轉(zhuǎn)基因斑馬魚在鎘免疫毒性研究中的應(yīng)用

趙 爽，段鑫越，王 嬌，馮一凡，王予頔，宮知遠(yuǎn)，端正花*

（1.天津理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與安全工程學(xué)院，天津300384；2.新加坡國立大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新加坡117543）

隨著工業(yè)及社會(huì)的快速發(fā)展，水體重金屬污染已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一[1]。由于工業(yè)廢水的違法排放，造成鎘、砷、汞等多種重金屬離子進(jìn)入水體[2]。重金屬具有富集性并且難以自然降解，在水體中積累到一定限度就會(huì)對(duì)水體-水生植物-水生動(dòng)物系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害，并可能通過食物鏈直接或者間接影響到人類自身健康[3-4]。水體中重金屬污染物通常以很低濃度水平存在[5-6]。近年來，大量基于魚類、蚤類、藻類及處于不同營養(yǎng)級(jí)的微生物的毒性測試方法開始建立并迅速發(fā)展，為水體環(huán)境中低濃度污染物的毒性生物測試提供了可能[7]。但是以上這些方法都存在實(shí)驗(yàn)周期長、操作復(fù)雜的缺點(diǎn)。斑馬魚（Danio rerio）是環(huán)境毒理學(xué)中常用的標(biāo)準(zhǔn)生物模型[8]，與人類基因組相比其基因的保守性約為87%。轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)檢測方法在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步發(fā)展，該檢測技術(shù)快捷簡單，可在活體上直接進(jìn)行，因此能夠觀察到某一個(gè)體在環(huán)境污染物的干擾下整個(gè)連續(xù)生命周期的發(fā)展變化，從而可以為水環(huán)境污染檢測提供更快速、直觀的證據(jù)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)水質(zhì)毒性評(píng)價(jià)方法的不足[9]。

免疫毒性是重金屬毒性作用機(jī)制的一個(gè)重要方面。如重金屬鎘對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有廣泛的損傷作用，尤其是免疫系統(tǒng)[10]。在哺乳動(dòng)物及魚類血液的非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)中，中性粒細(xì)胞都起著十分重要的作用，當(dāng)發(fā)生炎癥時(shí)，中性粒細(xì)胞會(huì)被誘導(dǎo)和遷移到感染部位[11-12]。利用溶菌酶（lysozyme C，lyz）標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish血液中的中性粒細(xì)胞，如果斑馬魚受外源化合物影響導(dǎo)致體內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞則會(huì)遷移到該部位，表征為熒光量表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而可以便捷地找出炎癥相關(guān)的靶器官。鄒玉[13]在研究中也發(fā)現(xiàn)不同濃度的內(nèi)毒素（LPS）會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚Tg（lfap：EGFP；lyz：DsRED2）紅色熒光標(biāo)記的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向肝臟部位遷移聚集。本研究以轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish為模型，以重金屬鎘為研究對(duì)象，擬建立速度快、特性強(qiáng)的重金屬免疫毒性檢測技術(shù)，進(jìn)而為環(huán)境中重金屬的免疫毒性健康風(fēng)險(xiǎn)和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)中氯化鎘（CdCl2）為分析純，購于Sigma-Aldrich 公司。稱取一定量的粉末溶于重組水中，稀釋到需要的濃度。根據(jù)水體環(huán)境中重金屬的實(shí)際濃度和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)中CdCl2的暴露濃度為0（空白對(duì)照）、0.01、0.1、1 μmol·L-1。

實(shí)驗(yàn)室自培育成年野生斑馬魚和轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish，雌雄比1∶2，每日喂食活鹵蟲芽苗（Aremiamauplii，World Aquafedds，USA）1 次，于（26±1）℃光照/黑暗（14 h/10 h）周期條件下培養(yǎng)1個(gè)月，開始采集魚卵。飼養(yǎng)用水經(jīng)生物過濾器過濾并充分曝氣，pH值保持約8.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 毒性暴露

