長(zhǎng)期咸水滴灌對(duì)土壤氨氧化微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響

馬麗娟，張慧敏，侯振安，閔 偉

（石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境系，新疆 石河子832000）

氮肥一般是作物生長(zhǎng)的限制性因素，在鹽漬化土壤中合理施用氮肥可有效降低鹽分對(duì)作物生長(zhǎng)的危害。硝化作用是土壤氮循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，在氮素形態(tài)轉(zhuǎn)化和氮循環(huán)過程中起著至關(guān)重要的作用，直接影響環(huán)境質(zhì)量和氮肥的利用效率[1]。氨氧化作用和亞硝酸氧化作用是硝化作用的兩個(gè)關(guān)鍵步驟，其中氨氧化作用是硝化作用的限速步驟，主要是在氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）的參與下完成[2]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)于AOA 和AOB 的研究不斷深入。越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注不同環(huán)境條件對(duì)AOA、AOB 豐度[3]和群落結(jié)構(gòu)組成的影響[4]，以及AOA和AOB對(duì)硝化作用的相對(duì)貢獻(xiàn)等[5]。

氨氧化微生物的生長(zhǎng)受土壤環(huán)境的影響。其中土壤鹽分是影響氨氧化微生物生長(zhǎng)和群落結(jié)構(gòu)的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)AOB和AOA的豐度與鹽度呈負(fù)相關(guān)[6]，鹽分會(huì)抑制AOB 的生長(zhǎng)，對(duì)AOA 豐度影響不顯著[7]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)高鹽分可以促進(jìn)AOA 和AOB 的生長(zhǎng)[8]。Caffrey 等[9]研究也表明河口沉積物中AOA 豐度隨著鹽分的增加而增加，但鹽分對(duì)AOB 沒有影響。Mosier 等[10]研究發(fā)現(xiàn)AOB 豐度隨著土壤鹽度的增加而增加，在低鹽度條件下AOAamoA的基因豐度高于AOB 基因。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在鹽堿地中AOBamoA基因豐度比AOAamoA基因豐度高兩個(gè)數(shù)量級(jí)[11]。以上研究結(jié)果表明鹽分對(duì)氨氧化微生物豐度的影響目前尚無(wú)定論。此外，鹽分在影響AOA 和AOB 豐度的同時(shí)也影響其群落結(jié)構(gòu)的改變。前人研究表明，在不同鹽分環(huán)境中AOA 的群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，AOB 的群落結(jié)構(gòu)多樣性和鹽分梯度無(wú)相關(guān)關(guān)系[12]，而濕地土壤中鹽分可顯著改變AOA 和AOB 的群落結(jié)構(gòu)[13]。有研究表明AOB 的多樣性會(huì)隨著鹽分的增加而提高[14]，但是Dang等[15]研究發(fā)現(xiàn)鹽分會(huì)降低AOB 的多樣性。鹽分是一個(gè)日益受到關(guān)注的環(huán)境因素，然而鹽分對(duì)土壤氨氧化微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)影響的認(rèn)識(shí)仍然存在爭(zhēng)議。

