• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關(guān)抗原蛋白及應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

    2019-12-23 08:04:30劉堯林駿梁永羿山云王洪濤徐良
    關(guān)鍵詞:表位噬菌體抗原

    劉堯,林駿,梁永羿,山云,王洪濤,徐良

    論著

    噬菌體展示系統(tǒng)篩選糖尿病相關(guān)抗原蛋白及應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

    劉堯,林駿,梁永羿,山云,王洪濤,徐良

    用噬菌體展示系統(tǒng)篩選與糖尿病相關(guān)的自身抗原新表位,表達(dá)新抗原肽段并評(píng)價(jià)其在糖尿病診斷中的應(yīng)用效果。

    以 I 型糖尿病血清作為靶分子,對(duì) Ph.D.-12 噬菌體肽庫(kù)進(jìn)行淘選,測(cè)序淘選的噬菌體并用 ELISA 檢測(cè)噬菌體與靶分子的結(jié)合效果,BLAST 分析特異性最好的表位與糖尿病的相關(guān)性,選擇合適的目的基因合成重組質(zhì)粒,用 Expi 293 細(xì)胞表達(dá)新抗原肽段并檢測(cè)該抗原與臨床血清的特異結(jié)合效果。

    共完成 2418 個(gè)噬菌體單克隆的測(cè)序,淘選出 93 種表位序列,11 種具有代表性的表位中測(cè)序超過(guò) 200 次的有 4 種,對(duì)特異性最強(qiáng)的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”進(jìn)行分析后選擇 mTOR 相關(guān)蛋白 mEAK-7 作為目的基因,抗原肽段與臨床血清的特異性結(jié)合效果為:I型糖尿病陽(yáng)性率為 17%,II型糖尿病陽(yáng)性率為 4%。

    mEAK-7 蛋白對(duì)糖尿病血清具有一定的抗原特異性,該基因與糖尿病可能有相關(guān)性,具有很好的研究?jī)r(jià)值。

    噬菌體展示系統(tǒng); 糖尿??; 自身抗體; 抗原表位

    I 型糖尿病是由于自身免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤攻擊和損傷胰島β 細(xì)胞,使胰島素合成和分泌減少或者完全缺失的自身免疫性疾病,臨床上大多數(shù) I 型糖尿病患者可被檢測(cè)到胰島自身抗體,目前來(lái)說(shuō),GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 這 5 種胰島自身抗體是 I 型糖尿病檢測(cè)應(yīng)用最廣泛、最受認(rèn)可、相關(guān)性最強(qiáng)的自身免疫標(biāo)志物[1-2]。本研究通過(guò)噬菌體展示系統(tǒng)獲得與糖尿病相關(guān)的自身抗原新表位的氨基酸序列進(jìn)行自身抗原肽段的表達(dá),評(píng)估包含抗原表位在內(nèi)人工構(gòu)建的蛋白多肽對(duì)于糖尿病診斷的臨床價(jià)值和意義。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料、試劑

    噬菌體展示試劑盒和ER 2738 購(gòu)自 Biolab 公司;培養(yǎng)基組分、Xgal、IPTG 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;抗-M13 抗體(HRP)購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司;限制性?xún)?nèi)切酶和Expi 293 真核表達(dá)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司;去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒和蛋白電泳試劑購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;ELISA 板購(gòu)自美國(guó)康寧公司;TMB 單組分顯色液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;糖尿病抗體檢測(cè)試劑盒、全自動(dòng)免疫印跡分析儀購(gòu)自深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司;全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司;菌株DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存;其他化學(xué)試劑為分析純以上等級(jí)。