將轉(zhuǎn)基因斑馬魚種魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish與野生型斑馬魚種魚進(jìn)行雜交，得到斑馬魚魚卵。在24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入一定濃度的上述溶液，并于每孔中加入2 mL 試液和1 枚經(jīng)過挑選發(fā)育良好的受精卵，進(jìn)行零時(shí)（卵產(chǎn)出并受精1 h內(nèi)，0 hpf）染毒。人工氣候箱培養(yǎng)6 d 后，觀察致死和中毒反應(yīng)，培養(yǎng)過程中每2 d 更換一次溶液。胚胎發(fā)育期間的毒性觀察指標(biāo)有24 h 血流障礙（顯微鏡下未觀察到有血液流動(dòng)作為血流障礙判斷標(biāo)準(zhǔn)）、52 h 死亡數(shù)（以無心跳作為死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)）和52 h 孵化抑制（以未破胚胎絨毛膜作為孵化抑制的判斷標(biāo)準(zhǔn)）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。

培養(yǎng)到第6 d，在熒光顯微鏡下篩選各暴露組具有熒光表達(dá)的斑馬魚幼魚，并將其進(jìn)行麻醉、固定成相同的姿勢，利用熒光顯微鏡（ZEISS Axiovert 200M）觀察幼魚中熒光表達(dá)，并利用數(shù)碼相機(jī)（ZEISS，Axioc Cam HRC）在相同放大倍數(shù)和曝光時(shí)間下拍照記錄熒光表達(dá)量。每個(gè)暴露濃度和空白對(duì)照組記錄10 條轉(zhuǎn)基因斑馬魚的熒光量。

1.2.2 相關(guān)基因表達(dá)分析

根據(jù)毒性暴露結(jié)果，將0.1 μmol·L-1CdCl2溶液加入到10 cm 玻璃表面皿中，每孔加入20 mL 試液和50枚挑選過的發(fā)育良好的雜交斑馬魚魚卵，在人工氣候箱培養(yǎng)6 d 后，每暴露組取1 個(gè)表面皿中所有仔魚樣品作為1 個(gè)樣本，用液氮冷凍，于1.5 mL 離心管中-20 ℃冷凍保存。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組?？俁NA利用Trizol（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，US）方法提取，通過測定OD 值和1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的濃度和質(zhì)量。根據(jù)課題組前期研究結(jié)果[14]，選擇斑馬魚金屬硫蛋白相關(guān)基因（zMT、dMT）、炎癥相關(guān)基因（serp、tnf）和癌癥相關(guān)基因（ccgn1、chk2、p53）作為研究對(duì)象，以β-Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，具體功能與擴(kuò)增引物序列如表1 所示。按照常規(guī)方法取3 μg 上述總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用LightCycle 480（Roche Applied Science）設(shè)備及配備的試劑盒（Roche Applied Science）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR 分析。每個(gè)樣品均設(shè)置4 個(gè)平行，2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，最終結(jié)果用暴露組基因表達(dá)量相對(duì)空白組基因表達(dá)量比例的形式表示。

表1 待測基因引物序列Table 1 Primer sequences of target genes

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

胚胎發(fā)育各個(gè)毒性指標(biāo)和基因表達(dá)量的最終結(jié)果以平均值±s.d.的形式表達(dá)，以SPSS 19.0（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）軟件作圖。對(duì)照組與各暴露組間的差異用student-t進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05表示組間有顯著差異，P＜0.01表示組間有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CdCl2暴露對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎發(fā)育的影響