新疆地處我國(guó)的西北部，屬于干旱地區(qū)，淡水資源短缺問題尤為嚴(yán)重。但是該地區(qū)咸水資源比較豐富，在淡水資源短缺不斷加劇的背景下，合理利用咸水資源進(jìn)行灌溉已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中緩解淡水資源不足的較為經(jīng)濟(jì)、有效的手段。咸水灌溉一方面提供了作物生長(zhǎng)所需要的水分，緩解旱情；另一方面也將鹽分帶入土壤，改變土壤的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和微生物生長(zhǎng)。AOA 和AOB 共同參與土壤硝化作用，然而，關(guān)于長(zhǎng)期咸水灌溉對(duì)AOB和AOA群落結(jié)構(gòu)的影響及其對(duì)土壤硝化作用的貢獻(xiàn)所知甚少。因此，了解土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)咸水灌溉引起的土壤鹽分變化的響應(yīng)具有重要意義。本研究在已連續(xù)開展10 年咸水滴灌試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過熒光定量PCR 方法測(cè)定AOA 和AOB 的豐度，采用高通量測(cè)序分析AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)多樣性。我們假設(shè)經(jīng)過長(zhǎng)期咸水滴灌會(huì)改變AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)，降低AOA和AOB豐度并抑制硝化作用。因此，本研究的目的是比較不同灌溉水鹽度對(duì)氨氧化微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響，評(píng)價(jià)AOA 和AOB 對(duì)于硝化作用的貢獻(xiàn)，并探討分析土壤理化性質(zhì)與氨氧化微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)區(qū)位于石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)站（44°18′N，86°02′E）內(nèi)，平均海拔450.8 m。試驗(yàn)區(qū)屬于典型溫帶干旱大陸性氣候，多年平均氣溫為6.5～7.2 ℃，無(wú)霜期為168～171 d，年日照時(shí)數(shù)為2721～2818 h，年蒸發(fā)量1660 mm，年平均降水量為210 mm。試驗(yàn)區(qū)土壤類型為石灰性沖積土。0～30 cm 土層基礎(chǔ)理化性質(zhì)（2009年試驗(yàn)開始前）如下：電導(dǎo)率（EC）為0.13 dS·m-1，pH 值7.9，速效磷25.9 mg·kg-1，速效鉀253 mg·kg-1，全氮1.1 g·kg-1，有機(jī)質(zhì)16.8 g·kg-1。供試作物為棉花（Gossypium hirsutumL. cv Xinluzao No. 52），通常在4月中旬種植，9月中旬收獲。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)區(qū)在2009—2017 年已經(jīng)連續(xù)開展9 年的不同鹽度灌溉水滴灌田間試驗(yàn)。依據(jù)灌溉水鹽度設(shè)置了3 個(gè)處理，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共9 個(gè)小區(qū)，每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)面積25 m2，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。3個(gè)處理的灌溉水鹽度分別為0.35、4.61、8.04 dS·m-1（分別用FW、BW 和SW 表示），試驗(yàn)中FW 取自當(dāng)?shù)厣顚拥叵滤?，BW 和SW 處理灌溉水鹽分是通過在淡水中加入等量的NaCl 和CaCl2（質(zhì)量比1∶1）配制而成。氮肥（尿素N≥46.4%）施用量為N360 kg·hm-2，此氮肥用量為當(dāng)?shù)孛藁ù筇锷a(chǎn)推薦用量。2018 年試驗(yàn)開始前3種灌溉水鹽度處理土壤基本理化性見表1。

棉花種植采用覆膜栽培，一膜兩管4 行，行距配置為（30+60+30）cm，播種密度22.2 萬(wàn)株·hm-2。2018年棉花于4 月20 日播種，為保證出苗，播種后滴淡水45 mm。棉花生長(zhǎng)期間灌水9次，6月中旬開始至8月下旬結(jié)束，灌溉周期為7～10 d，每次灌水45～60 mm，總灌溉量450 mm，磷肥（重過磷酸鈣，P2O5≥44.0%）施用量為P2O5105 kg·hm-2，鉀肥（硫酸鉀，K2O≥51.0%）施用量K2O 60 kg·hm-2，全部作基肥在播種前一次性施入。試驗(yàn)中氮肥全部作追肥，2018 年氮肥分別在6月27 日（第二水）、7 月4 日（第三水）、7 月12 日（第四水）、7 月19 日（第五水）和7 月25 日（第六水）通過滴灌系統(tǒng)分五次隨水施用。其他栽培管理措施參照當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)。

