地塞米松干預(yù)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的表觀遺傳學(xué)修飾

王鵬 王海彬,2* 徐亮亮,2 張濛 姜山

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510000 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510000

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外成骨分化需要地塞米松的參與，地塞米松是一種人工合成的皮質(zhì)類(lèi)固醇[1]。然而就Dex對(duì)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞的作用及具體機(jī)制，許多文獻(xiàn)報(bào)道卻大相徑庭[2]。結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，低濃度Dex促進(jìn)hBMSCs的成骨分化，而高濃度及長(zhǎng)期時(shí)間的使用會(huì)促進(jìn)hBMSCs的成脂分化，抑制成骨細(xì)胞的成熟，進(jìn)而引起骨量丟失，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生[3,4]。在BMSC分化過(guò)程中，糖皮質(zhì)激素所起的此種雙向效應(yīng)潛在機(jī)制仍未得到合理解釋。

表觀遺傳學(xué)的研究越來(lái)受到學(xué)術(shù)界的關(guān)注，它特指細(xì)胞在沒(méi)有發(fā)生DNA序列改變的情況下，使得不同細(xì)胞的基因表達(dá)水平不同，可通過(guò)有絲分裂遺傳，且在一定的作用下，這種基因表達(dá)是可逆的。研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化受到表觀遺傳的影響，尤其在其成骨分化中，涉及到的相關(guān)成骨特異基因已被證實(shí)受到DNA甲基化和組蛋白乙酰化的調(diào)控[5]。

本研究通過(guò)觀察高濃度地塞米松作用于hBMSC的表觀遺傳修飾及對(duì)其分化作用的影響，進(jìn)而從表觀遺傳學(xué)角度尋找治療激素性骨質(zhì)疏松的新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

熒光核染DAPI、熒光二抗、H3K4me3、H3K27me3抗體購(gòu)自Cell Signaling公司，Dnmt1抗體購(gòu)自Abcam公司；Dex購(gòu)自Sigma公司，5-aza-dC購(gòu)自BioVision中國(guó)。熒光定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqII購(gòu)自Takara，熒光定量PCR儀采用BIO-RAD CFX96 Touch。

1.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(購(gòu)自Cyagen公司)用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的ɑ-MEM完全培養(yǎng)基，放入37°、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁，2 d換液1次，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，當(dāng)細(xì)胞匯合密度為80%左右時(shí)行常規(guī)傳代處理，傳細(xì)胞至P4～P5時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 熒光定量PCR檢測(cè)

將細(xì)胞以104個(gè)/孔接種于12孔板或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，次日將細(xì)胞分為空白組，不同濃度(0、1、10 μmol/L)Dex作用組，ɑ-MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，3 d后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)合已知3 d實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，另取細(xì)胞分為(0、1 μmol/L)Dex作用組及Dex+5-aza-dC (10 μmol/L)干預(yù)組，培養(yǎng)7 d后提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR引物列表Table 1 Primers of RT-PCR

1.4 Western-blot檢測(cè)

檢測(cè)經(jīng)不同濃度地塞米松作用的細(xì)胞7 d后Dnmt1、H3K4me3、H3K27me3蛋白表達(dá)水平。預(yù)冷PBS洗滌6孔板中細(xì)胞2～3次，用Western-IP細(xì)胞裂解液(含1%蛋白酶抑制劑)冰上裂解細(xì)胞，刮除裂解的細(xì)胞放入1.5 mL離心管中，在4 ℃、12 000 r/min離心15 min收集上清液。BCA法測(cè)定總蛋白，取25μg蛋白行SDS-PACE凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5% BSA封閉，經(jīng)相應(yīng)一抗及二抗孵育，ECL發(fā)光法顯影。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

收集經(jīng)不同濃度地塞米松處理7 d后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以5 000個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于已放入相應(yīng)大小玻片的24孔板，每組3個(gè)孔，準(zhǔn)備爬片。24 h后將玻片取出，PBS清洗3次，每次3 min。后4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，每次3 min。0.3%Triton X-100(PBS配制)室溫通透30 min后，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸干PBS，在玻片上滴加5% BSA，室溫封閉30 min。吸盡封閉液后加入(1∶400)的H3K4me3抗體/(1∶1600)的H3K27me3抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。PBS浸洗爬片3次，每次3 min，吸干爬片上多余液體后滴加熒光二抗(1∶1000)，濕盒中常溫孵育1 h。使用DAPI 染核，蓋玻片封蓋樣品后進(jìn)行顯影拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定及生長(zhǎng)形態(tài)