    1.2 方法

    1.2.1 噬菌體展示系統(tǒng)的淘選方法 分別收集來(lái)自健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清,并將健康人,I 型糖尿病血清包被于 96 孔板中,150 μl/孔。TBST 溶液洗板 6 次,添加封阻液封阻,取 100 μl 原始噬菌體文庫(kù)(2 × 1011PFU)添加到包被有健康人血清的孔里,室溫作用 1 h,回收未結(jié)合的噬菌體液。將回收的噬菌體液添加到包被I型糖尿病血清的孔里,室溫作用 1 h,TBST 洗板 10 次,用洗脫液洗脫與I型糖尿病血清特異性結(jié)合的噬菌體。將特異性噬菌體感染至大腸桿菌 ER 2738 中擴(kuò)增 4.5 h,離心,取上清,用 PEG/NaCl 4 ℃沉淀過(guò)夜。次日將沉淀物離心,棄上清,將沉淀物溶于 TBST 溶液中,此即擴(kuò)增的噬菌體。將淘選后的噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定、擴(kuò)增,進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)淘選。每一輪進(jìn)行 4 個(gè)循環(huán)淘選,一共進(jìn)行4 輪淘選。

    1.2.2 測(cè)序淘選的噬菌體 取每個(gè)循環(huán)淘選后未擴(kuò)增的噬菌體液 5 μl 感染至大腸桿菌 ER 2738 并涂于含有四環(huán)素的 LB 培養(yǎng)皿上,37 ℃孵育過(guò)夜,隨機(jī)挑取 160 個(gè)單克隆噬菌斑,擴(kuò)增后將單克隆噬菌體送至上海生工進(jìn)行測(cè)序。剩余噬菌體液保存于 4 ℃用于后續(xù) ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn),或者用滅菌甘油 1:1 稀釋后,–20 ℃貯存。

    1.2.3 ELISA 檢測(cè)噬菌體對(duì)靶分子的特異性 對(duì)所有序列的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,將測(cè)序頻次高于 200 的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增并滴定。準(zhǔn)備兩個(gè)96 孔微孔板,每個(gè)待鑒定克隆分別在每個(gè)板上對(duì)應(yīng)一列孔(12 個(gè)孔)。板 1 用于包被 I 型糖尿病血清后進(jìn)行 ELISA 檢測(cè)所選序列與靶分子的結(jié)合力;板 2 僅用封阻液封阻后作為空白對(duì)照用于檢測(cè)所選序列對(duì) BSA 包被塑料板的結(jié)合力。將 1 × 1012PFU 的噬菌體進(jìn)行 5 倍系列梯度稀釋至第 12 孔,濃度分別為:1 × 1012、2 × 1011、4 × 1010、8 × 109、1.6 × 109、3.2 × 108、6.4×107、1.28 × 107、2.56 × 106、5 × 105、1 × 105和 2 × 104PFU,用多通道移液器將稀釋好的噬菌體吸取 100 μl 加入包被有靶分子的板 1 的對(duì)應(yīng)孔中,再吸取 100 μl加入板 2 的對(duì)應(yīng)孔中,每個(gè)濃度梯度做 3 個(gè)重復(fù)。室溫振蕩作用 1 h,洗板 6 次,添加稀釋后的抗-M13 抗體(HRP 標(biāo)記),200 μl/孔,室溫作用1 h,洗板 6 次后每孔加入 200 μl 底物溶液,室溫作用 20 min,酶標(biāo)儀檢測(cè) 405 nm 處的吸光度。

    1.2.4 分析表位序列與糖尿病的相關(guān)性 將上述驗(yàn)證特異性最好的表位序列導(dǎo)入 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 分析,查找與該表位序列具有同源關(guān)系的人源的氨基酸或蛋白片段,分析其與糖尿病、胰島 β 細(xì)胞或者相關(guān)疾病的關(guān)系,定位與糖尿病自身抗體相關(guān)的抗原表位。

    1.2.5 重組蛋白表達(dá) 選擇與糖尿病相關(guān)性最大的基因,設(shè)計(jì)與之對(duì)應(yīng)的核苷酸編碼序列,以定位的抗原表位為中心向該基因上下游分別延伸約200 個(gè)堿基作為目的基因,選取pcDNA 3.1 作為真核表達(dá)載體,合成重組質(zhì)粒。將合成的重組質(zhì)粒酶切并電泳鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng),抽提無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進(jìn) Expi 293 細(xì)胞中進(jìn)行重組蛋白的表達(dá),收集表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)液,電泳檢測(cè)表達(dá)效果。

