華山壯骨散對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠BMP/Smad/UPP通路的作用機(jī)制

黃春元 劉英雪 謝晚晴 蔣寧 林庶茹 鄭洪新* 劉海起*

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110101 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110032

糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head，以下簡(jiǎn)稱激素性股骨頭壞死)是由于長(zhǎng)期、大量的使用糖皮質(zhì)激素造成的股骨頭缺血性壞死，是臨床常見(jiàn)病。根據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，激素性股骨頭壞死的發(fā)病率在逐年增長(zhǎng)，其發(fā)病隱匿、進(jìn)展快、預(yù)后差、致殘率高[1]。本實(shí)驗(yàn)采用華山壯骨散對(duì)其進(jìn)行治療，華山壯骨散有補(bǔ)益肝腎、活血化瘀的作用，對(duì)股骨頭壞死的治療有較好的臨床效果，通過(guò)檢測(cè)BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的表達(dá)情況來(lái)探討華山壯骨散防治激素性股骨頭壞死的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)選用120只SD雄性大鼠，體質(zhì)量在(220±20)g，全部由遼寧長(zhǎng)生生物有限公司提供，進(jìn)行隨機(jī)分組后，將大鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，每籠10只，給予普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水，攝食。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑、儀器：QUANTITE CTSYBR green PCR kit(沈陽(yáng)鑫科生物制劑中心)、TRIzol(Invitrogen，Cat no15596-026)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，大連寶生物公司合成)、低溫高速離心機(jī)(法國(guó)Jouan，MR1822)、熒光PCR儀(美國(guó) Agilent Technologies，Stratagene Mx3000P)、微量核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó) Bio Drop E114095)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物：華山壯骨散(由九種免煎顆粒組成)，全部由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院中藥局提供，配制成藥液4 ℃保存?zhèn)溆?；壯骨關(guān)節(jié)丸，華潤(rùn)三九醫(yī)藥有限公司，規(guī)格為60粒/瓶(批號(hào)為16030045)；醋酸潑尼松龍注射液，浙江仙居制藥股份有限公司(批號(hào)為160806)，規(guī)格0.125 g/5mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1激素性股骨頭壞死動(dòng)物模型建立與分組：將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組，分別為正常組(A組)、模型組(B組)、壯骨關(guān)節(jié)丸組(C 組、陽(yáng)性對(duì)照組)、實(shí)驗(yàn)低劑量組(D組)、實(shí)驗(yàn)高劑量組(E組)，每組各24只。A 組不做任何處理，B、C、D、E組采取臀肌注射醋酸潑尼松龍20 mg/kg，每周2 次；同時(shí)，臀肌注射青霉素，每周2 次，預(yù)防感染。

1.2.2給藥方法：A、B組給予等量生理鹽水，C組給予中藥壯骨關(guān)節(jié)丸灌胃治療，D組給予低濃度華山壯骨散灌胃治療，E組給予高濃度華山壯骨散灌胃治療。實(shí)驗(yàn)期間每周稱重一次，根據(jù)體重調(diào)整用藥量，連續(xù)灌胃10周。灌胃結(jié)束后取大鼠的股骨頭和腎臟保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3觀測(cè)指標(biāo)：觀測(cè)大鼠股骨頭和腎組織的BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的mRNA表達(dá)情況。

1.2.4標(biāo)本制備及檢測(cè)方法：骨組織標(biāo)本的制備：取大鼠兩側(cè)股骨頭，放入已裝有TRIzol的Ep管內(nèi)，做好標(biāo)記，放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。腎組織標(biāo)本的制備：取大鼠腎臟，剝離掉外層薄膜，用刀片將腎臟分為兩半，取腎皮質(zhì)，放入已裝有TRIzol的Ep管內(nèi)，做好標(biāo)記，放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０凑誘RIzol試劑說(shuō)明書(shū)采取一步法提取股骨頭、腎臟組織中總的RNA。計(jì)算樣品總RNA濃度，完成股骨頭、腎臟組織中總RNA的制備；根據(jù)大鼠BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2序列，使用Premier 5.0設(shè)計(jì)合成了擴(kuò)增BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2片段的特異性引物(以β-actin基因作為PCR的內(nèi)參照)，進(jìn)行引物序列設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)；再依據(jù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件以及PCR反應(yīng)體系及條件，進(jìn)行RT-PCR試驗(yàn)。為減少誤差，各組BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的表達(dá)水平均以相對(duì)表達(dá)量來(lái)表示[2]。

