UV-B輻射對元陽紅米籽粒形態(tài)和原花青素含量分布的影響

盛建軍，李 想，張彥雪，何永美，謝春梅，祖艷群，李 元

（云南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明650201）

20 世紀末期，由于生產生活中大量排放氟氯烴類化合物，平流層臭氧層開始變得稀薄，導致了到達地表的紫外線強度增加[1]。近年來，得益于《蒙特利爾條約》的簽訂，氟氯烴類化合物被限制使用，臭氧層衰減速度減慢[1]。但部分地區(qū)地表UV-B 輻射仍在增強[2]。地表UV-B 輻射增強會影響植物的生長發(fā)育、生理代謝和紫外吸收物質[3]。植物通過增加黃酮類物質含量抵御UV-B 輻射侵害[4]。研究表明UV-B 輻射對植物的生長效應具有雙重性，低強度的UV-B 輻射可以作為調控因子，超過植物耐受度則表現(xiàn)為脅迫因子[5]。適量補充UV-B 輻射，可以作為信號調節(jié)因子，通過高等植物的UV-B 受體（UV resistance locus 8，UVR8）激活體內修復機制[6]。

原花青素是一種紫外吸收物質，主要由黃酮-3-醇單元（兒茶素、表兒茶素及其3-O-沒食子酸酯和表沒食子酸酯）組成的聚合酚類化合物[7]。類黃酮代謝途徑可以生產黃酮醇、花青素和原花青素[8]。目前研究主要集中在UV-B 輻射對花青素[9]和總黃酮[10]的影響，關于UV-B 輻射對原花青素影響的研究較少。原花青素具有極強的抗氧化活性和自由基清除功能，能夠防治因自由基引起的心血管疾病[11]、糖尿病[12]、阿爾茲海默癥[13]、炎癥[14]等疾病。被廣泛應用于食品、保健品、藥品和化妝品等領域，是極具市場開發(fā)價值和經濟價值的天然產物，近年來，原花青素已成為國內外研究的熱點。已有研究表明UV-B 輻射可以誘導植物體內的原花青素合成，并且原花青素在植物器官和組織中的含量呈動態(tài)變化[15]，已有研究表明原花青素在葡萄中主要分布在果皮和種子中[16]。但是不同UV-B 輻射強度下植物體內的原花青素含量的變化特征、植物體內原花青素的分布特征鮮有報道。

稻米是我國傳統(tǒng)主食之一，目前中國的水稻種質資源中，有10%左右屬于有色稻，其中紅米稻種質有8963 份，占有色稻的首位[17]。紅米中富含大量花青素、原花青素等生物活性物質[18]，目前，大多數(shù)的研究都關注與藍莓[19]、葡萄[20]等水果中的原花青素含量，對水稻中原花青素的研究較少。為了明確地表UVB 輻射增強對水稻的生長發(fā)育和原花青素含量與分布的影響，本研究以元陽梯田傳統(tǒng)稻種“白腳老粳”為材料，通過原位種植模式下增加不同強度的UV-B 輻射，研究不同UV-B 輻射強度對紅米生長和籽粒中原花青素含量和分布的變化特征，為研究UV-B 輻射對籽粒中原花青素含量和分布的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于云南省紅河州元陽縣新街鎮(zhèn)箐口村（23°07′N、102°44′E），該地區(qū)海拔高度為1600 m，UV-B 輻射背景強度為10 kJ·m-2·d-1。當?shù)赝寥罏樗藶橥粒寥纏H 值為6.45，有機質含量為26.8 g·kg-1，全N 為2.48 g·kg-1，全P 為0.74 g·kg-1，全K 為6.03 g·kg-1，堿解N 為67.9 mg·kg-1，速效P 為20.5 mg·kg-1，速效K 為150.7 mg·kg-1。種植的水稻品種為白腳老粳，種子由云南省紅河州元陽縣新街鎮(zhèn)農科站提供，白腳老粳在當?shù)匾延?00 多年的種植歷史，是目前主要的培育品種之一。

