續(xù)斷對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠炎癥因子的影響

陳磊 張莉

山東齊魯醫(yī)藥學(xué)院，山東 淄博 255213

隨著年齡增加，人們?nèi)菀装l(fā)生骨質(zhì)疏松癥，當(dāng)骨質(zhì)疏松合并骨折時(shí)，常表現(xiàn)出較高的骨折延遲愈合及不愈合發(fā)生率，這一直是困擾骨科治療的問(wèn)題[1]。中醫(yī)藥治療骨傷歷史悠久，具有不良反應(yīng)少，療效明顯等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于骨質(zhì)疏松性骨折治療[2]。如張柳等[3]報(bào)道，麝香烏龍丸對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠股骨骨折有明顯促進(jìn)骨折愈合的作用。

續(xù)斷為川續(xù)斷科川續(xù)斷屬植物川續(xù)斷的根?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效[4]。卿茂盛等[5]報(bào)道，續(xù)斷能改善骨質(zhì)疏松性骨折愈合骨痂的生物力學(xué)性能，促進(jìn)骨折愈合。續(xù)斷促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制主要集中在通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性及BMP-2 的表達(dá)，提高血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性，升高鈣磷乘積，促進(jìn)鈣鹽沉積，從而增強(qiáng)體內(nèi)成骨。而在骨折發(fā)生時(shí)常常伴有炎癥反應(yīng)，有關(guān)續(xù)斷對(duì)骨折愈合中的炎癥反應(yīng)的影響還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分析骨質(zhì)疏松骨折中炎癥因子的變化，觀察續(xù)斷對(duì)炎癥因子的影響，為續(xù)斷的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器

續(xù)斷(Xuduan)購(gòu)自山東省藥材公司，并經(jīng)過(guò)專家鑒定為正品。續(xù)斷水煎劑：續(xù)斷水煎煮3次，每次1 h，煎煮液過(guò)濾，濾液合并，濃縮至相對(duì)密度1.00～1.10時(shí)，40 ℃左右加入乙醇，邊加邊攪拌使醇量達(dá)40%，冷藏靜置48 h，離心過(guò)濾，沉淀物再用40%乙醇攪拌，冷藏靜置一夜，離心過(guò)濾，濾液與上一次乙醇濾液合并，濃縮(揮去乙醇)，進(jìn)一步濃縮至每毫升含生藥20 g，分裝，藥物避光，4 ℃冰箱保存。骨源性堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)試劑盒(批號(hào)：20170515)， 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF -α)試劑盒(批號(hào)：20170421),白介素-1(Interleukin-1，IL-1β)試劑盒(批號(hào)：20170425)和白介素-6(Interleukin -6，IL-6)試劑盒(批號(hào)：20170526)，HE染色試劑盒(批號(hào)：20170225)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

HOLOGIC4 500 A型雙能X線骨密度掃描儀(Hologic公司，美國(guó))。徠卡病理系統(tǒng)(Leica公司，德國(guó))。

1.2 動(dòng)物模型制備與分組

雌性SD大鼠50只，清潔級(jí)，體質(zhì)量為200～250 g，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯)2014 0006。隨機(jī)分為5組：常規(guī)骨折組、骨質(zhì)疏松性骨折組、續(xù)斷治療組(高劑量組和低劑量組)、雌激素組，每組10只。一般性骨折組行假手術(shù)，其他各組大鼠行背部雙側(cè)去卵巢術(shù)切除雙側(cè)卵巢，造成骨質(zhì)疏松模型。術(shù)后3個(gè)月，各組動(dòng)物均用10%水合氯醛麻醉后，取右下肢股外側(cè)切口暴露股骨干，于股骨中段用鋼鋸將股骨橫行鋸斷，以直徑1 mm克氏針固定，依次縫合關(guān)閉切口，建立大鼠右側(cè)股骨中段骨折模型。根據(jù)續(xù)斷臨床用量為6～15 g/kg，大鼠和人的等量比值是6.3(照大鼠體表面積換算)，臨床最大等效劑量為1.58 g/kg，大鼠實(shí)驗(yàn)常規(guī)采用臨床劑量的5～30倍，7.9～47.4 g/kg，在這個(gè)范圍取兩個(gè)給藥劑量為20 g和10 g續(xù)斷生藥/kg體重。雌激素組給藥劑量為0.125 mg/kg體重；灌胃給藥，常規(guī)骨折組和骨質(zhì)疏松骨折組給予等體積的生理鹽水灌胃。灌胃4周后，分別將受試大鼠采用1%戊巴比妥鈉麻醉，主動(dòng)脈取血，離心10 min(3 000 r/min)分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆?。處死大鼠，解剖取出右?cè)股骨，剔凈軟組織后分別置雙能X線骨密度儀掃描整個(gè)股骨標(biāo)本，記錄下骨密度數(shù)據(jù)，然后用生理鹽水沖洗置股骨標(biāo)本固定于4%的多聚甲醛，然后加入含5.5%EDTA的10%中性福爾馬林溶液進(jìn)行脫鈣，待做病理檢查。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1血清BALP活性、TNF-α、IL-1和IL-6水平檢測(cè)：取冰凍血清解凍，采用發(fā)色底物法測(cè)定血清 BALP活性，采用雙抗夾心法測(cè)定血清TNF-α、IL-1和IL-6水平。