表1 引物序列設(shè)計(jì)Table 1 Primer sequence design

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠股骨頭和腎組織BMP4mRNA表達(dá)情況

與正常組相比，模型組股骨頭和腎組織BMP4mRNA表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各組股骨頭和腎組織BMP4mRNA表達(dá)均有增加，但增加程度有所不同，其中實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織中BMP4mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)低劑量組股骨頭和腎組織中BMP4mRNA略有增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比較，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織的BMP4 mRNA表達(dá)增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

組別股骨頭腎組織正常組1.03±0.25Δ?1.12±0.55Δ?模型組0.22±0.07#?0.20±0.07#壯骨關(guān)節(jié)丸組0.40±0.07#Δ0.32±0.10#實(shí)驗(yàn)低劑量組0.28±0.11#0.27±0.08#實(shí)驗(yàn)高劑量組0.51±0.06#Δ0.56±0.19#Δ

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，ΔP<0.05；與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比，*P<0.05。

2.2 大鼠股骨頭和腎組織的Smad4 mRNA表達(dá)

與正常組相比，模型組的股骨頭和腎組織Smad4 mRNA表達(dá)均有降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各組股骨頭和腎組織Smad4mRNA表達(dá)均有增加，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織中Smad4mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)低劑量組股骨頭和腎組織中Smad4 mRNA有表達(dá)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比較，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織中Smad4mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3大鼠股骨頭和腎組織的Smad4 mRNA表達(dá)

組別股骨頭腎組織正常組1.04±0.28Δ?1.03±0.24Δ?模型組0.06±0.03#0.03±0.02#壯骨關(guān)節(jié)丸組0.24±0.07#0.20±0.08#實(shí)驗(yàn)低劑量組0.11±0.03#0.13±0.09#實(shí)驗(yàn)高劑量組0.48±0.16#Δ?0.63±0.28#Δ?

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，ΔP<0.05；與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比，*P<0.05。

2.3 各組大鼠股骨頭和腎組織的Smurf1 mRNA表達(dá)

與正常組相比，模型組的股骨頭和腎組織Smurf1mRNA表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織中Smurf1mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；壯骨關(guān)節(jié)丸組股骨頭中Smurf1mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比較，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織Smurf1mRNA表達(dá)增加，但在股骨頭表達(dá)中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在腎組織表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

組別股骨頭腎組織正常組1.01±0.17Δ?1.01±0.15Δ?模型組0.23±0.08#?0.22±0.08#壯骨關(guān)節(jié)丸組0.38±0.05#Δ0.38±0.18#實(shí)驗(yàn)低劑量組0.30±0.10#0.33±0.14#實(shí)驗(yàn)高劑量組0.46±0.09#Δ0.70±0.17#Δ?

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，ΔP<0.05；與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比，*P<0.05。

2.4 大鼠股骨頭和腎組織的Smurf2 mRNA表達(dá)

與正常組相比，模型組股骨頭和腎組織Smurf2 mRNA表達(dá)量都顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，各組股骨頭和腎組織中Smurf2 mRNA表達(dá)均有增加，其中，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織的Smurf2mRNA表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；壯骨關(guān)節(jié)丸組股骨頭中Smurf2 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比較，實(shí)驗(yàn)高劑量組股骨頭和腎組織的Smurf2 mRNA表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表5。

組別股骨頭腎組織正常組1.01±0.15Δ?1.03±0.25Δ?模型組0.04±0.01#?0.01±0.00#壯骨關(guān)節(jié)丸組0.15±0.04#Δ0.04±0.01#實(shí)驗(yàn)低劑量組0.07±0.04#0.02±0.00#實(shí)驗(yàn)高劑量組0.28±0.03#Δ?0.26±0.14#Δ?