1.3 土壤樣品采集與測(cè)定

2018 年（試驗(yàn)第10 年）在棉花蕾鈴期，最后一次施肥結(jié)束后第3 d（7 月28 日）用直徑2.5 cm 土鉆在每個(gè)小區(qū)的棉花行內(nèi)，按S 型線路隨機(jī)采集3 個(gè)耕層土壤樣品，采集深度為0～20 cm。每個(gè)小區(qū)3個(gè)重復(fù)，土樣混合均勻并去除其中的雜物、細(xì)根。將一部分土樣過2 mm 篩后分成兩部分，一部分用于測(cè)定土壤理化性質(zhì)和土壤潛在硝化勢(shì)，一部分用于氨氧化微生物豐度和多樣性的檢測(cè)。用于提取DNA 的土壤樣品保存于-80 ℃條件下。

1.3.1 土壤理化性質(zhì)和潛在硝化勢(shì)測(cè)定

土壤含水量采用烘干法測(cè)定；土壤鹽度和pH 值采用MP521 Lab pH/ Conductivity Meter 型電導(dǎo)率儀測(cè)定，測(cè)定鹽度水土比為5∶1[16]，測(cè)定pH 值水土比為2.5∶1[17]；土壤NO-3-N 和NH+4-N 使用2 mol·L-1KCl 浸提后使用流動(dòng)分析儀測(cè)定（Smart Chem140，Analytik Jena AG）[18]；土壤有機(jī)碳（SOC）使用K2Cr2O7-H2SO4外加熱法測(cè)定[16]；土壤全氮（TN）使用半微量凱氏定氮法測(cè)定[16]。

表1 2018年試驗(yàn)開始前3種灌溉水鹽度處理土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of the soils under three water salinity treatments prior to the beginning of the experiment in 2018

土壤潛在硝化勢(shì)測(cè)定采用Kurola 等[19]測(cè)定方法，準(zhǔn)確稱取5 g 新鮮土壤樣品于50 mL 離心管中振蕩培養(yǎng)24 h后，使用2 mol·L-1KCl浸提并通過比色法測(cè)定土壤浸提液中的濃度，潛在硝化勢(shì)（PNR）以μg（）·g-1·h-（1干土）表征。

土壤潛在硝化勢(shì)計(jì)算公式如下：

式中：c為從標(biāo)曲上查得的顯色液濃度，mg·mL-1；V為顯色液的體積，mL；ts為分取倍數(shù)，m為烘干樣品質(zhì)量；24為24 h。

1.3.2 DNA提取

稱取新鮮土壤樣品0.3 g，使用Power SoilTMDNA Isolation Kit（Mo Blo Laboratories，Inc，USA）試劑盒，按照操作說(shuō)明書提取DNA 樣品，并將提取的土壤總DNA在-80 ℃下保存。

1.3.3qPCR測(cè)定

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)目標(biāo)基因豐度，qPCR 的 反 應(yīng) 體 系 為20 μL，其 中 包 括10 μL 2×SYBR?GreenqPCR Master Mix（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA），前后引物各1 μL，2 μL DNA 模板（約2 ng·μL-1）和6 μL ddH2O。AOAamoA基因擴(kuò)增 引 物 是Arch-amoAF（5′ - STAATGGTCTGGCTTAGACG-3′）和Arch-amoAR（5′ -GCGGCCATCCATC TGTATGT-3′）[20]。AOBamoA基因擴(kuò)增引物是amoA-1F（5-GGGG TTTCTACTGGTGGT）和amoA-2R（5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′）[21]。PCR 反應(yīng)體系如下：95 ℃5 min，接著40 個(gè)循環(huán)，95 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃30 s。