1.3.2HE染色觀察骨痂微結(jié)構(gòu)：脫鈣完成后的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)的包埋、切片、脫蠟，使用蘇木精原伊紅染液進(jìn)行染色，光鏡下隨機(jī)選取兩組骨折線處骨痂組織高倍視野(×200)拍照，并觀察骨折骨痂切面單位視野內(nèi)的骨小梁、軟骨細(xì)胞、骨基質(zhì)等，進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組大鼠進(jìn)食飲水正常，狀況良好，骨折手術(shù)時(shí)，由于受麻醉劑的影響，進(jìn)食量降低，體重增長(zhǎng)緩慢，其余時(shí)間無(wú)異常。大鼠的兩次手術(shù)切口均在1 周后愈合。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中均無(wú)動(dòng)物死亡。

2.2 骨密度測(cè)量結(jié)果

測(cè)定各組動(dòng)物的骨密度發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松骨折組、雌激素治療組和續(xù)斷治療組大鼠股骨骨密度值顯著低于常規(guī)骨折組(P<0.05)，提示骨質(zhì)疏松造模成功；續(xù)斷治療組和常規(guī)骨折組、雌激素治療組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明續(xù)斷有促進(jìn)骨密度增加的作用，結(jié)果見表1。

2.3 各組大鼠血清中BALP、TNF-α、IL-1和IL-6水平

與常規(guī)骨折組比較，骨質(zhì)疏松骨折組TNF-α、IL-1和IL-6水平均明顯升高，BALP水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與骨質(zhì)疏松骨折組比較，雌激素和續(xù)斷治療組降低了TNF-α、IL-1水平，升高IL-6水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中高劑量組作用最明顯，部分指標(biāo)接近雌激素組，具體結(jié)果見表2。

組別 股骨骨密度/(g/cm2) 常規(guī)骨折組0.155±0.005骨質(zhì)疏松骨折組0.141±0.003?雌激素治療組(0.125 mg/kg)0.156±0.006#續(xù)斷治療高劑量組(20 g/kg)0.155±0.005#續(xù)斷治療低劑量組(10 g/kg)0.153±0.004#

注：與常規(guī)骨折組比較，*P<0.05；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，#P<0.05。

組別BALP/(U/L)TNF-α/(ng/L)IL-1/(μg/L)IL-6/(μg/L)常規(guī)骨折組74.66±5.6792.41 ±8.76118.05±24.35935.49±32.67骨質(zhì)疏松骨折組54.38±4.62?144.32±9.78?186.83±55.34?1239.03±68.57?雌激素治療組(0.125 mg/kg)75.35 ±6.29#98.46 ±7.39#116.27±28.16#928.53±37.49#續(xù)斷治療高劑量組(20 g/kg)68.42±5.18#104.85±8.11#123.43±35.44#958.82±52.73#續(xù)斷治療低劑量組(10 g/kg)61.02±5.76#122.46±9.83#145.23±42.41#1038.26±61.22#

