5-十七烷基間苯二酚對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用

解明思，劉 潔，朱科學(xué),孫寶國，王 靜,*

(1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.北京工商大學(xué) 中國- 加拿大食品營養(yǎng)與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；3.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；4.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

乳腺癌是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，對女性身心健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。三陰性乳腺癌是一類雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)與人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-type 2,Her-2)均為陰性的惡性乳腺癌，具有復(fù)發(fā)率高、侵襲性高且預(yù)后差等特點(diǎn)，常規(guī)治療效果較差，且對化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，因此，針對三陰性乳腺癌的治療策略研究日益成為乳腺癌研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一[1]。

近年來，天然植物中有效組分的抗癌活性愈發(fā)受到學(xué)界認(rèn)可，而全谷物因具有多種保健作用而引起了營養(yǎng)研究者的興趣。全谷物在預(yù)防乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要作用,流行病學(xué)證據(jù)顯示,大量攝入含有麩皮的全谷物食品與罹患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)存在負(fù)相關(guān)性[2-3]。5-烷基間苯二酚(5-alkylresorcinols,ARs)是存在于小麥、黑麥等麥類作物中的一類特殊的兩親性酚類化合物[4]。研究表明，ARs具有抗氧化、調(diào)節(jié)血脂、抑菌等多種生理活性，并能作為小麥、黑麥等全谷物食品攝入的生物標(biāo)記物[5-9]。本課題組前期分離并比較了不同麥麩單體ARs體外抗炎活性，結(jié)果表明，5-十七烷基間苯二酚(5-heptadecylresorcinol，AR-C17)具有較強(qiáng)的抗炎活性[10]。已有研究表明，麥麩中的ARs對不同的腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性[11-12]。目前，ARs對乳腺癌的增殖抑制活性的影響尚未見報(bào)道，其具體作用機(jī)理亦不明確。

本研究采用不同濃度的AR-C17體外作用于人三陰性乳腺癌 MDA-MB-231 細(xì)胞，通過觀察AR-C17對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，并結(jié)合其對細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬的調(diào)控，探討AR-C17抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，希望為全谷物在乳腺癌防治中的應(yīng)用提供參考，并為谷物副產(chǎn)物的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，購自美國ATCC細(xì)胞庫；5-十七烷基間苯二酚AR-C17(純度大于98%)，上海敏旭化工科技有限公司；雷帕霉素(rapamycin,Rapa)，中國MCE公司；氯喹(chloroquine,CQ)、2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,DCF-DA)、二氯甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、RIPA總蛋白提取裂解液、蛋白酶抑制劑及Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，美國Sigma-Aldrich公司；PhosSTOP磷酸酶抑制劑，瑞士Roche公司；5×蛋白上樣緩沖液、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜及ECL超敏顯色液，美國Bio-rad公司。Bax、Bcl-2、LC3-Ⅱ及β-actin一抗，羊抗兔IgG(HRP)二抗及自噬檢測試劑盒，英國Abcam公司；Ki-67一抗、固定透化工作液及流式染色緩沖液，美國Affymetrix eBiosciences公司；高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution，HBSS)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、0.25%質(zhì)量分?jǐn)?shù)胰酶(含EDTA)、0.25%胰酶(無EDTA)及CaspGLOWTM熒光活性試劑盒，美國Gibco-Invitrogen公司；CCK-8細(xì)胞存活率試劑盒，日本東仁公司；線粒體膜電位檢測試劑盒及Z- VAD- FMK，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HF90型CO2培養(yǎng)箱,上海力康儀器有限公司；IX73型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司；Synergy H1型紫外酶標(biāo)儀，美國Biotek公司；Cytoflex型流式細(xì)胞儀,美國Beckman公司；ChemiDocTM型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231培養(yǎng)于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d按照1∶3比例傳代,取對數(shù)生長期的細(xì)胞備用。

1.3.2細(xì)胞存活率檢測

MDA-MB-231細(xì)胞消化收集后，以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于96孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后，每組加入不同藥物處理，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。48 h后，每孔加入10 μL 5 mg/mL的CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光值。