1.3.4 高通量測(cè)序

采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)組成。PCR擴(kuò)增引物與qPCR相同。PCR擴(kuò)增體系為25 μL，其中包括2 μL DNA 模板，前后引物各1 μL，5 μL 5×PCR buffer，2 μL（2.5 mmol·L-1）dNTP，5 μL 5×Q5High GC Enhancer buffer，0.25 μL（0.02U·μL-1）Q5 High - Fidelity DNA polymerase（NEB）和8.75 μL ddH2O。反應(yīng)體系如下：98 ℃5 min，接著35 個(gè)循環(huán)，98 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，最后72 ℃5 min。PCR 產(chǎn) 物 使 用Agencourt AMPure Beads（Beckman Coulter，Indianapolis，IN）純化，并用PicoGreen dsDNA Assay kits（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）質(zhì)量化，各樣品等量混合后，在上海派森諾生物科技股份有限公司（上海，中國(guó)）使用Illumina MiSeq 平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 軟件（Version SPSS 21.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析和相關(guān)性分析，顯著水平為0.05；各處理間差異比較采用LSD 法（P＜0.05）；高通量測(cè)序結(jié)果使用UCHIME 軟件（Version 4.2），鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)。使用QIIME 軟件（Version 1.8.0）對(duì)序列在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類并獲得OTUs數(shù)，基于OTUs數(shù)得到不同分類水平上的物種豐度，再利用R 語(yǔ)言（Version 3.2.0）繪制成樣品各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)圖。使用Mothur（Version 1.30.1）軟件分析樣品α 多樣性指數(shù)（ACE，Chao1，辛普森指數(shù)，香農(nóng)指數(shù)），分析時(shí)將樣品所含序列數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化并在97%相似度水平下，對(duì)各樣品α 多樣性指數(shù)值統(tǒng)計(jì)?；贕alaxy 平臺(tái)進(jìn)行LEfSe 分析[Line discriminant analysis（LDA）Effect Size]，LDA 值＞4。RDA 分析（Redundancy analysis）使用R 語(yǔ)言Vegan 包進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 咸水滴灌對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

灌溉水鹽度顯著影響土壤理化性質(zhì)（表2）。與FW處理相比，BW 和SW 處理土壤鹽分、含水量和含量顯著增加，而pH 值、SOC、TN含量顯著降低（P＜0.05，下同）。BW 和SW 處理含量較FW 處理降低13.5%和30.8%。相反，BW 和SW 處理含量較FW處理增加10.4%和15.2%。

表2 不同灌溉水鹽度處理土壤理化性質(zhì)Table 2 Soil physicochemical properties as affected by different irrigation water salinity treatments

2.2 咸水滴灌對(duì)土壤潛在硝化勢(shì)的影響

BW 和SW 處理顯著降低土壤潛在硝化勢(shì)（PNR）見圖1，F(xiàn)W 處理PNR 分別較BW 和SW 處理高18.1%和37.3%。

圖1 不同灌溉水鹽度處理土壤潛在硝化勢(shì)Figure 1 Soil potential nitrification rate as affected by different irrigation water salinity treatments

2.3 AOA和AOB豐度及對(duì)土壤潛在硝化勢(shì)的相對(duì)貢獻(xiàn)

BW 和SW 處理顯著降低土壤AOA 和AOB 豐度（表3）。不同處理土壤AOAamoA基因豐度在2.18×106～3.57×106copies·g-1（干土），AOBamoA基因豐度在1.94×105～3.15×105copies·g-1（干土）。與FW 處理相比，BW 和SW 處理AOA 和AOB 豐度分別較FW 處理 降 低28.4%、39.0% 和23.3%、38.4%。BW 處 理AOA/AOB顯著低于FW和SW處理，而SW和FW處理之間無(wú)顯著差異。

AOA 和AOB 對(duì)PNR 的相對(duì)貢獻(xiàn)如圖2 所示。AOA豐度與PNR呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（R2=0.922 8，P＜0.001）。相似地，AOB豐度也與PNR呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（R2=0.948 9，P＜0.001）。說(shuō)明PNR 的變化與AOA和AOB豐度存在高度的相關(guān)性。