    1.2.6 ELISA 檢測(cè)重組蛋白的抗原特異性 將純化的重組蛋白稀釋至 1 μg/ml,添加到 96 孔板中,100 μl/孔,在 4 ℃包被過(guò)夜;PBST 溶液洗板 3 次,加入封阻液封阻,用樣品稀釋液分別將健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清稀釋 100 倍,添加到 96 孔板中,每個(gè)樣本一個(gè)孔,室溫孵育 30 min,洗板 3 次,添加稀釋后的 HRP 標(biāo)記的兔抗人 IgG,100 μl/孔,室溫作用 30 min,洗板 3 次后每孔加入 100 μl 的 TMB 顯色液,室溫孵育 15 min,每孔加入100 μl 終止液,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔 450 nm 吸光度。

    1.2.7 與其他糖尿病自身抗體對(duì)比 用糖尿病抗體檢測(cè)試劑盒和全自動(dòng)免疫印跡分析儀分別對(duì)健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者的血清進(jìn)行檢測(cè),統(tǒng)計(jì) GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA2A 的陽(yáng)性率。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行分析及作圖,多組差異比較采用單因素方差分析,以< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 淘選的表位序列測(cè)序結(jié)果

    本實(shí)驗(yàn)每輪淘選出 640 個(gè)單克隆噬菌體(表 1),經(jīng)過(guò) 4 輪淘選的送測(cè)序樣本共計(jì) 2560 個(gè),最終獲得有效測(cè)序樣本共計(jì) 2418 個(gè),占總樣本的 94.4%,共淘選出 128 種表位序列,其中 15 種表位序列出現(xiàn)的頻次較高,具有一定代表性。排除各輪之間 35 種重復(fù)序列后得到特異表位序列 93 種,排除各輪之間 4 種重復(fù)代表性表位序列后得到代表性特異表位序列 11 種,代表性特異表位序列樣本數(shù)為 1620 個(gè)(表 2),占有效測(cè)序樣本的 67%。

    表 1 淘選的表位序列結(jié)果

    表 2 具有代表性的特異表位序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果

    2.2 ELISA 檢測(cè)噬菌體對(duì)靶分子的特異性

    ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示同一種噬菌體在濃度為 1 × 1012、2 × 1011和 4 × 1010PFU 時(shí)檢測(cè)值差異較小,但 P12-3 在各個(gè)濃度梯度的檢測(cè)值都與其他噬菌體差異較大(< 0.0001),比其他幾個(gè)噬菌體的檢測(cè)值高至少 3 倍。雖然 P12-1 和 P12-2 出現(xiàn)的頻次高于 P12-3,但是 P12-3 的特異性明顯強(qiáng)于其他幾種噬菌體,特異性由強(qiáng)到弱分別是:P12-3 > P12-2 > P12-1 > P12-4(圖 1A)。P12-1、P12-2 和 P12-4 只有在濃度大于 8 × 109PFU 時(shí)才有明顯的檢測(cè)效果,而 P12-3 在濃度介于 2.56 × 106~4 × 1010PFU 之間的檢測(cè)結(jié)果有良好的線性關(guān)系(y = 3E + 09x2– 4E + 09x + 6E + 08,2= 0.9984)(圖 1B)。

    2.3 BLAST 分析多肽序列

    將特異性最高 P12-3 的表位序列“-GTFLFSLCAAVY”導(dǎo)入 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行 BLAST分析,與該序列具有同源性的人源基因共有 60 個(gè)序列,統(tǒng)計(jì)后獲得 5 個(gè)與該序列具有較高同源性的人源基因(表 3)。

    2.4 重組質(zhì)粒及真核表達(dá)的目的蛋白的鑒定

    通過(guò)分析,選取與“-GTFLFSLCAAVY”同源性最高的 mTOR 相關(guān)蛋白 mEAK-7 作為目的基因并合成重組質(zhì)粒,合成 DNA 分子量約為 480 bp(圖 2A),經(jīng)過(guò)真核細(xì)胞 Expi293 表達(dá),重組的 mEAK-7 分子量約為 18 kD,符合預(yù)期重組蛋白的分子量大?。▓D 2B)。