細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿后過(guò)夜貼壁，2 d左右時(shí)間開(kāi)始迅速繁殖，傳至P4代，細(xì)胞形態(tài)成長(zhǎng)梭性，極性排列，見(jiàn)圖1。鑒定報(bào)告示該細(xì)胞表面強(qiáng)表達(dá)CD105、CD29、CD73、CD44，不表達(dá)CD34、CD45、CD11b。成脂誘導(dǎo)分化14 d后，油紅O染色可見(jiàn)標(biāo)準(zhǔn)脂滴形成；成骨誘導(dǎo)分化14 d后，茜素紅染色可見(jiàn)深紅色小結(jié)節(jié)；成軟骨誘導(dǎo)分化21 d后，可見(jiàn)典型細(xì)胞球形態(tài)。詳見(jiàn)附件-鑒定報(bào)告。

圖1 P4代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征(×250)Fig.1 Morphological characteristics of bone marrow mesenchymal stem cells on P4 generation (×250)

2.2 Dex作用成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 3 d 基因mRNA表達(dá)影響

Real-time PCR示高濃度(1、10 μmol/L)地塞米松對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)早期有促進(jìn)其向成骨系細(xì)胞分化的作用，其中1 μmol/L組Runx2、OPG mRNA表達(dá)較0 μmol/L組升高(P<0.05)，ALP、DNMT1表達(dá)顯著增加(P<0.01)；10 μmol/L組Runx2、DNMT1表達(dá)較0 μmol/L組升高(P<0.01，P<0.05)；Dex(1 μmol/L)+5-aza-dC (10 μmol/L)干預(yù)組ALP表達(dá)量較Dex(1 μmol/L)組下降(P<0.01)；RANKL表達(dá)無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度Dex及加予5-aza-dC (10 μmol/L)干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞3 d相關(guān)基因表達(dá)水平Fig.2 Related gene expression levels in mesenchymal stem cells treated with different concentrations of Dex and 5-aza-dC (10 μmol/L) for 3 d

2.3 Dex作用成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞7 d 基因mRNA及蛋白表達(dá)影響

Real-time PCR示1 μmol/L地塞米松抑制干細(xì)胞成骨分化，其中Col1a1、OPG mRNA表達(dá)較0 μmol/L組降低(P<0.05)，RANKL、DNMT1表達(dá)增加(P<0.05，P<0.01)；而Dex(1 μmol/L)+5-aza-dC (10 μmol/L)干預(yù)組，Runx2表達(dá)較Dex組升高(P<0.05)，RANKL、DNMT1表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)。Western-blot示1 μmol/L濃度組H3K27me3蛋白表達(dá)水平高于0 μmol/L組，H3K4me3表達(dá)量相對(duì)低于0 μmol/L組，見(jiàn)圖3。免疫熒光檢測(cè)示細(xì)胞核內(nèi)H3K4me3、H3K27me3抗原-抗體復(fù)合物表達(dá)情況與Western-blot結(jié)果類(lèi)似，見(jiàn)圖4。

圖3 1 μmol/L Dex及加予5-aza-dC (10 μmol/L)干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞7 d成骨及表觀遺傳相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平Fig.3 Osteogenic and epigenetic related gene and protein expression levels in mesenchymal stem cells treated with 1 μmol/L Dex and 5-aza-dC (10 μmol/L) for 7 d

