，Darmstadt，Germany）對(duì)上清液進(jìn)行脫鹽處理，最終收集后抽真空干燥。將處理后的樣品用0.1%甲酸復(fù)溶，離心（4 ℃，12 000×g，2 min），取上清液進(jìn)行Nano LC-MS/MS分析。

1.3.2?Nano LC-MS/MS分析分離鑒定?將多肽樣品于Nano-RSLC液相系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，CA，USA）中進(jìn)行60 min的梯度洗脫，流速為300 nL/min，進(jìn)樣量為 10 μL。采用納升電噴霧離子源，電離模式：電噴霧ESI（+），噴霧電壓為2.2 kV，毛細(xì)管溫度為200 ℃。一級(jí)質(zhì)譜在Orbitrap中掃描，掃描范圍是350～1 800 m/z，分辨率為 60 000。所得信息用PEAKS軟件進(jìn)行De Novo（從頭）測(cè)序，并用測(cè)得的序列搜尋棉花蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，以得到最合適的鑒定結(jié)果。

2?結(jié)果與分析

2.1?棉花根部多肽的提取效果

植物內(nèi)源多肽的豐度通常都非常低，并且植物細(xì)胞外的細(xì)胞壁中及細(xì)胞內(nèi)含有大量色素，加上存在的次級(jí)代謝物等為多肽的獲得和分離帶來(lái)了極大困難。本研究由于后續(xù)應(yīng)用高分辨率的色質(zhì)聯(lián)用儀，因此在提取方法上排除了與色譜不相容的十二烷基硫酸鈉（SDS）法，筆者采用對(duì)分子量極小的蛋白分辨效果好的改良尿素法進(jìn)行棉花多肽的提取。為了避免蛋白質(zhì)和多肽的降解，本試驗(yàn)在樣品采集和提取過(guò)程中始終保持在低溫（4 ℃）下進(jìn)行，并且在提取液中加入蛋白酶抑制劑。質(zhì)譜分析后用PEAKS studio軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，將從頭測(cè)序、數(shù)據(jù)庫(kù)搜索2種方法結(jié)合進(jìn)行多肽的鑒定。筆者從棉花根部組織共獲得809個(gè)小分子肽序列，詳見(jiàn)表1。這一結(jié)果表明，采用的改良尿素法對(duì)棉花多肽的分離效果較好。這些多肽的長(zhǎng)度均較小，最大不超過(guò)70個(gè)氨基酸，以長(zhǎng)度為10～20個(gè)氨基酸的多肽最多，其次為20～30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽。

2.2?棉花根部多肽的功能分類

由圖1可見(jiàn)，通過(guò)比對(duì)棉花蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)737個(gè)多肽可以匹配到已知蛋白上。通過(guò)對(duì)這些已知蛋白進(jìn)行GO注釋，筆者發(fā)現(xiàn)這些多肽來(lái)源的基因在結(jié)合和催化活性、細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程功能亞類中所占的比例最高（圖1）。從未來(lái)生產(chǎn)應(yīng)用角度，本研究還發(fā)現(xiàn)了與抗病防衛(wèi)相關(guān)的蛋白包括病程相關(guān)蛋白10（PR10）、包含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的蛋白、過(guò)氧化氫酶、氧化還原酶等來(lái)源的多肽。例如，本研究發(fā)現(xiàn)病程相關(guān)蛋白10來(lái)源多肽的多個(gè)多肽，這些多肽除了序列較短，還伴有甲?；?、脫酰胺基化、乙基化等10種以上的氨基酸修飾方式，詳見(jiàn)圖2。

2.3?棉花根部多肽的定位

筆者將多肽的來(lái)源基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。圖3的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，根部多肽來(lái)源的基因大多分布在細(xì)胞質(zhì)中（52%），其次分別分布在細(xì)胞核（23%）、質(zhì)體（20%）中，此外，還有少量多肽分布于細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上、過(guò)氧化物酶上等。

3?討論與結(jié)論

在動(dòng)物細(xì)胞及動(dòng)物組織中，多肽和多肽組的提取方法較為成熟，然而在植物中，由于植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特殊性，目前植物多肽組的提取仍然是多肽組學(xué)研究中的關(guān)鍵步驟。在蛋白質(zhì)組的提取過(guò)程中，常使用的去垢劑如SDS、Trixton等可以快速高效地提取樣本的蛋白質(zhì)，然而由于這些去垢劑與色譜不相容，因此本研究采用了對(duì)分子量極小的蛋白分辨效果好的改良尿素法對(duì)棉花多肽進(jìn)行提取。孫婷婷等利用尿素法，基于Nano LC-MS/MS在水稻葉片和根部共鑒別出約110個(gè)多肽，通過(guò)功能分析發(fā)現(xiàn)，這些多肽參與了水稻重要的生理活動(dòng)[13]。在本研究中，筆者在提取液中加入了蛋白酶抑制劑，首先減少了內(nèi)源降解的干擾，其次使得提取過(guò)程保持在低溫環(huán)境下進(jìn)行，另外，提取過(guò)程中的無(wú)機(jī)鹽提取劑在最后的除鹽步驟中被去除，極大地提高了植物多肽組的提取純度和效率。通過(guò)高分辨率的質(zhì)譜檢測(cè)和數(shù)據(jù)整理，筆者發(fā)現(xiàn)這種方法的提取效果較好，在棉花根部組織中鑒定出809個(gè)多肽。