1.3.3胞內(nèi)腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67水平測定

MDA-MB-231細(xì)胞以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后，用25 μmol/L AR-C17處理細(xì)胞。作用24 h后消化收集細(xì)胞，PBS清洗后加入固定透化工作液，4 ℃避光孵育30 min；采用PBS清洗重懸細(xì)胞，加入Ki-67一抗，室溫避光孵育30 min；PBS清洗后用流式染色緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.4胞內(nèi)ROS水平測定

采用DCF-DA檢測胞內(nèi)活性氧水平。MDA-MB-231細(xì)胞以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于96孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h后，采用不同濃度AR-C17處理細(xì)胞。24 h后，細(xì)胞經(jīng)HBSS清洗后加入10 μmol/L DCF-DA熒光探針，37 ℃無CO2培養(yǎng)60 min。HBSS清洗后加入無血清培養(yǎng)基，酶標(biāo)儀以激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm條件檢測熒光強(qiáng)度。

1.3.5細(xì)胞凋亡檢測

MDA-MB-231細(xì)胞以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，采用不同藥物處理細(xì)胞24 h。用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，冰PBS清洗后加入500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞,并先后加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI 混勻,室溫避光反應(yīng)30 min。PBS清洗后加入500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.6活性Caspase 檢測

MDA-MB-231細(xì)胞以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于6孔板內(nèi)。24 h后，用不同藥物處理細(xì)胞，并消化收集細(xì)胞，PBS清洗2次后用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，每管樣品加入1 μL FITC-VAD-FMK探針，37 ℃孵育60 min，PBS清洗并重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.7線粒體膜電位檢測

采用JC-1法測定線粒體膜電位(ΔΨm)的變化。MDA-MB-231細(xì)胞以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于6孔板內(nèi)，24 h后，用不同藥物處理細(xì)胞。12 h后消化收集細(xì)胞，PBS清洗2次后用含有JC-1探針的染色緩沖液重懸細(xì)胞，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下孵育30 min，緩沖液清洗2次，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.8自噬體檢測

參考試劑盒說明書步驟[13]，測定細(xì)胞內(nèi)自噬體生成量的變化。MDA-MB-231細(xì)胞以6×104個(gè)細(xì)胞/mL的密度接種于6孔板內(nèi)。24 h后，用不同藥物處理細(xì)胞，其中雷帕霉素為自噬誘導(dǎo)劑陽性對照。16 h后消化收集細(xì)胞，PBS清洗后用250 μL體積分?jǐn)?shù)5%胎牛血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并加入250 μL自噬熒光染料37 ℃避光孵育30 min。PBS清洗并重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3.9Western-Blot檢測蛋白表達(dá)

MDA-MB-231細(xì)胞以6×104細(xì)胞/mL的密度接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h，隨后用不同藥物處理細(xì)胞。處理結(jié)束后冰上刮取細(xì)胞并用含有體積分?jǐn)?shù)10%磷酸酶抑制劑和體積分?jǐn)?shù)1%蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液提取總蛋白；冰上每10 min震蕩一次，30 min后12 000 r/min離心15 min，取上清液，二喹啉甲酸法測定蛋白含量。蛋白樣品和上樣緩沖液充分混合后,95 ℃、5 min充分變性蛋白質(zhì)備用。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含吐溫-20的三乙醇胺緩沖液(fris buffered saline with Tween-20，TBST)洗膜3次(5 min/次)后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的脫脂牛奶封閉1 h，隨后用TBST洗膜3次(5 min/次)，加入一抗4 ℃搖床過夜；TBST洗膜3次(5 min/次)，加入二抗(1∶10 000),室溫孵育1 h,再以TBST洗膜后加入適量ECL顯色液，在凝膠成像儀下曝光，檢測不同蛋白的表達(dá),采用Image Lab軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

AR-C17結(jié)構(gòu)如圖1。為了解AR-C17對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用，本研究以不同劑量的AR-C17(0、10、25、40 μmol/L)處理細(xì)胞48 h,采用CCK-8法研究AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖2。圖2顯示，隨AR-C17濃度的升高，MDA-MB-231細(xì)胞存活率逐漸減低，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。與空白組相比，AR-C17濃度為10、25、40 μmol/L時(shí)，MDA-MB-231的存活率分別降低約16.46%、50.78%和92.14%(P<0.05)。AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞的半數(shù)致死量IC50為25.78 μmol/L，后續(xù)單一濃度實(shí)驗(yàn)選取25 μmol/L作為AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞作用機(jī)制的研究濃度。