3 討論

糖皮質(zhì)激素是臨床上被廣泛運(yùn)用的一種免疫抑制劑，起到抗炎、抗內(nèi)毒素、影響造血系統(tǒng)等作用。然而體內(nèi)的長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致骨代謝失衡，進(jìn)而快速性的骨密度下降[6]；但在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，地塞米松卻作為促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的必要元素之一。在經(jīng)典間充質(zhì)干細(xì)胞成骨與成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化液的配方中，低濃度(0.1 μmol/L)地塞米松通過(guò)促進(jìn)Cbfal、Osterix、ALP mRNA等表達(dá)而促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化；而在成脂肪誘導(dǎo)分化液中，增加了10倍濃度地塞米松(1 μmol/L)可與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合激活促脂肪轉(zhuǎn)錄因子-增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(C/EBPS)，該蛋白能特異性激活過(guò)氧化物增殖體激活受體2(PPAR2)啟動(dòng)子區(qū)，進(jìn)而激活該基因表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞的生成[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在高濃度地塞米松持續(xù)作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的條件下，成骨分化相關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄因子如Runx2、Col1a1表達(dá)受到了明顯的抑制，由此可以反向推測(cè)該時(shí)期干細(xì)胞的分化趨勢(shì)已向成脂細(xì)胞傾斜，這也與臨床上激素性骨質(zhì)疏松癥的病理過(guò)程是一致的。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的共享前體細(xì)胞，前體細(xì)胞的成脂趨勢(shì)壓制成骨分化傾向，使這種雙向平衡被打破，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生，同時(shí)這種現(xiàn)象不僅在激素使用的患者身上被發(fā)現(xiàn)，年齡的差異、微重力的影響、制動(dòng)的作用等一系列與外界刺激或者環(huán)境的改變的相關(guān)因素中都有類(lèi)似報(bào)道[8,9]，這與表觀遺傳學(xué)理論不謀而合：Bernstein等[10]發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞發(fā)育與分化過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與表觀遺傳修飾是緊密聯(lián)系的，基因的沉默受到DNA甲基化、組蛋白乙?；刃揎椃绞接绊?，且依靠DNMT1及伴隨的組蛋白重新編碼在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中維持下去。研究報(bào)道，在前體脂肪細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Dex可以與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合于Runx2基因的啟動(dòng)子區(qū)達(dá)到抑制Runx2轉(zhuǎn)錄促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的作用[11]，開(kāi)啟了學(xué)術(shù)界從表觀遺傳學(xué)角度解釋糖皮質(zhì)激素影響干細(xì)胞分化的大門(mén)。本研究亦證實(shí)高濃度地塞米松干預(yù)間充質(zhì)干細(xì)胞后，表觀遺傳相關(guān)修飾蛋白如DNMT1、H3K4me3、H3K27me3的表達(dá)受到不同趨勢(shì)的影響。且經(jīng)5-aza-dC干預(yù)后，Real-time PCR 示ALP mRNA表達(dá)水平被部分抑制，較Dex(1 μmol/L)組明顯下降；而在地塞米松持續(xù)作用下，5-aza-dC干預(yù)組Runx2、Col1a1等表達(dá)量亦得到不同程度的增加，較Dex(1 μmol/L)組明顯上升，上述結(jié)果不僅與DNA甲基化對(duì)基因組基因表達(dá)起抑制作用的結(jié)論是一致的[12]，也提示DNA甲基化參與了Dex對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化過(guò)程中的雙向效應(yīng)。

Ge等[13]提出在人脂肪干細(xì)胞(hADSC)中，Runx2啟動(dòng)子區(qū)H3K4me2或H3K4me3的去甲基化即可起到抑制hADSC成骨分化的作用。Hemming等[14]報(bào)道在干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)H3K27m3甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2可特異性調(diào)節(jié)microRNA MX1與microRNA FHL1，進(jìn)而下調(diào)Runx2表達(dá)起到抑制成骨分化的作用。本研究中Western-blot及免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)1 μmol/L地塞米松處理7 d后，細(xì)胞核內(nèi)H3K4me3表達(dá)水平降低，而H3K27me3升高，且Runx2 mRNA 表達(dá)明顯下降，提示地塞米松持續(xù)作用所致的成骨抑制效應(yīng)確與特異性影響H3K4me3/ H3K27me3表達(dá)有關(guān)。

本文研究表明，地塞米松對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的效應(yīng)具有雙向性，與干預(yù)時(shí)間有關(guān)，表觀遺傳修飾相關(guān)因子DNMT1、H3K4me3、H3K27me3也參與其作用的發(fā)生發(fā)展。這在一定程度上揭示了Dex造成骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制，有助于從表觀遺傳學(xué)角度尋找治療激素性骨質(zhì)疏松癥的新方法。