2.4 AOA和AOB α多樣性

各處理AOA 和AOB 的amoA基因的測(cè)序數(shù)在79 812～80 076（表4），覆蓋度在0.997 1～0.999 7。在97%的相似度水平下，AOA 和AOB 序列分別可劃分為661～664 和130～140 OTUs。BW 和SW 處理顯著降低AOB 群落OTUs，但對(duì)AOA 無(wú)影響。ACE 和Chao1指數(shù)通常用來(lái)衡量群落中含OTU 數(shù)目的指數(shù)，ACE和Chao1 指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高。辛普森和香農(nóng)指數(shù)用于衡量物種多樣性，受樣品群落中物種豐度和物種均勻度的影響，一般香農(nóng)指數(shù)值越大，辛普森指數(shù)值越小，說(shuō)明樣品的物種多樣性越高。灌溉水鹽度對(duì)豐富度指數(shù)（ACE 和Chao1）無(wú)顯著影響。與FW 處理相比，BW 和SW 處理顯著增加AOA 香農(nóng)指數(shù)，且辛普森指數(shù)顯著降低。SW 處理顯著降低AOB 香農(nóng)指數(shù)，且顯著增加辛普森指數(shù)。BW 處理對(duì)AOB多樣性指數(shù)無(wú)顯著影響。

表3 不同灌溉水鹽度處理AOA和AOB豐度Table 3 Abundance of AOA and AOB as affected by different irrigation water salinity treatments

圖2 AOA（a）和AOB（a）豐度與土壤潛在硝化勢(shì)的相關(guān)性Figure 2 Correlations between AOA（a）and AOB（b）abundance and potential nitrification rate of soil

2.5 土壤理化性質(zhì)與AOA、AOB的豐度、多樣性指數(shù)、潛在硝化勢(shì)之間相關(guān)性分析

土壤理化性質(zhì)與AOA、AOB 的豐度，多樣性指數(shù)，土壤潛在硝化勢(shì)之間相關(guān)關(guān)系見表5。土壤潛在硝化勢(shì)，AOA、AOB 豐度，AOA 群落辛普森指數(shù)與pH、、SOC、TN呈顯著正相關(guān)，但是和EC、SWC、呈顯著負(fù)相關(guān)。AOA的香農(nóng)指數(shù)與EC、SWC、呈顯著正相關(guān)，而與pH、SOC、TN 呈顯著負(fù)相關(guān)。AOB的辛普森指數(shù)與EC、SWC、呈顯著正相關(guān)，而與、SOC、TN 呈顯著負(fù)相關(guān)。AOB 的香農(nóng)指數(shù)與、SOC、TN 呈顯著正相關(guān)，而僅與EC呈顯著負(fù)相關(guān)。

表4 不同灌溉水鹽度處理AOA和AOB α多樣性Table 4 α diversity properties of AOA and AOB as affected by different irrigation water salinity treatments

表5 土壤理化性質(zhì)與潛在硝化勢(shì)，AOA、AOB豐度，多樣性指數(shù)間相關(guān)性分析Table 5 Correlations among soil physicochemical properties，potential nitrification rates，AOA and AOB abundance and diversity under different water salinity treatments

2.6 AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)

高通量測(cè)序結(jié)果顯示，綱水平上，AOA 群落由CandidatusNitrosocaldus、CandidatusNitrososphaera、Betaproteobacteria、Marine archaeal group 1、Unknown組成（圖3a）。除Unknown，CandidatusNitrosocaldus（0.6%～1%）相對(duì)豐度較高。CandidatusNitrosocaldus屬于自養(yǎng)和需氧氨氧化古菌，常出現(xiàn)在中性或微堿性陸地地?zé)岘h(huán)境中。不同灌溉水鹽度對(duì)AOA 群落影響不一致，例如，Betaproteobacteria 和Marine archaeal group 1對(duì)灌溉水鹽度較為敏感，BW 和SW 處理中Betaproteobacteria 相對(duì)豐度顯著低于FW 處理，而Marine archaeal group 1 顯著高于FW 處理；SW 處理CandidatusNitrosocaldus顯著高于FW和BW處理。

AOB 屬水平上群落主要由Nitrosospira、Nitrosomonas、Nitrosovibrio和Unknown 組成（圖3b），Nitrosospira（52.9%～59.4%）相對(duì)豐度較高。Nitrosospira屬于氨氧化細(xì)菌中的一類，參與氨氧化過程對(duì)亞硝酸鹽的親和力較高，可高效利用底物。Nitrosomonas隨著灌溉水鹽度的增加相對(duì)豐度顯著降低，SW 處理中沒有檢測(cè)到Nitrosomonas的存在。BW 處理中Nitrosospira相對(duì)豐度顯著低于FW和SW處理。