圖1 5-十七烷基間苯二酚結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of 5-heptadecylresorcinol

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 AR-C17濃度與MDA-MB-231細(xì)胞存活率的關(guān)系Fig.2 Effect of AR-C17 on viability of MDA-MB-231 cells

2.2 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)腫瘤增殖標(biāo)志物Ki-67水平的影響

選取接近IC50的25 μmol/L AR-C17處理細(xì)胞24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。圖3表明，與空白組相比，25 μmol/L的AR-C17能夠顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)Ki-67蛋白的表達(dá)水平，抑制率達(dá)41.27%(P<0.05)，說明AR-C17能夠有效降低MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)Ki-67的表達(dá)水平。Ki-67與腫瘤細(xì)胞增殖緊密相關(guān)，是腫瘤診斷及預(yù)后中廣泛應(yīng)用的一個(gè)指征腫瘤增殖活力的指標(biāo)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)中，AR-C17組與空白組比較，Ki-67的胞內(nèi)含量顯著降低(P<0.05)，結(jié)合細(xì)胞存活率說明，AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞具備抑制增殖的能力。

*：P<0.05，與空白組相比，差異顯著；胞內(nèi)Ki-67相對表達(dá)量表示為相對于空白組的倍數(shù)。圖3 AR-C17濃度與MDA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)Ki-67表達(dá)水平的關(guān)系Fig.3 Effect of AR-C17 on relative expression of intracellular Ki-67 of MDA-MB-231 cells

2.3 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞ROS生成的影響

為研究AR-C17濃度對細(xì)胞ROS的影響，以不同劑量AR-C17(0、10、25、40 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，并利用DCF-DA 熒光探針探究MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4。圖4表明，與空白組相比，不同濃度的AR-C17均能夠顯著促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞生成胞內(nèi)ROS，并呈劑量依賴關(guān)系；當(dāng)AR-C17濃度為10、25、40 μmol/L時(shí)，胞內(nèi)ROS含量顯著升高，相對ROS 含量分別為空白組的4.04、4.19和7.70倍(P<0.05)，說明AR-C17能夠顯著提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相對ROS含量表示為相對于空白組的倍數(shù)。圖4 AR-C17與MDA-MB-231細(xì)胞ROS生成量的關(guān)系Fig.4 Effect of AR-C17 on ROS generation in MDA-MB-231 cells

2.4 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位下降反映線粒體功能障礙，是指征細(xì)胞早期凋亡活動(dòng)的重要指標(biāo)。利用JC-1熒光探針研究MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位的變化，將25 μmol/L AR-C17處理細(xì)胞12 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。在正常生理狀態(tài)下，JC-1探針在線粒體基質(zhì)內(nèi)以聚集體形式存在，發(fā)紅色熒光(PI通道)；當(dāng)線粒體膜破裂，膜電位下降，JC-1會(huì)解聚成單體進(jìn)入胞質(zhì)當(dāng)中，發(fā)綠色熒光(FITC通道)。由圖5可知，與空白組相比，25 μmol/L AR-C17能夠使紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)，JC-1單體細(xì)胞比例上升15.9%(P<0.05)，說明AR-C17能夠降低MDA-MB-231細(xì)胞的線粒體膜電位。

*：P<0.05，與空白組相比，差異顯著。圖5 25 μmol/L AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞膜電位的影響Fig.5 Effect of AR-C17 on relative ratio of JC-1aggregate/JC-1 monomer of MDA-MB-231 cells