    2.5 ELISA 檢測(cè)表達(dá)的重組蛋白的抗原特異性

    將純化后的重組蛋白作為抗原包被在 96 孔板上,用 ELISA 方法檢測(cè)健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病血清(各 200 例)與重組蛋白的特異性反應(yīng),結(jié)果顯示,健康人樣本均呈現(xiàn)陰性結(jié)果,I 型糖尿病樣本有 34 個(gè)呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,陽(yáng)性率為 17%,II 型糖尿病樣本有 8 個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,陽(yáng)性檢出率為 4%,說(shuō)明 mEAK-7 蛋白對(duì)于糖尿病患者血清具有一定的特異性(圖3)。

    圖 1 噬菌體與靶分子的特異性檢測(cè)(A:ELISA檢測(cè)不同表位的噬菌體在不同濃度條件下與靶分子的特異性識(shí)別;n = 3,*P < 0.0001;B:ELISA分析P12-3的檢測(cè)線性范圍)

    Figure 1 Specific identification of phage and target molecules (A: Specific identification of target molecules and different epitopes at different concentrations by ELISA; n = 3,*< 0.0001; B: Linear range of ELISA analysis for P12-3)

    表 3 表位序列同源性分析結(jié)果

    1:?jiǎn)蚊盖校?:雙酶切;3:對(duì)照;4:mEAK-7;M:Marker

    Figure 2 Identification of recombinant plasmids and recombinant proteins (A: Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant plasmids; B: SDS-PAGE analysis of recombinant protein)

    圖 3 ELISA 檢測(cè)重組蛋白與臨床血清的結(jié)合效果

    Figure 3 Identification of the binding effect of recombinant protein and clinical serum by ELISA

    2.6 免疫印跡法檢測(cè)其他糖尿病自身抗體陽(yáng)性率

    用免疫印跡法對(duì)健康人、I 型糖尿病、II 型糖尿病患者血清(各 200 例)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示I 型糖尿病患者血清中 GADA 和 ZnT-8A 陽(yáng)性率較高(表 4),分別為 61.5% 和 52%,ICA、IAA、IA-2A 的陽(yáng)性率介于 17% ~ 20%,與 mEAK-7 的陽(yáng)性檢出結(jié)果近似;II 型糖尿病患者血清的 GADA陽(yáng)性率也是最高的,達(dá)到 17.5%,ZnT-8A、ICA、IAA、IA-2A 的陽(yáng)性率均小于 10%,而 ICA 和 IA-2A 的陽(yáng)性率分別為 4.5% 和 4%,與 mEAK-7 的陽(yáng)性檢出結(jié)果類(lèi)似。

    表 4 GADA、ICA、IAA、ZnT-8A、IA-2A 的陽(yáng)性率檢測(cè)

    3 討論

    mTOR 信號(hào)通路在生物體內(nèi)眾多細(xì)胞信號(hào)通路中占據(jù)相當(dāng)重要的地位,參與調(diào)控如增殖、生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種生命現(xiàn)象,同時(shí)在炎癥、腫瘤、代謝和心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道 mTOR 信號(hào)通路與胰島素和糖代謝相關(guān),在長(zhǎng)期高濃度的葡萄糖刺激下,信號(hào)通路 Insulin/PI3K/PKB 下游的 mTOR/S6K1 處于激活狀態(tài),過(guò)度表達(dá)而抑制胰島素的信號(hào)傳導(dǎo),從而引起胰島素抵抗[3-4]。目前關(guān)于 mEAK-7 相關(guān)功能的研究報(bào)道很少,也沒(méi)有文獻(xiàn)提出其與糖尿病相關(guān),但有報(bào)道提出 mEAK-7 能夠?qū)?mTOR 招募到溶酶體中與其相互作用,通過(guò) S6K2 和 4E-BP1 激活另一種 mTOR 信號(hào)通路,調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移[5]。因此,mEAK-7 有可能通過(guò)調(diào)節(jié) mTOR 信號(hào)通路而調(diào)節(jié)胰島素分泌。