與空白實(shí)驗(yàn)組相比，CdCl2對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎發(fā)育主要有24 h血流障礙、52 h死亡數(shù)和52 h孵化抑制3 個(gè)毒性效應(yīng)。如圖1 所示，0.01 μmol·L-1CdCl2即可顯著抑制轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎的孵化（P=0.013）。隨著暴露濃度的增大，斑馬魚胚胎24 h血流障礙和52 h孵化抑制這兩個(gè)毒性效應(yīng)都顯著增強(qiáng)，其中CdCl2在52 h 孵 化 抑 制 指 標(biāo) 的EC50為0.05 μmol·L-1（R2=0.991）。當(dāng)CdCl2的濃度高達(dá)1 μmol·L-1時(shí)，斑馬魚胚胎的死亡率顯著增大到12.5%（P=0.025）。

2.2 CdCl2暴露對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚免疫毒性的影響

轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish利用溶菌酶標(biāo)記了斑馬魚血液中的中性粒細(xì)胞，不同濃度CdCl2暴露下Lyz fish仔魚中的中性粒細(xì)胞熒光量表達(dá)及其分布如圖2所示。

圖1 不同濃度CdCl2作用下轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎發(fā)育毒性Figure 1 Development toxicity by different concentrations of CdCl2 in transgenic zebrafish embryos

圖2 不同濃度CdCl2誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)基因斑馬魚體內(nèi)熒光表達(dá)Figure 2 The fluoresce expressions in transgenic zebrafish induced by CdCl2

0.01 μmol·L-1CdCl2誘導(dǎo)下的斑馬魚仔魚血管內(nèi)熒光表達(dá)量高于空白對(duì)照組，表示斑馬魚仔魚血管內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量增多。0.1 μmol·L-1和1 μmol·L-1CdCl2暴露下，不僅斑馬魚仔魚血管內(nèi)熒光表達(dá)量進(jìn)一步增強(qiáng)，而且還可以顯著看到紅色熒光在斑馬魚肝臟部位聚集。因此，CdCl2能夠誘導(dǎo)斑馬魚仔魚發(fā)生炎癥作用，血液和肝臟是其主要靶器官。

2.3 CdCl2暴露對(duì)斑馬魚仔魚標(biāo)志基因表達(dá)的影響

為進(jìn)一步探討CdCl2對(duì)斑馬魚仔魚免疫毒性的機(jī)制，試驗(yàn)對(duì)比研究了0.1 μmol·L-1CdCl2暴露下斑馬魚體內(nèi)金屬硫蛋白相關(guān)基因（zMT、dMT）、炎癥相關(guān)基因（serp、tnf）和癌癥抑制相關(guān)基因（chk2、ccnc、ccgn1）這3組功能基因的表達(dá)，結(jié)果如圖3 所示。0.1 μmol·L-1CdCl2顯著誘導(dǎo)了金屬硫蛋白相關(guān)基因dMT的表達(dá)，dMT基因表達(dá)量約為空白對(duì)照組的3 倍（P=0.001），而金屬硫蛋白相關(guān)基因zMT的表達(dá)則與空白對(duì)照組無顯著差異（P=0.253）。炎癥相關(guān)基因（tnf、serp）在轉(zhuǎn)基因斑馬魚仔魚體內(nèi)也顯著上調(diào)，分別為空白對(duì)照組的1.347 倍（P=0.001）和1.778 倍（P=0.025）。而癌癥相關(guān)基因（chk2、ccng1和p53）的表達(dá)在0.1 μmol·L-1CdCl2暴露下都顯著受到抑制，表達(dá)量分別為空白對(duì)照組的0.092、0.816 和0.596，其中chk2基因表達(dá)量受到的抑制更為顯著（P=0.030）。

圖3 0.1 μmol·L-1 CdCl2誘導(dǎo)下斑馬魚仔魚相關(guān)基因表達(dá)Figure 3 Expressions of related genes in transgenic zebrafish induced by 0.1 μmol·L-1 CdCl2