2.5 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步探究AR-C17對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用Annexin-V-FITC/PI雙染法進(jìn)行研究。以不同劑量的AR-C17(0、10、25、40 μmol/L)處理細(xì)胞24 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。由圖6可知，隨著AR-C17濃度的升高，早凋和晚凋的細(xì)胞比例逐漸增多。與空白組相比，當(dāng)AR-C17濃度為10、25、40 μmol/L時(shí)，凋亡率分別提高7.87%，19.72%和34.13%(P<0.05)。結(jié)果表明，AR-C17能夠促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡，且呈劑量依賴性。細(xì)胞凋亡是一系列基因調(diào)控的高度程序化的主動(dòng)死亡過程[16]，活性氧ROS的過量生成是激活凋亡的重要步驟[17]。過量的ROS可以破壞線粒體膜完整性，造成線粒體通透性改變，線粒體膜電位下降，誘發(fā)凋亡下游活動(dòng)。在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合2.3和2.4中分析結(jié)果，與空白組相比較，AR-C17處理能夠顯著提高ROS含量(P<0.05)，同時(shí)降低線粒體膜電位(P<0.05)，顯著增加凋亡細(xì)胞比例(P<0.05)。結(jié)果提示，AR-C17能夠刺激MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生ROS，通過改變線粒體膜通透性來促進(jìn)下游細(xì)胞凋亡活動(dòng)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Effect of AR-C17 on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.6 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)活性Caspase含量的影響

活性Caspase含量的上升可以指征細(xì)胞凋亡發(fā)生。將25 μmol/L AR-C17處理細(xì)胞24 h，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測AR-C17對細(xì)胞活性Caspase含量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7。圖7表明，與空白組相比，AR-C17處理組的平均熒光強(qiáng)度是空白組的1.42倍(P<0.05)，說明25 μmol/L AR-C17能夠顯著提高M(jìn)DA-MB-231細(xì)胞活性Caspase的含量。Caspase蛋白是凋亡活動(dòng)重要參與者。在促凋亡信號(hào)的刺激下，線粒體啟動(dòng)凋亡，胞漿中的細(xì)胞色素C與凋亡相關(guān)因子結(jié)合形成凋亡小體，進(jìn)一步引發(fā)Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，執(zhí)行細(xì)胞凋亡[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，與空白組相比，AR-C17組活性Caspase含量顯著上升(P<0.05)，說明AR-C17能夠刺激活性Caspase的產(chǎn)生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行。

*：P<0.05，與空白組相比，差異顯著；相對熒光強(qiáng)度結(jié)果表示為相對于空白組的倍數(shù)。圖7 25 μmol/L AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞活性Caspase含量的影響Fig.7 Effect of 25 μmol/L AR-C17 on actived Caspase in MDA-MB-231 cells

2.7 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞自噬小體生成的影響

為了解AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞自噬體的影響，將不同劑量AR-C17(0、10、25、40 μmol/L)及陽性對照Rapa處理細(xì)胞16 h，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理對細(xì)胞自噬體生成的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖8。圖8顯示，Rapa 和AR-C17(濃度10、25、40 μmol/L)的相對熒光強(qiáng)度分別為空白組的1.96、3.39、3.61、4.45倍(P<0.05)。結(jié)果表明，AR-C17能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞產(chǎn)生自噬體，其效果較自噬陽性對照更為顯著。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，Rapa為陽性對照，相對熒光強(qiáng)度表示自噬小體含量相對于空白組的倍數(shù)。圖8 AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞自噬體含量的影響Fig.8 Effect of AR-C17 on autophagosome formation in MDA-MB-231 cells

2.8 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡和自噬相關(guān)蛋白的影響

為探究AR-C17對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡、自噬蛋白表達(dá)的影響，將不同劑量AR-C17(0、10、25、40 μmol/L)作用細(xì)胞24 h，并采用Western blot法檢測AR-C17對蛋白表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9。圖9表明，與空白組相比，隨著AR-C17濃度的升高，MDA-MB-231細(xì)胞Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值逐漸增高，當(dāng)AR-C17濃度為10、25、40 μmol/L時(shí)，Bax/Bcl-2表達(dá)比值分別為空白組的1.63、1.99和5.18倍(P<0.05)。此外，與空白組相比，隨著AR-C17濃度的升高，MDA-MB-231細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白 LC3-Ⅱ表達(dá)比值逐漸增高。當(dāng)AR-C17濃度為10、25、40 μmol/L時(shí)，LC3-Ⅱ表達(dá)量分別為空白組的1.38、1.75和2.91倍(P<0.05)。LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ是細(xì)胞自噬中的重要步驟，因此LC3-Ⅱ的上調(diào)可以作為細(xì)胞自噬活動(dòng)的標(biāo)志[19]。結(jié)果表明，AR-C17能夠上調(diào)MDA-MB-231細(xì)胞中Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)比值及LC3-Ⅱ蛋白相對表達(dá)量，且呈劑量依賴性。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖9 AR-C17濃度對MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effect of AR-C17 on protein expressions in MDA-MB-231 cells