    噬菌體展示技術(shù)成為探測(cè)蛋白空間結(jié)構(gòu)、探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋找高親和力和生物活性的配體分子的有利工具,噬菌體展示技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、食品、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域[6-9]。本研究應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)最終篩選出的特異性最高的抗原表位“-GTFLFSLCAAVY”,且 ELISA 實(shí)驗(yàn)證明真核表達(dá)的 mEAK-7 蛋白能夠與糖尿病血清中的靶分子有一定的特異結(jié)合效果。與目前廣泛認(rèn)可的糖尿病自身抗體GADA、IAA、ICA、ZnT-8A、IA-2A 陽(yáng)性率對(duì)比,mEAK-7 在 I 型糖尿病中的陽(yáng)性率接近于ICA、IAA、IA-2A 的陽(yáng)性率,在 II 型糖尿病中的陽(yáng)性率接近于 ICA、IA-2A 的陽(yáng)性率,因此mEAK-7 對(duì)糖尿病自身抗體的檢測(cè)具有一定的輔助作用,為深入研究糖尿病自身抗原抗體提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    [1] Kang HH,Liu JH,Wu LN, et al. Application and research progress of islet autoantibodies in diabetes. Lab Med Clin, 2018, 15(13):2015- 2020. (in Chinese)

    康歡歡, 劉建華, 吳麗娜, 等. 胰島自身抗體在糖尿病中的應(yīng)用及研究進(jìn)展. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床, 2018, 15(13):2015-2020.

    [2] Wang TR, Bao Z. Study on combined detection of diabetes autoantibodies in diabetes typing. J North Pharm, 2015, 12(12):129- 130. (in Chinese)

    王天榮, 鮑哲. 糖尿病分型中糖尿病自身抗體聯(lián)合檢測(cè)的探討. 北方藥學(xué), 2015, 12(12):129-130.

    [3] Harrington LS, Findlay GM, Gray A, et al. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins. J Cell Biol, 2004, 166(2):213-223.

    [4] Um SH, D'Alessio D, Thomas G. Nutrient overload, insulin resistance, and ribosomal protein S6 kinase 1, S6K1. Cell Metab, 2006, 3(6):393- 402.

    [5] Nguyen JT, Ray C, Fox AL, et al. Mammalian EAK-7 activates alternative mTOR signaling to regulate cell proliferation and migration.

    Sci Adv, 2018, 4(5):eaao5838.

    [6] Shukra AM, Sridevi NV, Chandran D, et al. Production of recombinant antibodies using bacterio phages. Eur J Microbiol Immunol (Bp), 2014, 4(2):91-98.

    [7] Shi LF, Wu Y, Li CY. Identification of high-affinity VEGFR3-binding peptides through a phage-displayed random peptide library. J Gynecol Oncol, 2015, 26(4):327-335.

    [8] Zhao YY, Zhao SM, Liang Y, et al. Application of phage display technology in food safety. Sci Technol Food Ind, 2017, 38(14):342- 346. (in Chinese)

    趙巖巖, 趙圣明, 梁穎, 等. 噬菌體展示技術(shù)在食品安全分析中的應(yīng)用. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(14):342-346.

    [9] Hua XD, Shi HY, Wang MH. Phage display peptide library technology and its research progress in immunoassay of pesticide residue. J Food Saf Qual, 2014, 5(12):3955-3961. (in Chinese)

    華修德, 施海燕, 王鳴華. 噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)及其在農(nóng)藥殘留免疫分析中的研究進(jìn)展. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014, 5(12):3955- 3961.

    Screening of diabetes-associated antigen protein by phage display system and evaluation of its application effect

    LIU Yao, LIN Jun, LIANG Yong-Yi, SHAN Yun, WANG Hong-tao, XU Liang

    We aim to screen a novel epitope of antigen associated with diabetes by phage display system, andexpress new antigenic peptides and evaluate its potential application in the diagnosis of diabetes.

    Type 1 diabetes patients serum were used for the panning of the Ph.D.-12 phage display library, and the selected phases were sequenced and the binding effect of the phage on the target molecule was detected by ELISA. The correlation between the best specific epitope and diabetes was analyzed by BLAST, and appropriate target gene was selected to construct recombinant plasmid. The new antigen peptide was expressed in Expi 293 cells and detected for specific binding effect on clinical serum.