注：與常規(guī)骨折組比較，*P<0.05；與骨質(zhì)疏松骨折組比較，#P<0.05。

2.4 病理組織學(xué)結(jié)果

骨痂組織HE染色光鏡觀察：常規(guī)骨折組骨小梁分布較規(guī)則，厚度均勻致密，間距小，排列有序，軟骨性骨痂已逐漸被骨性骨痂取代，形成片狀骨。而骨質(zhì)疏松性骨折組骨小梁分布不規(guī)則，較細(xì)，髓腔間隙較大，呈疏松化表現(xiàn)，有炎癥細(xì)胞分布。與骨質(zhì)疏松性骨折組比較，雌激素治療組和續(xù)斷治療組骨小梁數(shù)量多，形狀更粗，間距更小，炎細(xì)胞較少， 軟骨細(xì)胞骨化占比高，高劑量組作用最為明顯，結(jié)果見圖1。

圖1 骨折大鼠骨痂組織HE染色(×200) A：一般骨折對(duì)照組；B：骨質(zhì)疏松性骨折模型組；C：雌激素治療組；D：續(xù)斷治療高劑量組；E：續(xù)斷治療低劑量組。Fig.1 HE results of postoperative femoral callus in rats (×200). A: The conventional fracture group; B: The osteoporotic fracture group; C: Estrogen group; D: Xuduan high dose treatment group; E: Xuduan low dose treatment group.

3 討論

程志安等[6]報(bào)道，續(xù)斷水煎劑能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、增加堿性磷酸酶的表達(dá)及礦化結(jié)節(jié)形成的數(shù)量，促進(jìn)成骨細(xì)胞骨鈣素和Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷能增加血清中骨源性堿性磷酸酶水平，促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度，軟骨細(xì)胞骨化明顯，促進(jìn)骨折愈合。這個(gè)結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致，顯示了其強(qiáng)骨作用。續(xù)斷主要含有三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等[4]。劉二偉等[7]報(bào)道，水煎液中總皂苷是促進(jìn)骨傷愈合的活性成分，續(xù)斷乙醇提取物對(duì)成骨細(xì)胞有明顯的增殖作用，說(shuō)明中藥續(xù)斷的兩種組分對(duì)成骨細(xì)胞的增殖均具有促進(jìn)作用。

骨折愈合是破骨與成骨動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，成骨性細(xì)胞和破骨性細(xì)胞主導(dǎo)這個(gè)過(guò)程，而它們二者又受細(xì)胞因子作用，由于骨折是常伴有組織損傷，必然發(fā)生炎癥反應(yīng)，所以炎癥因子常常參與骨折過(guò)程。炎性細(xì)胞因子與低骨量和骨折危險(xiǎn)性有關(guān)，多種炎性因子包括TNF-α、IL-1等可以刺激破骨細(xì)胞分化形成[8]。本次實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，骨折模型組的炎性因子TNF-α、IL-1和IL-6水平增高，證實(shí)了骨折時(shí)炎癥因子升高。有關(guān)抗炎治療，常規(guī)的抗炎藥有效，其實(shí)中藥也有抗炎作用。有關(guān)研究[9]表明，苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用與它們?cè)谝欢▌┝糠秶鷥?nèi)劑量依賴性地抑制MF經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生 TNF-α有關(guān)，黃芪總黃酮抗大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用除與NO的量有關(guān)外, 也與其降低滑膜細(xì)胞內(nèi) IL-1、IL-6水平相關(guān)。

黃濱等[10]報(bào)道，續(xù)斷70%乙醇提取物能顯著抑制大鼠蛋清性腳腫脹、二甲苯所致的小鼠耳部炎癥。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷可降低TNF-α、IL-1、IL-6水平，增加骨小梁數(shù)量、骨小梁厚度，說(shuō)明續(xù)斷有抗炎作用，通過(guò)降低炎癥因子TNF-α，IL-1對(duì)破骨細(xì)胞的刺激，降低破骨細(xì)胞的活化，從而有利于骨折愈合。續(xù)斷的主要成分是三萜皂苷類、環(huán)烯醚萜類、生物堿類、黃酮類、揮發(fā)油類等，具體哪一種成分起作用還不好確定，因?yàn)檫@些成分都有抗炎作用的相關(guān)報(bào)道[9-10]。由于中藥成分復(fù)雜，一味中藥往往含有多種抗炎成分,能經(jīng)多種途徑達(dá)到抗炎治療作用，所以續(xù)斷可能通過(guò)多種成分共同作用發(fā)揮抗炎作用。

總之，在骨質(zhì)疏松骨折愈合過(guò)程中，續(xù)斷可通過(guò)多方式降低炎癥因子的水平，進(jìn)一步影響骨折愈合。