3 討論

3.1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚在環(huán)境污染物毒性檢測中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因斑馬魚是將外源基因通過顯微注射等方式導(dǎo)入斑馬魚受精卵，注射的外源基因能夠整合到斑馬魚受精卵的基因組中，從而建立具有穩(wěn)定遺傳特性的轉(zhuǎn)基因品系。熒光標(biāo)記不同組織（肝臟、心臟、腎臟等）、細(xì)胞（神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞）的多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系的出現(xiàn)，促進(jìn)了斑馬魚在遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)水產(chǎn)育種學(xué)等研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用[15-16]。近年來轉(zhuǎn)基因斑馬魚也在迅速發(fā)展，在環(huán)境毒理學(xué)方面也體現(xiàn)出一定的價(jià)值[17-18]。如Brion 等[19]構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系cyp19a1b-GFP用于評(píng)估歐洲廢水的內(nèi)分泌干擾活性。孫冰等[20]構(gòu)建了Tg（erevtg：egfp）轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可直觀地動(dòng)態(tài)監(jiān)測水體環(huán)境中內(nèi)分泌干擾物的污染情況。紀(jì)喜文等[21]利用芳香烴反應(yīng)元件AHRDtk構(gòu)建的新型轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可以直觀判斷水體環(huán)境中是否有該類化學(xué)物質(zhì)存在。

本研究發(fā)現(xiàn)，0.01 μmol·L-1CdCl2即可顯著抑制轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎的孵化，0.1 μmol·L-1CdCl2能夠?qū)е罗D(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎發(fā)生血流障礙。這與作者前期在野生型斑馬魚胚胎發(fā)育中得到的結(jié)果一致[14]。但是通過轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish可以直觀地看到在0.01 μmol·L-1和0.1 μmol·L-1CdCl2暴露下，斑馬魚仔魚體內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)量增多且趨向于肝臟，肝臟是CdCl2作用的主要靶器官之一。這也得到了作者前期結(jié)果的驗(yàn)證，即在利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lfabp10a：dsRed；elaA：EGFP）探討CdCl2的肝臟毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，0.1 μmol·L-1CdCl2單獨(dú)暴露使斑馬魚肝臟發(fā)生炎癥作用，肝臟相對(duì)空白對(duì)照顯著膨大，1 μmol·L-1CdCl2則顯著抑制斑馬魚肝臟發(fā)育[9]。

環(huán)境污染物作用于機(jī)體時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)功能常在早期就發(fā)生變化。因此，免疫轉(zhuǎn)基因斑馬魚的發(fā)展對(duì)于提高環(huán)境污染物檢測的靈敏度和及時(shí)采取預(yù)防措施具有重要意義[22]。目前我國免疫轉(zhuǎn)基因斑馬魚的應(yīng)用主要側(cè)重在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。如陳將飛等[23]通過免疫轉(zhuǎn)基因斑馬魚MPO研究發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑雷帕霉素（RAP）暴露能夠顯著抑制斑馬魚體內(nèi)免疫細(xì)胞（中性粒細(xì)胞）的熒光表達(dá)。王榮春等[24]發(fā)現(xiàn)氯霉素對(duì)免疫轉(zhuǎn)基因斑馬魚Lyz幼魚的致畸和致死作用具有劑量、時(shí)間依賴性，并可以導(dǎo)致斑馬魚幼魚的免疫細(xì)胞數(shù)量減少。免疫轉(zhuǎn)基因斑馬魚在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用還鮮有報(bào)道，本研究利用免疫轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（lysC：DsRed2）-Lyz fish模型探討了Cd 的免疫毒性效應(yīng)，得到了顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