    A total of 2418 phage monoclonal sequences were sequenced, and 93 epitope sequences were selected, from which 4 of the 11 representative epitopes were sequenced more than 200 times. The best specific epitope sequence was identified as “-GTFLFSLCAAVY”. After analysis, mTOR-associated protein mEAK-7 was selected as a target gene, and the positive rate for the specific binding effect of the antigen peptide on clinical serum was 17% and 4% in type I and II diabetic serum, respectively.

    mEAK-7 protein may have specific binding effect on diabetic serum. This gene may be related to diabetes and has good research value.

    Phage display system; Diabetes; Autoantibody; Antigen epitope

    XU Liang, Email: xuliang@szda.gov.cn

    Author Affiliations:In-vitro Diagnostic Reagents Testing Department, Shenzhen Institute for Drug Control/Shenzhen Testing Center of Medical Devices, Gungdong 518057, China

    10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.007

    廣東省食品藥品監(jiān)督管理局科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2018ZDB14);深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20170307090049352)

    518057 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院/深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心體外診斷試劑部

    徐良,Email:xuliang@szda.gov.cn

    2019-09-09

    猜你喜歡
    表位噬菌體抗原
    H3N2流感病毒HA保守Th表位對(duì)CD4+T細(xì)胞活化及分化的影響
    不同富集培養(yǎng)方法對(duì)噬菌體PEf771的滴度影響
    高效裂解多重耐藥金黃色葡萄球菌的噬菌體分離及裂解酶的制備
    聯(lián)合T、B細(xì)胞表位設(shè)計(jì)多肽疫苗的研究進(jìn)展①
    副溶血弧菌噬菌體微膠囊的制備及在餌料中的應(yīng)用
    梅毒螺旋體TpN17抗原的表達(dá)及純化
    小反芻獸疫病毒化學(xué)合成表位多肽對(duì)小鼠的免疫效果研究
    結(jié)核分枝桿菌抗原Lppx和MT0322人T細(xì)胞抗原表位的多態(tài)性研究
    APOBEC-3F和APOBEC-3G與乙肝核心抗原的相互作用研究
    噬菌體治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的綜述
    51午夜福利影视在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 不卡av一区二区三区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 精品国产美女av久久久久小说| 黄频高清免费视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一级毛片高清免费大全| 波多野结衣高清无吗| 久久精品影院6| 久久性视频一级片| 级片在线观看| 老司机深夜福利视频在线观看| 午夜精品国产一区二区电影| 久久精品影院6| 成年人黄色毛片网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品在线美女| 亚洲熟妇熟女久久| bbb黄色大片| 日韩大尺度精品在线看网址 | 丝袜人妻中文字幕| 久久伊人香网站| 亚洲国产精品合色在线| 一区二区日韩欧美中文字幕| 久久久久久久久久久久大奶| 级片在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久久久国内视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 免费在线观看完整版高清| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲第一电影网av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲精品美女久久av网站| 国产色视频综合| av天堂久久9| 少妇 在线观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美乱妇无乱码| 久久热在线av| 精品电影一区二区在线| 久久久国产精品麻豆| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品av麻豆狂野| 麻豆久久精品国产亚洲av| 一二三四社区在线视频社区8| 十八禁人妻一区二区| 高清在线国产一区| 欧美日韩黄片免| 99国产精品免费福利视频| 久久性视频一级片| 看黄色毛片网站| 久热爱精品视频在线9| 亚洲专区中文字幕在线| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲国产欧美一区二区综合| www国产在线视频色| 国产av一区在线观看免费| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产视频一区二区在线看| 精品国产美女av久久久久小说| 老鸭窝网址在线观看| 欧美中文综合在线视频| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产麻豆成人av免费视频| 可以在线观看毛片的网站| 日韩免费av在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产国语露脸激情在线看| 波多野结衣巨乳人妻| 午夜福利高清视频| 欧美日韩乱码在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 色哟哟哟哟哟哟| www.999成人在线观看| 好男人在线观看高清免费视频 | 国产高清视频在线播放一区| 91成年电影在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线国产一区二区在线| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男女下面插进去视频免费观看| 精品久久久久久成人av| 国产精品免费视频内射| 成人三级黄色视频| 免费看美女性在线毛片视频| 大码成人一级视频| 成人欧美大片| 日本五十路高清| 亚洲九九香蕉| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美成人午夜精品| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产人伦9x9x在线观看| 