通過(guò)對(duì)這些多肽的前體蛋白功能進(jìn)行功能注釋后發(fā)現(xiàn)，它們參與到細(xì)胞組成、 分子調(diào)控和生物代謝各個(gè)方面。例如筆者發(fā)現(xiàn)，病程相關(guān)蛋白來(lái)源的多肽可以調(diào)控植物的脅迫反應(yīng)。病程相關(guān)蛋白是植物在受到生物、非生物脅迫后產(chǎn)生的一種小分子蛋白，具有廣泛的功能，可以硬化細(xì)胞壁、傳導(dǎo)信號(hào)以及抗菌等[14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，病程相關(guān)蛋白10在參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝及應(yīng)對(duì)外界生物和非生物脅迫時(shí)發(fā)揮著重要的作用[15]。在對(duì)棉花的研究中發(fā)現(xiàn)，黃萎病病菌侵染可以誘導(dǎo)PR10蛋白的表達(dá)[16-17]。轉(zhuǎn)化煙草、擬南芥的試驗(yàn)結(jié)果表明，PR10可以提高植株對(duì)黃萎病病菌的抗性，并且能提高植物抗菌素黃酮類化合物的水平。此外，PR10的表達(dá)也能改變煙草、擬南芥的表型，如轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)延緩、轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片傾向于橫向生長(zhǎng)而呈近圓形、頂端優(yōu)勢(shì)減弱、側(cè)生莖數(shù)量顯著增多等現(xiàn)象，證實(shí)PR10也參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[18]。盡管PR10的部分重要功能已被鑒定，然而其調(diào)控機(jī)制到目前為止還不清晰。在本研究中，筆者通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，PR10可以產(chǎn)生多個(gè)不同修飾的多肽分子，因此推測(cè)PR10可能通過(guò)不同的多肽去調(diào)控不同的生長(zhǎng)并應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫反應(yīng)。在后續(xù)研究中，筆者將聚焦這些重要多肽進(jìn)行功能驗(yàn)證。

植物天然多肽組的提取是植物多肽組學(xué)發(fā)展的一切基礎(chǔ)。通過(guò)探索高效的多肽分離方法，可以挖掘植物體中的天然活性多肽，后續(xù)將其作為生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或者抗菌藥劑人工合成應(yīng)用于生產(chǎn)，對(duì)于棉花增產(chǎn)抗病具有重要的理論與實(shí)踐意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Tavormina P，de Coninck B，Nikonorova N，et al. The plant peptidome：an expanding repertoire of structural features and biological functions[J]. Plant Cell，2015，27（8）：2095-2118.

[2]Brivanlou A H，Darnell J E Jr. Signal transduction and the control of gene expression[J]. Science，2002，295（5556）：813-818.

[3]Dave L A，Montoya C A，Rutherfurd S M，et al. Gastrointestinal endogenous proteins as a source of bioactive peptides-an in silico study[J]. PLoS One，2014，9（6）：e98922.

[4]Czyzewicz N，Yue K，Beeckman T，et al. Message in a bottle：small signalling peptide outputs during growth and development[J]. Journal of Experimental Botany，2013，64（17）：5281-5296.

[5]Zhang H P，Wang X D，Shao M Y，et al. Expression of alfalfa antifungal peptide gene and enhance of resistance to Verticillium dahliae in upland cotton[J]. Acta Agriculturae Scandinavica，2010，60（1）：95-100.

[6]Gaspar Y M，McKenna J A，McGinness B S，et al. Field resistance to Fusarium oxysporum and Verticillium dahliae in transgenic cotton expressing the plant defensin NaD1[J]. Journal of Experimental Botany，2014，65（6）：1541-1550.

[7]Rajasekaran K，Cary J W，Jaynes J M，et al. Disease resistance conferred by the expression of a gene encoding a synthetic peptide in transgenic cotton（Gossypium hirsutum L.）plants[J]. Plant Biotechnology Journal，2005，3（6）：545-554.

[8]趙亦靜，倪?密，諾?林，等. 人工合成抗菌肽對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌效果[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2013，39（1）：11-17.

[9]Huffaker A，Pearce G，Veyrat N，et al. Plant elicitor peptides are conserved signals regulating direct and indirect antiherbivore defense[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2013，110（14）：5707-5712.

[10]Zhang X，Che F Y，Berezniuk I，et al. Peptidomics of Cpe（fat/fat）mouse brain regions：implications for neuropeptide processing[J]. Journal of Neurochemistry，2008，107（6）：1596-1613.

[11]Ma J，Ward C C，Jungreis I，et al. Discovery of human sORF-encoded polypeptides（SEPs） in cell lines and tissue[J]. Journal of Proteome Resources，2014，13（3）：1757-1765.

[12]Ge P，Ma C，Wang S，et al. Comparative proteomic analysis of grain development in two spring wheat varieties under drought stress[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2012，402（3）：1297-1313.

[13]孫婷婷，張樂(lè)樂(lè)，王?倩，等. 基于Nano LC-MS/MS的水稻多肽組學(xué)研究[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2015，51（7）：1173-1178.

[14]Van Loon L C，Rep M，Pieterse C M. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants[J]. Annual Review of Phytopathology，2006，44：135-162.

[15]盧一鵬，李?偉，孫?楠，等. 植物病程相關(guān)蛋白PR10結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，55（2）：273-279，284.

[16]梁?杉. 棉花抗黃萎病相關(guān)基因類Pr10的分離及功能分析[D]. 保定：河北大學(xué)，2009：19-34.

[17]張桂榮. 棉花PR蛋白家族分析及PR10、PR17的功能研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：11-46.

[18]陳捷胤. 棉花重要抗黃萎病相關(guān)基因的表達(dá)特性分析及GhPR10功能初步研究[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2007：1-18.