注：與正常組相比，#P<0.05；與模型組相比，ΔP<0.05；與壯骨關(guān)節(jié)丸組相比，*P<0.05。

3 討論

股骨頭壞死的病名在古代醫(yī)籍中沒(méi)有記載，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，可將其歸為“骨蝕” “骨痹”等范疇，其形成主要是由于藥邪侵襲股骨，經(jīng)絡(luò)氣血郁痹，髓減骨蝕所致，內(nèi)在因素則與肝腎虧虛，筋骨失養(yǎng)有關(guān)[3,4]。中醫(yī)治療以補(bǔ)益肝腎，活血化瘀為主。華山正骨作為孫華山創(chuàng)始的骨傷科學(xué)術(shù)流派，在全國(guó)骨傷科具有廣泛的學(xué)術(shù)影響。華山壯骨散為孫氏所創(chuàng)，在前期臨床實(shí)踐中療效顯著，其組成主要以礦物質(zhì)藥物自然銅為主，主要功效是散瘀止痛，續(xù)筋接骨；佐以相應(yīng)植物藥和動(dòng)物藥如骨碎補(bǔ)、劉寄奴、續(xù)斷、土鱉蟲(chóng)、地龍等，能更好地發(fā)揮治療作用，但其作用機(jī)制尚未明確。

激素性股骨頭壞死是股骨頭壞死的常見(jiàn)類型，主要由于糖皮質(zhì)激素使用劑量較大、時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致骨組織的再生修復(fù)能力障礙，股骨頭結(jié)構(gòu)改變，股骨頭塌陷、變形，關(guān)節(jié)炎癥，功能障礙。有文獻(xiàn)指出，骨組織的血液循環(huán)障礙可引起骨重建失衡[5]。

在股骨頭壞死的修復(fù)過(guò)程中，BMP/Smad/UPP通路起著關(guān)鍵作用。BMP4是TGF-β超家族中的重要成員之一，其結(jié)構(gòu)和功能與BMP2相似，可以誘導(dǎo)相關(guān)骨組織的形成, 有助于骨組織的修復(fù)，是骨在發(fā)育過(guò)程中不可缺少的關(guān)鍵因子[6]。Smad通路主要的功能是傳遞TGF-β超家族中的信號(hào)，Smad蛋白是BMP的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[7-8]，目前根據(jù)Smad蛋白的結(jié)構(gòu)和功能可將其分為三類：特異型、共有型和抑制型。其中Smad4蛋白屬于共有型，其功能較為重要，調(diào)控著TGF-β超家族的所有因子在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，是BMP2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞形成的關(guān)鍵蛋白[9]。特異性降解細(xì)胞內(nèi)Smads蛋白的是泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway UPP)這主要途徑，Smurf1和Smurf2屬于泛素連接酶E3的成員，可以選擇性降解Smad蛋白和調(diào)控BMP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的增殖和分化[2]。

本研究結(jié)果表明，正常大鼠體內(nèi)的BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2可以在基因水平正常表達(dá)。在注射糖皮質(zhì)激素以后，其表達(dá)受到影響，造成大鼠的股骨頭不能正常發(fā)育，逐漸形成激素性股骨頭壞死。中藥復(fù)方華山壯骨散可以調(diào)節(jié)模型大鼠股骨頭和腎臟中BMP4、Smad4、Smurf1和Smurf2的基因表達(dá)，與模型組相比，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)高、低劑量組治療后，均可以提高模型大鼠的BMP4和Smad4的表達(dá)。與實(shí)驗(yàn)低劑量組相比，高劑量的華山壯骨散可以明顯促進(jìn)模型大鼠BMP4和Smad4的表達(dá)，加快骨細(xì)胞生成，促進(jìn)骨質(zhì)形成，修復(fù)骨損傷，從而延緩激素性股骨頭壞死的形成。

由于股骨頭壞死的修復(fù)機(jī)制非常復(fù)雜，其治療方法多樣化，但對(duì)于大多數(shù)人來(lái)說(shuō)人工置換股骨頭并不是最好的選擇，尋找新藥、新技術(shù)來(lái)治療股骨頭壞死刻不容緩。華山壯骨散治療股骨頭壞死的療效確切，作用機(jī)制明確，便于臨床使用。但其作用的具體機(jī)制還需做進(jìn)一步深入探討，才能更好的為臨床防治股骨頭壞死提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，開(kāi)拓新的治療藥物。