2.7 AOA和AOB群落LEf Se分析

使用LEfSe（LDA＞4.0，P＜0.05）進(jìn)行不同處理間群落比較分析，得到不同灌溉水鹽度條件下氨氧化微生物群落顯著差異種群（圖4）。AOA僅有1個(gè)差異物種（圖4a），出現(xiàn)在SW 處理，說(shuō)明AOA種群相對(duì)穩(wěn)定，高鹽度灌溉水刺激CandidatusNitrosocaldus 生長(zhǎng)，AOB 共有5 個(gè)顯著差異物種（圖4b），5 個(gè)差異種群均來(lái)自BW 處理，說(shuō)明中等鹽度灌溉水可刺激Bacteria，Proteobacteria、Nitrosomonadaceae、Betaproteobacteria、Nitrosomonadales的生長(zhǎng)。

2.8 AOA、AOB與土壤理化性質(zhì)間RDA分析

利用RDA 分析AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系，AOA 群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系見圖5a，軸1 的解釋度為54.8%，軸2 的解釋度為26.9%。AOA 群落結(jié)構(gòu)與（解釋度59.1%，P=0.002）、pH 值（解釋度23.2%，P=0.032）、土壤鹽分（解釋度10.4%，P=0.042）存在顯著相關(guān)關(guān)系。對(duì)于AOB，軸1 解釋度為57.5%，軸2 解釋度為31.2%（圖5b）。AOB 群落結(jié)構(gòu)僅與（解釋度33.3%，P=0.04）、pH 值（解釋度47.7%，P=0.012）呈顯著相關(guān)關(guān)系，與其他土壤理化性質(zhì)無(wú)顯著相關(guān)關(guān)系。

圖3 不同灌溉水鹽度處理氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)Figure 3 Community structure of AOA and AOB as affected by different irrigation water salinity treatments

圖4 不同灌溉水鹽度處理AOA（a）和AOB（b）群落LEfSe分析Figure 4 LEfSe analysis of AOA（a）and AOB（b）communities under different irrigation water salinity treatments

3 討論

3.1 咸水滴灌對(duì)土壤理化性質(zhì)的影響

淡水資源短缺是限制農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素，合理利用咸水灌溉已成為緩解干旱區(qū)淡水資源不足的重要手段。然而，長(zhǎng)期咸水灌溉會(huì)導(dǎo)致鹽分在土壤中的積累，影響土壤理化性質(zhì)和養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化，特別是氮素轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵過程[22]。本研究結(jié)果表明微咸水、咸水灌溉使土壤鹽分、含水量、含量顯著增加，而pH 值、有機(jī)質(zhì)、含量顯著降低。土壤含水量增加是因?yàn)辂}水灌溉土壤蒸散率降低[23]。pH值降低可能是因?yàn)橥寥乐新入x子的積累，導(dǎo)致土壤pH 值下降[24]。有機(jī)質(zhì)的降低是因?yàn)辂}漬土壤中植物生物量減少導(dǎo)致有機(jī)物輸入量下降[25]。另外，微咸水、咸水處理，土壤含量增加，而含量呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，可能是土壤鹽度的增加抑制了土壤的硝化作用[26]。

3.2 咸水滴灌對(duì)土壤潛在硝化勢(shì)和AOA、AOB豐度的影響

土壤潛在硝化勢(shì)可直接反映土壤硝化活性。本研究結(jié)果表明長(zhǎng)期微咸水和咸水灌溉顯著抑制土壤潛在硝化勢(shì)。這與He 等[27]研究相似，其研究結(jié)果顯示土壤潛在硝化勢(shì)隨土壤鹽度的增加而顯著降低。然而，也有研究表明適度鹽分可提高土壤潛在硝化速率，而高鹽度抑制土壤潛在硝化速率[28]，這可能是因?yàn)橐恍﹨⑴c硝化作用的微生物具有一定的耐鹽性，在一定鹽度范圍內(nèi)可促進(jìn)硝化作用微生物的生長(zhǎng)，提高硝化速率[29]。