Bcl-2蛋白在細(xì)胞凋亡過程中扮演重要角色。Bax是Bcl-2家族中具有代表性的促凋亡蛋白，而Bcl-2則是抗凋亡蛋白。二者的相對表達(dá)量在凋亡活動(dòng)中往往決定了細(xì)胞存活的方向[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，較空白組，AR-C17處理Bax蛋白表達(dá)水平上升，同時(shí)Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降，Bax/Bcl-2比值上升，提示AR-C17通過增強(qiáng)Bax蛋白表達(dá)，減弱Bcl-2蛋白表達(dá)，來促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡過程。

自噬是廣泛存在于真核生物中的一種由溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞自我降解機(jī)制，通過細(xì)胞內(nèi)外部的協(xié)調(diào)和自我消解來對抗不良擾動(dòng)從而保持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[21-22]。自噬在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的存活和死亡方面起著雙重作用[21,23-24]：一方面，自噬降解受損或功能失調(diào)的細(xì)胞成分，使細(xì)胞群體達(dá)到生存目的;另一方面，過度自噬可直接導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[24]。有證據(jù)表明，許多癌細(xì)胞中的自噬可能會(huì)提高化療藥物效果[25]。在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)合2.7中結(jié)果，與空白組比較，AR-C17處理能夠使胞內(nèi)自噬體含量顯著增加(P<0.05)，自噬特征蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)增強(qiáng)，二者結(jié)果提示，AR-C17能夠誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬。

2.9 AR-C17協(xié)同凋亡自噬抑制劑對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

為進(jìn)一步探討AR-C17作用下凋亡和自噬對MDA-MB-231細(xì)胞的作用，實(shí)驗(yàn)分為空白對照、凋亡抑制劑Z-VAD-FMK、自噬抑制劑CQ、AR-C17協(xié)同Z-VAD-FMK、AR-C17協(xié)同CQ及AR-C17組，分別處理細(xì)胞48 h，并用CCK-8法研究不同處理方式對MDA-MB-231細(xì)胞活性的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10。圖10顯示，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK與AR-C17共同作用能夠緩解對MDA-MB-231細(xì)胞存活的抑制作用，與25 μmol/L AR-C17組相比，細(xì)胞存活率提高約9.95%(P<0.05)；而自噬抑制劑CQ與AR-C17共同作用則進(jìn)一步加劇對MDA-MB-231細(xì)胞存活的抑制作用，與25 μmol/L AR-C17組相比，細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低22.4% (P<0.05)，同時(shí)CQ單獨(dú)作用于細(xì)胞時(shí)，對細(xì)胞存活率沒有顯著影響(P>0.05)。結(jié)果說明，凋亡抑制劑Z-VAD-FMK協(xié)同AR-C17能夠緩解對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用，自噬抑制劑CQ協(xié)同AR-C17會(huì)進(jìn)一步加劇對MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖10 AR-C17協(xié)同不同抑制劑對MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響Fig.10 Effect of AR-C17 and/or chloroquine or Z-VAD-FMK on cell viability of MDA-MB-231 cells

2.10 AR-C17協(xié)同CQ對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步探討抑制自噬對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)分為空白對照、CQ、AR-C17協(xié)同CQ及AR-C17，分別作用細(xì)胞24 h，并采用Annexin-V-FITC/PI雙染法研究不同處理對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11。圖11顯示，與空白組相比，AR-C17組與CQ+AR-C17組細(xì)胞凋亡率分別提高16.90%和60.62%(P<0.05)，CQ+AR-C17組的細(xì)胞凋亡率又顯著高于AR-C17組(P<0.05)。結(jié)果表明，與AR-C17單獨(dú)作用相比，CQ協(xié)同AR-C17能夠顯著增加MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖11 AR-C17協(xié)同自噬抑制劑對MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.11 Effect of AR-C17 and/or chloroquine on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.11 AR-C17協(xié)同CQ對MDA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)活性Caspase含量的影響