3.2 Cd對(duì)斑馬魚造成免疫毒性的作用機(jī)制

化合物個(gè)體有害效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)理可以由一種信號(hào)路徑（Pathway）作用或幾種信號(hào)路徑共同作用分析得出。Cd 的重要作用機(jī)理則是與含巰基、氨基、羧基的蛋白質(zhì)分子結(jié)合形成鎘結(jié)合蛋白，使許多酶系統(tǒng)的活性受到抑制和破壞[25]。Cd 對(duì)斑馬魚仔魚造成損傷的途徑可能有氧化性損傷、代謝紊亂、炎癥、細(xì)胞凋亡等，進(jìn)一步作用則可能發(fā)生癌變。在這些復(fù)雜的信號(hào)傳遞過程中，與其相關(guān)的基因表達(dá)可能發(fā)生變化。反之，通過研究特定基因表達(dá)的變化，則可推斷該化合物造成毒性的作用途徑。例如在4-NP的氧化性壓力下，斑馬魚腫瘤抑制相關(guān)基因rb和p53的表達(dá)顯著增強(qiáng)[26]。

本研究通過金屬硫蛋白（Metallothionein，MT）、炎癥和癌癥抑制相關(guān)基因這3 類功能共7 個(gè)基因的表達(dá)，探討了0.1 μmol·L-1CdCl2誘導(dǎo)下斑馬魚仔魚免疫毒性的可能機(jī)制。金屬硫蛋白MT 是重金屬暴露下生物體內(nèi)的防御者。如研究證實(shí)生物體中MT 通過與Cd 螯合從而降低Cd 的毒性，并且MT 能夠在細(xì)胞不同周期抵御重金屬造成的DNA 損傷和細(xì)胞凋亡[27]。Bonaventura 等[28]也 研究發(fā)現(xiàn)Cd 暴 露刺激下 骨細(xì)胞炎癥與MT 的過度表達(dá)有顯著相關(guān)性。本研究也發(fā)現(xiàn)0.1 μmol·L-1CdCl2暴露顯著誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因斑馬魚MT相關(guān)基因dMT的表達(dá)。

環(huán)境污染物致癌是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程，其機(jī)理可能涉及污染物通過直接和各種間接途徑產(chǎn)生遺傳性損傷，通過干擾細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)原癌基因和蛋白的表達(dá)，以及抑制機(jī)體免疫防御功能等許多方面。免疫系統(tǒng)是生物異源物質(zhì)毒性效應(yīng)的主要靶系統(tǒng)之一。在癌癥形成過程中，免疫炎癥也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。例如，人體肺細(xì)胞（BEAS-2BR細(xì)胞）在Cd 暴露下激活了tnf-α、nf-κb及cox-2基因和蛋白的表達(dá)，從而產(chǎn)生炎性微環(huán)境，這與肺癌的發(fā)生有密切關(guān)系[29]。大鼠小腸上皮（IEC-6）細(xì)胞在Cd 的慢性暴露中，不僅降低了抑癌基因p53的表達(dá)水平，而且還降低了UBE2D家族基因的表達(dá)[30]。因此研究免疫系統(tǒng)的變化，不僅可以對(duì)癌癥起到預(yù)警作用，還可以從機(jī)制上尋求癌癥發(fā)生的可能途徑。本研究發(fā)現(xiàn)0.1 μmol·L-1CdCl2暴露顯著誘導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因斑馬魚炎癥相關(guān)基因（serp、tnf）的表達(dá)，抑制了癌癥抑制相關(guān)基因（ccgn1、chk2、p53）的表達(dá)。因此，Cd 對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚免疫毒性的機(jī)制與上述基因表達(dá)的變化具有一定的相關(guān)性，并且0.1 μmol·L-1CdCl2暴露對(duì)斑馬魚仔魚具有致癌風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié)論

（1）0.01 μmol·L-1CdCl2對(duì)斑馬魚胚胎產(chǎn)生發(fā)育毒性，并且能夠暴露顯著誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因斑馬魚的免疫毒性。

（2）Cd 免疫毒性的機(jī)制與其誘導(dǎo)金屬硫蛋白相關(guān)基因（dMT）、炎癥相關(guān)基因（serp、tnf）的表達(dá)及抑制癌癥相關(guān)基因（ccng1、chk2、p53）的表達(dá)有關(guān)。