1.2 試驗設計

水稻種植處理：白腳老粳于2017 年3 月20 日播種育苗，5月15日移栽至試驗小區(qū)。試驗點共布置12個小區(qū)，每個小區(qū)面積為390 cm×225 cm，小區(qū)間隔50 cm，每個小區(qū)種植10 行水稻，每行10 株，行距30 cm，株距15 cm，每叢為一株秧苗，外圍設置保護行（2行3 列）。在水稻生長期內不使用任何化肥和農藥，整個生育期處于淹水狀態(tài)。

UV-B 輻射處理：每行水稻上方安裝一個可調節(jié)長度的燈架，架設UV-B 燈管（40 W，波長280～320 nm，上海顧村儀器廠提供），用UV-B 輻射測定儀（北京師范大學光電儀器廠提供）測定水稻植株頂端輻射強度。設自然光（0 kJ·m-2·d-1）和UV-B 輻射（2.5、5.0、7.5 kJ·m-2·d-1）4 組處理，分別相當于當?shù)?%、10%、20%、30%的臭氧衰減。每日輻照時間為7 h（10：00—17：00），陰天或雨天不進行UV-B 輻射處理。隨著水稻的生長調節(jié)燈架高度，保持輻射強度不變。6 月25 日水稻抽穗期開始照燈，9 月28 日收獲水稻后停止試驗。

1.3 指標測定

1.3.1 生長指標

9月28日水稻收獲后，對水稻千粒質量、生物量、產量、粒長、粒寬、籽粒長寬比進行測量。每個小區(qū)隨機取10 株水稻測定千粒質量、生物量、粒長、粒寬并計算長寬比，測量方式為常規(guī)測量。籽粒收獲后經自然風干再測定產量。

每株籽粒生物量的測定：待收獲時，用自來水將水稻籽粒輕輕的沖洗干凈，然后在通風且無陽光直射的室內自然風干。裝入牛皮紙袋內，放入烘箱在80 ℃烘至恒質量。烘干時，每隔24 h 測定一次直到質量恒定，迅速稱量烘干后的籽粒質量。

1.3.2 原花青素含量的測定

參照劉連新等[21]的方法，用高效液相色譜法（HPLC）測定原花青素含量。色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶水∶乙腈=75∶5∶20；流速：1.0 mL·min-1；紫外檢測波長：280 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

對照品溶液的制備：精密稱取原花青素對照品0.002 5 g，置于25 mL 容量瓶中，先用部分甲醇溶解，超聲10 min，定容，超聲，用0.25 μm微孔濾膜過濾，得100 μg·mL-1的對照品貯備溶液。

樣品溶液的配制：將白腳老粳的稻殼和糙米分離，分別取稻殼和糙米樣品1.500 0 g，切碎，加入不低于80%的甲醇15 mL，加入磷酸調節(jié)pH=3.5，溫度控制在80 ℃，微波提取45 min。過濾提取液體，取上清液0.5 mL，用甲醇稀釋到50 mL。樣品用0.25 μm的微孔濾膜過濾，得待測樣品溶液，裝入樣品瓶中，備用。

標準曲線的繪制：分別精密移取對照品溶液1.00、2.00、3.00、4.00 mL，分別置于5 mL 的棕色容量瓶中用甲醇稀釋，超聲，定容，用0.25 μm 微孔濾膜過濾，注入樣品瓶。按照上述液相方法測定，記錄峰面積。以對照品進樣濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.3.3 紅米籽粒石蠟切片的制作