AOA 和AOB 是參與硝化作用的關(guān)鍵微生物，鹽分是影響其生長(zhǎng)的重要因素[30]，本研究發(fā)現(xiàn)隨著灌溉水鹽度的增加，AOA 和AOB 豐度均顯著降低。Jin等[31]研究也發(fā)現(xiàn)，較高的鹽分會(huì)抑制AOB生長(zhǎng)。然而也有研究發(fā)現(xiàn)鹽分對(duì)AOA 豐度無(wú)顯著影響[32]，或者中等鹽度可以刺激AOA 生長(zhǎng)[33]。前人研究表明新疆堿性土壤中AOB 豐度高于AOA，是主導(dǎo)微生物類型[34]。但本研究表明AOA 豐度高于AOB，可能是微咸水和咸水灌溉后土壤鹽分成為影響AOA、AOB 生長(zhǎng)和活性的主導(dǎo)因素。Bernhard 等[35]也得到相似的研究結(jié)果。但也有研究發(fā)現(xiàn)河口區(qū)AOB 豐度高于AOA[36]，甚至鹽分越高AOB 豐度高于AOA 的幅度越大[37]。這些矛盾的結(jié)果可能是AOA 和AOB 屬于兩類微生物群體，不同環(huán)境條件下，AOA 和AOB 對(duì)于鹽分的響應(yīng)是不同的。另外自然環(huán)境復(fù)雜多變，可能是多種因素綜合作用下共同影響AOA和AOB活性[38]。

圖5 AOA（a）和AOB（b）群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)間RDA分析Figure 5 Redundancy analysis（RDA）of correlations between soil physicochemical properties and the community structure of AOA（a）and AOB（b）

3.3 咸水滴灌對(duì)土壤AOA 和AOB 群落組成及多樣性的影響

咸水、微咸水灌溉改變了AOA 和AOB 的群落結(jié)構(gòu)。本研究表明AOA 群落多樣性高于AOB，在含有鹽分的河口區(qū)和海岸區(qū)環(huán)境中也出現(xiàn)相似的結(jié)果[27，39]。不同灌溉水鹽度對(duì)AOA 和AOB 群落多樣性的影響是不一致的。對(duì)于AOA 來(lái)說(shuō)，隨著灌溉水鹽度的增加，群落辛普森指數(shù)顯著降低，而香農(nóng)指數(shù)顯著增加。而對(duì)于AOB 來(lái)說(shuō)，咸水灌溉顯著增加AOB群落辛普森指數(shù)，而降低香農(nóng)指數(shù)。說(shuō)明，在該環(huán)境條件下AOA 群落結(jié)構(gòu)對(duì)于鹽分的變化更為敏感。Gao 等[40]研究也表明鹽分越高AOA 多樣性越高，而AOB 群落多樣性在中等鹽度時(shí)最高，在高鹽度時(shí)最低。也有研究發(fā)現(xiàn)在紅樹林沉積物中鹽分與AOB 群落香農(nóng)指數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系，與辛普森指數(shù)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而AOA 群落多樣性對(duì)鹽分變化不敏感[41]。說(shuō)明不同土壤環(huán)境下鹽分對(duì)AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)影響存在差異。