為進(jìn)一步探討抑制自噬對MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)活性Caspase的影響，實(shí)驗(yàn)分為空白對照、CQ、AR-C17協(xié)同CQ及AR-C17分別作用細(xì)胞24 h，并采用流式細(xì)胞術(shù)研究不同處理對MDA-MB-231細(xì)胞活性Caspase的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖12。圖12顯示，AR-C17組和CQ+AR-C17組的平均熒光強(qiáng)度分別為空白組的13.36倍和16.12倍，能夠顯著增加細(xì)胞活性Caspase含量(P<0.05)，其中CQ+AR-C17的細(xì)胞凋亡比例又顯著高于AR-C17組別(P<0.05)。結(jié)果表明，與AR-C17單獨(dú)作用相比，CQ協(xié)同AR-C17能夠顯著增加MDA-MB-231細(xì)胞的活性Caspase含量。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相對熒光強(qiáng)度表示為相對于空白組的倍數(shù)。圖12 AR-C17協(xié)同自噬抑制劑對MDA-MB-231細(xì)胞胞內(nèi)活性Caspase含量的影響Fig.12 Effect of AR-C17 and/or chloroquine on actived Caspase in MDA-MB-231 cells

細(xì)胞的凋亡和自噬是相互關(guān)聯(lián)的，兩者之間調(diào)節(jié)都會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)[26]。當(dāng)予以外界干預(yù)，兩個(gè)過程可以同時(shí)被激發(fā)，既有可能發(fā)揮協(xié)同調(diào)節(jié)的作用，也有可能相反，表現(xiàn)出拮抗的效果[27-29]。在某些情況下，自噬能夠作為細(xì)胞抵抗化療的生存策略[30]；而在其他情況下，自噬則會(huì)顯示出抗腫瘤潛力[31]。有研究表明，抑制自噬可以增加細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)抗腫瘤活性[32-33]。結(jié)合2.9和2.10中的結(jié)果，與單獨(dú)使用AR-C17組相比，自噬抑制劑CQ與AR-C17共同作用可以加劇細(xì)胞死亡，降低細(xì)胞存活率(P<0.05)，顯著上調(diào)凋亡細(xì)胞比例(P<0.05)和活性Caspase的含量(P<0.05)。結(jié)果提示，抑制自噬能夠進(jìn)一步促進(jìn)AR-C17誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，AR-C17與自噬抑制劑聯(lián)用或可成為一種有效地提高化療藥物敏感性的方法，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

3 結(jié) 論

本研究從細(xì)胞增殖、凋亡、自噬及凋亡與自噬的相互關(guān)系幾方面探討了AR-C17對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響。研究表明，AR-C17可降低MDA-MB-231細(xì)胞的存活率，半數(shù)致死量濃度可顯著抑制胞內(nèi)Ki-67的表達(dá)量，說明AR-C17可有效抑制MDA-MB-231的增殖活力；AR-C17可刺激ROS過量生成,引起線粒體膜電位下降，提高凋亡細(xì)胞比例，上調(diào)Bax/Bcl-2表達(dá)比例，提高活性Caspase含量，說明AR-C17可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡；AR-C17亦可刺激胞內(nèi)自噬體的生成并顯著上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá)，說明AR-C17可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生自噬。研究發(fā)現(xiàn)，抑制自噬可以進(jìn)一步降低細(xì)胞存活率，加劇細(xì)胞凋亡并進(jìn)一步上調(diào)活性Caspase生成量，說明自噬抑制劑協(xié)同AR-C17可以加劇對MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡作用。本研究旨在為深入研究AR-C17抗腫瘤的分子機(jī)制提供細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為將AR-C17及麥麩作為功能性營養(yǎng)添加劑在乳腺癌防治中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。乳腺癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制十分復(fù)雜,需要繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，對AR-C17的抗腫瘤作用進(jìn)行驗(yàn)證和更深入的研究。