參照康海岐等[22]的方法，并進行改進，具體操作步驟如下：

取水稻籽粒分別進行橫切（垂直于芒和小穗軸連線切開）和縱切（水平于芒和小穗軸連線切開），切成數(shù)段后依次放入5%、10%、20%、30%、50%、70%的酒精中各5 min，最后將材料放入FAA 固定液中（每100 mL 含38%甲醇5 mL、冰醋酸5 mL、70%酒精90 mL）中保存。將固定好的材料依次用70%、80%、90%、95%的酒精脫水30 min，最后用純酒精脫水2 h（重復3次）。取脫水后的材料，依次放入1∶2、1∶1、2∶1的二甲苯∶酒精中各浸泡3 h，然后轉入純二甲苯中浸泡6 h（重復2 次）。從二甲苯中取出材料，放入融化的石蠟（60 ℃）中恒溫浸蠟2 h（重復3 次），必須保持恒溫，并且溫度不能過高。浸蠟后，將材料封入蠟塊中。將包埋的材料經過修整后，使用專用切片機（LEICA RM 2016）切成厚度為3 μm 的連續(xù)切片。在切片過程中，向材料中心處噴少量水，快速切片可以防止中心淀粉部分脫落，將切片放入水中，然后用載玻片撈取。將有材料的載玻片放入純二甲苯中30 min（重復3 次），然后依次在100%、95%、90%、80%、70%、60%、50%、30%、0 的酒精中清洗15 min。放入脫色劑（乙醇∶冰乙酸=3∶1）中脫色，再放入0.1% 4-（二甲基氨基）肉桂醛（DMACA）染劑中染色，后依次放入0、30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精中清洗15 min。DMACA 染劑（0.1%）的配制：稱取0.05 g DMACA 加入50 mL 的酸化乙醇中（現(xiàn)配）。酸化乙醇：將36%濃鹽酸（12.5 mL）、12.5 mL蒸餾水和75 mL乙醇（91%）混合，18～25 ℃中保存。粘片：取出染色后的撥片，立即用中性樹膠封固成永久切片，然后放入40 ℃烘箱中烘48 h。觀察：在光學顯微鏡下觀察（YS100，Nikon Japan），并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Microsoft Excel 對數(shù)據(jù)進行整理，計算平均值和方差。使用統(tǒng)計軟件SPSS 20 通過單因素差異分析，采用Duncan 檢驗法，P＜0.05水平進行處理間的差異性分析。用Origin 9.1作圖。

圖1 不同UV-B輻射對水稻稻殼中原花青素含量的影響Figure 1 Effect of different UV-B radiations on proanthocyanidins content in husk of rice

圖2 不同UV-B輻射對水稻糙米中原花青素含量的影響Figure 2 Effects of different UV-B radiations on proanthocyanidins content in brown of rice

表1 不同UV-B輻射強度對白腳老粳生長的影響Table 1 Effect of different UV-B radiation intensities on the growth of the“baijiaolaojing”

2 結果與分析

2.1 不同UV-B強度對白腳老粳籽粒形態(tài)的影響

UV-B 輻射會影響白腳老粳籽粒形態(tài)（表1）。隨著UV-B 輻射強度的增加，白腳老粳的粒長、粒寬、千粒質量、籽粒生物量和產量，都出現(xiàn)不同程度的下降。UV-B 輻射增強使籽粒粒長顯著降低。不同UV-B 輻射間差異沒有達到顯著水平，在7.5 kJ·m-2·d-1時粒長降幅達到了最大11.6%。UV-B 輻射為2.5 kJ·m-2·d-1和5.0 kJ·m-2·d-1時白腳老粳的粒寬無顯著變化，當UV-B 輻射強度增加到7.5 kJ·m-2·d-1時，粒寬顯著降低了7.8%。在不同UV-B 輻射處理下，只有2.5 kJ·m-2·d-1時籽粒長寬比與自然光照下存在顯著差異，降幅為8.7%。千粒質量和每株籽粒生物量隨著UV-B輻射增強持續(xù)降低，當UV-B 輻射增加到2.5 kJ·m-2·d-1時千粒質量和每株籽粒生物量顯著降低，伴隨著UV-B 輻射強度增加，抑制效應更加明顯，當UV-B 輻射強度增加到7.5 kJ·m-2·d-1時，千粒質量降低36.1%，每株籽粒生物量下降44.5%。UV-B 輻射增強，水稻產量顯著降低，但是不同UV-B 輻射間差異沒有達到顯著水平，在7.5 kJ·m-2·d-1時產量降幅達到最大22.8%。