雖然灌溉水鹽度對(duì)AOA 群落OTUs 無(wú)顯著影響，但是AOA 群落對(duì)于不同灌溉水鹽度的響應(yīng)是不同的。通常AOA 的耐受性較強(qiáng)，對(duì)環(huán)境的改變不敏感[42]。本研究結(jié)果表明在綱水平上，除Unknown 外，CandidatusNitrosocaldus 是主要微生物種群，咸水灌溉顯著增加CandidatusNitrosocaldus 相對(duì)豐度，說(shuō)明其對(duì)鹽分具有較強(qiáng)的耐受性。另外也有可能是CandidatusNitrosocaldus 一些物種可將尿素直接作為生長(zhǎng)的能量來(lái)源[43]，因此獲得能量來(lái)源的途徑較多，利于其完成整個(gè)硝化作用。本研究中隨著灌溉水鹽度的增加Marine archaeal group 1 相對(duì)豐度顯著增加，說(shuō)明鹽分激發(fā)了AOA 耐鹽種群的生長(zhǎng)。原因可能是Marine archaeal group 1 主要在海洋環(huán)境中出現(xiàn)，對(duì)于鹽分具有較好的適應(yīng)性[44]。在AOB 屬水平上，Nitrosospira是優(yōu)勢(shì)微生物種群，且咸水灌溉Nitrosospira相對(duì)豐度高于微咸水灌溉。另外，Nitrosomonas相對(duì)豐度隨著灌溉水鹽度的增加而顯著降低，SW 處理中沒有檢測(cè)到Nitrosomonas的存在。這與前人研究一致，即Nitrosospira在高鹽環(huán)境富集，而Nitrosomonas在低鹽或者中鹽環(huán)境中富集[45]。

LEfSe分析結(jié)果表明AOA 群落結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，只有咸水灌溉時(shí)刺激了CandidatusNitrosocaldus 生長(zhǎng)。而AOB 群落對(duì)于鹽分的響應(yīng)較為敏感，微咸水灌溉出現(xiàn)5 個(gè)顯著高于其他處理的差異物種，這再一次印證了我們推測(cè)的微咸水灌溉條件下AOB 較為活躍，是參與硝化作用的主導(dǎo)微生物種群，而咸水灌溉條件下AOA可能是主導(dǎo)微生物種群。

3.4 土壤性質(zhì)對(duì)AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的影響

咸水灌溉抑制氨氧化微生物的生長(zhǎng)，改變其群落結(jié)構(gòu)，然而土壤的環(huán)境條件復(fù)雜，AOA 和AOB 對(duì)潛在硝化作用的貢獻(xiàn)高度依賴于土壤初始環(huán)境[46]，經(jīng)過10年咸水灌溉，土壤理化性質(zhì)發(fā)生顯著改變，環(huán)境因素的改變也影響著氨氧化微生物群落的變化。RDA 結(jié)果表明，除鹽分以外解釋AOA 群落結(jié)構(gòu)總變異量的59.1%（P=0.002），解釋AOB 群落總變異的33.3%（P=0.04），說(shuō)明咸水、微咸水灌溉條件下是影響AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)的主要因素之一。但是也有研究表明，土壤僅與AOB 群落變化存在顯著相關(guān)關(guān)系[47]。這可能是由于土壤養(yǎng)分條件不同，長(zhǎng)期咸水灌溉土壤氮素水平顯著低于淡水灌溉，AOA一般在較苛刻的環(huán)境（低氮、強(qiáng)酸性和高溫）中生長(zhǎng)更為活躍，表達(dá)功能活性更強(qiáng)[48]。此外，土壤pH 是影響AOA 和AOB 群落變化的主要因素，pH 對(duì)AOB 群落（解釋度47.7%，P=0.012）的影響要大于AOA（解釋度23.2%，P=0.032）。這可能是因?yàn)锳OA 細(xì)胞具滲透膜，可維持細(xì)胞內(nèi)pH 接近中性[49]，而本研究中pH 變化范圍較小，AOB 群落對(duì)于pH 變化響應(yīng)比AOA 更敏感。然而，有學(xué)者研究表明一般堿性土壤中硝化作用主導(dǎo)微生物類型是AOB，而與AOA 關(guān)系不大[50]。不一致的結(jié)果說(shuō)明鹽分是影響農(nóng)田土壤氨氧化微生物生態(tài)位變化的主導(dǎo)因素。然而本試驗(yàn)還不能具體分析出AOA 和AOB 分別對(duì)硝化作用的貢獻(xiàn)率，這仍然需要后續(xù)進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論