2.2 不同UV-B強度對紅米原花青素含量的影響

白腳老粳稻殼和糙米中原花青素含量隨著UVB 輻射強度變化而變化。如圖1 所示，稻殼中原花青素含量隨著UV-B 輻射增加先增后減，在5.0 kJ·m-2·d-1時稻殼中原花青素含量達到最大值4.06 μg·g-1，相對于自然光照下增加了124.7%。隨著UV-B 輻射強度的繼續(xù)增加，當輻射強度達到7.5 kJ·m-2·d-1時，稻殼中原花青素含量顯著降低，稻殼中原花青素含量與自然光相比無顯著差異，比7.5 kJ·m-2·d-1顯著降低了45.9%。這說明UV-B 輻射對水稻稻殼中原花青素含量有著低強度促進，高強度抑制的效果。如圖2 所示，糙米中原花青素含量在2.5 kJ·m-2·d-1與5.0 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射強度下無顯著變化，當UV-B 輻射強度增加到7.5 kJ·m-2·d-1時，糙米中原花青素含量顯著降低，降幅為37.9%。低強度UV-B輻射（2.5 kJ·m-2·d-1和5.0 kJ·m-2·d-1）對糙米中原花青素含量無影響，但是高UV-B輻射（7.5 kJ·m-2·d-1）下糙米中原花青素含量顯著降低。

2.3 不同UV-B強度對紅米原花青素分布的影響

水稻籽粒中的原花青素分布如圖3 所示，原花青素主要聚集在果皮中以及胚乳周邊；越靠近中心區(qū)域，原花青素分布越少。不同強度UV-B 輻射下，籽粒中原花青素分布都呈現(xiàn)由外到內，逐漸減少的規(guī)律。但是，UV-B 輻射對原花青素的面積占比有顯著影響（圖4）。對水稻籽粒進行橫切后發(fā)現(xiàn)，UV-B 輻射在水平層面上會促進原花青素的分布，在2.5 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射強度下，原花青素面積占比都顯著上升，增幅為39.5%，占比達到31.8%。但是對籽粒進行縱切后發(fā)現(xiàn)，UV-B 輻射在垂直層面上會抑制原花青素的分布，在5.0 kJ·m-2·d-1和7.5 kJ·m-2·d-1的條件下，原花青素面積占比都顯著降低，降幅分別為24%和32.5%。自然光照下，原花青素占比最大，達到了22.8%，7.5 kJ·m-2·d-1時籽粒原花青素占比最小，僅有15.4%。不同UV-B 輻射強度處理下，原花青素在水平層面占比全部顯著大于垂直層面占比。

圖3 水稻籽粒中原花青素分布示意圖Figure 3 Schematic diagram of proanthocyanidins distribution in rice grains

圖4 不同UV-B輻射下水稻籽粒中原花青素分布Figure 4 Schematic diagram of proanthocyanidins distribution in rice grains

3 討論

UV-B 輻射作為非生物因子對水稻籽粒形態(tài)和原花青素含量有顯著影響。水稻籽粒形態(tài)是受多基因、多途徑調控的復雜形狀[23]。本研究發(fā)現(xiàn)UV-B 輻射會影響籽粒的粒長、粒寬和粒質量。UV-B 輻射對水稻籽粒形態(tài)的影響機理尚不明確。UV-B 輻射可以影響基因的表達，高等植物的UV-B 受體UVR8 可以感知到UV-B 信號[24]，在植物沒有受到UV-B 照射時，UVR8 在細胞核與細胞質中以二聚體的形式存在，在接受到UV-B 信號后，UVR8從細胞質中轉移到細胞核中，與組成型光形態(tài)建成1（Constitutively photomorphogenic 1，COP1）蛋白發(fā)生作用，開啟UV-B 信號通道，引起下游應答和轉錄調節(jié)[25-26]，從而影響籽粒形態(tài)。也可能是增強UV-B 輻射使植物體內發(fā)生強烈的自由基反應，產生大量的自由基，傷害植物光系統(tǒng)Ⅱ，使凈光合速率降低，同時脫落酸（ABA）的含量升高，可抑制光合作用，引起植株光合能力下降，降低生物量[27]，從而影響籽粒形態(tài)。

UV-B 輻射能導致作物植株有效穗數(shù)、穗總粒數(shù)、結實率、千粒質量下降，最終導致產量下降[28]。農作物產量是評估臭氧衰減影響的關鍵指標，UV-B 輻射改變了作物群體的形態(tài)特征和產量的形成過程，最終導致產量降低。在大田或溫室條件下，增強UV-B輻射都會影響作物的產量，大多數(shù)研究結果是增強UV-B 輻射使作物產量降低[29]，但也有報道表明增強UV-B 輻射對作物產量沒有影響或使作物產量顯著增高[30]。本試驗中，增強UV-B 輻射使得白腳老粳水稻產量降低，符合大多數(shù)研究結果，說明水稻在抵御外界脅迫、提高自身抗性的同時，消耗了生長所需的能量和水稻發(fā)育早期階段用于合成蛋白質的光合產物[29]，最終導致水稻產量下降。

環(huán)境因素會誘導植物中原花青素合成，過高或過低的條件都達不到誘導作用[31]。本研究中，在5.0 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射增強效果下，稻殼中原花青素含量顯著增加，而糙米中原花青素含量無顯著變化，稻殼作為稻米外層覆蓋物可以保護內部不受外界生物作用和非生物作用[32]，當UV-B 輻射增加到7.5 kJ·m-2·d-1時，稻殼和糙米中原花青素含量都顯著降低。這可能是UV-B 輻射強度過大，超過了稻殼耐性范圍，稻殼失去了保護能力，所以稻殼和糙米中原花青素都顯著降低。在一定溫度范圍（10～15 ℃）內，溫差越大，溫度越低，黑果枸杞中原花青素含量就越大[33]。溫度超過這個范圍后，原花青素含量顯著降低。異常溫度和UV-B 輻射都屬于逆境，植物在逆境中會促進原花青素合成，超過耐性范圍后，原花青素含量開始下降。原花青素代謝途徑的關鍵酶之一是黃烷酮-3-羥化酶（Flavanone3-hydroxylase，F(xiàn)3H），處于類黃酮生物合成途徑中的分叉點。研究發(fā)現(xiàn)，荒漠植物紅砂在增強的UV-B 輻射脅迫下類黃酮代謝途徑的關鍵酶F3H的活性先顯著升高后顯著降低，但仍顯著高于處理前水平。這表明UV-B 輻射誘導了類黃酮生物合成途徑中酶活性的增強，合成大量的類黃酮物質，參與抗氧化反應，提高植物在UV-B 輻射脅迫下的自我保護能力[34]。UV-B輻射可能誘導了白腳老粳稻殼中F3H 酶、抗氧化酶活性的增強，稻殼中合成大量的原花青素，參與抗氧化反應。耿艷艷等[35]研究表明黑米中原花青素二聚體等物質的含量與其抗氧化活性高度相關，保護穎果，提高了水稻UV-B 輻射脅迫下的自我保護能力。

原花青素在植物果實中的分布存在顯著差異，芒果果皮中原花青素含量顯著高于果肉中原花青素含量[36]。山葡萄果皮中原花青素含量隨著果實成熟含量顯著增加，而種子中原花青素含量隨著果實成熟無顯著變化[37]。本研究發(fā)現(xiàn)水稻籽粒原花青素主要分布在皮層和胚乳表層，也有研究表明有色稻的花青素主要沉積在果皮細胞中，但是在胚乳中未發(fā)現(xiàn)花青素沉積[38]，而李鳳英等[39]研究發(fā)現(xiàn)原花青素普遍存在于植物的皮、殼、核中。UV-B 輻射增強對籽粒原花青素垂直分布和水平分布的影響應該與籽粒不同部位接受UV-B輻射不均勻有關，還有待進一步研究。

4 結論

UV-B 輻射增強會抑制水稻生長，對水稻籽實的粒長、粒寬、千粒質量、籽粒生物量和產量有顯著影響。稻殼中原花青素含量在不同UV-B 輻射下呈現(xiàn)單峰曲線；當UV-B 輻射達到7.5 kJ·m-2·d-1時，對糙米中原花青素含量有顯著降低作用。原花青素在水稻籽粒中呈現(xiàn)由外到內逐漸減少的規(guī)律，原花青素主要聚集在果皮和胚乳表層。UV-B 輻射對水稻籽實中原花青素分布有顯著影響，在垂直結構上，UV-B輻射增強會抑制原花青素面積占比，在水平結構上，UV-B 輻射增強會促進原花青素面積占比。稻殼中原花青素含量隨UV-B 輻射呈拋物線關系，在增加5.0 kJ·m-2·d-1UV-B 輻射處理下稻殼中原花青素含量達到最大4.06 μg·g-1，隨后降低。糙米中原花青素含量在低強度UV-B 輻射處理下無顯著變化，在7.5 kJ·m-2·d-1時顯著降低。