午夜日韩欧美国产| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久国产精品影院| 久久精品91蜜桃| 亚洲精品一区av在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 久久久国产精品麻豆| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久久久久久久中文| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 精品不卡国产一区二区三区| 999精品在线视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 黑丝袜美女国产一区| 国产av又大| 中文字幕高清在线视频| 亚洲片人在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲久久久国产精品| 热99re8久久精品国产| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品久久久久久精品电影 | 男女床上黄色一级片免费看| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美黄色淫秽网站| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜福利免费观看在线| 午夜成年电影在线免费观看| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲黑人精品在线| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产男靠女视频免费网站| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲国产精品成人综合色| 在线播放国产精品三级| 日韩欧美国产一区二区入口| 日韩高清综合在线| 国产亚洲精品一区二区www| 国产xxxxx性猛交| 啪啪无遮挡十八禁网站| 看片在线看免费视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 9191精品国产免费久久| 久久亚洲精品不卡| 精品熟女少妇八av免费久了| 岛国在线观看网站| 国产三级黄色录像| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲中文字幕日韩| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 电影成人av| 最新美女视频免费是黄的| 日韩免费av在线播放| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产成人系列免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲午夜理论影院| 1024香蕉在线观看| 国产单亲对白刺激| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲av电影在线进入| 国产精品久久电影中文字幕| 91字幕亚洲| 最近最新中文字幕大全免费视频| 我的亚洲天堂| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 亚洲人成电影免费在线| av免费在线观看网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 午夜成年电影在线免费观看| 日本五十路高清| 亚洲五月天丁香| 窝窝影院91人妻| 美女午夜性视频免费| 香蕉国产在线看| 精品久久久精品久久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 操美女的视频在线观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久久大精品| 级片在线观看| 丁香欧美五月| 99在线视频只有这里精品首页| 一本综合久久免费| 长腿黑丝高跟| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日日爽夜夜爽网站| 日本欧美视频一区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产免费男女视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人国产一区最新在线观看| 十八禁人妻一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| 在线av久久热| 老汉色∧v一级毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产色视频综合| 韩国av一区二区三区四区| 在线永久观看黄色视频| 99精品久久久久人妻精品| 欧美激情久久久久久爽电影 | 香蕉久久夜色| 国产黄a三级三级三级人| 大码成人一级视频| 91字幕亚洲| 色精品久久人妻99蜜桃| 不卡av一区二区三区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 91字幕亚洲| 久久精品91无色码中文字幕| 99国产精品99久久久久| 十八禁网站免费在线| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产成人欧美| a在线观看视频网站| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲第一青青草原| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久人人精品亚洲av| 桃红色精品国产亚洲av| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利免费观看在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 亚洲在线自拍视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 国产精品精品国产色婷婷| 久久久久久久久免费视频了| 丰满的人妻完整版| 亚洲精品国产一区二区精华液| 18禁观看日本| 久久久国产成人免费| 成人国产综合亚洲| 国产伦人伦偷精品视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 久久亚洲精品不卡| 91麻豆av在线| 91成人精品电影| 久久午夜亚洲精品久久| 麻豆成人av在线观看| 99国产综合亚洲精品| 午夜免费鲁丝| 国产91精品成人一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 老司机靠b影院| 久久久久久久久久久久大奶| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 天堂影院成人在线观看| 国产在线观看jvid| e午夜精品久久久久久久| 妹子高潮喷水视频| 在线观看午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产av精品麻豆| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 精品久久蜜臀av无| 国产野战对白在线观看| 性少妇av在线| 老司机靠b影院| 在线观看午夜福利视频| 亚洲专区国产一区二区| 狠狠狠狠99中文字幕| 99国产精品99久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 两个人看的免费小视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美黄色淫秽网站| 国产野战对白在线观看| 性少妇av在线| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品久久视频播放| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 亚洲色图av天堂| 天天添夜夜摸| 热re99久久国产66热| 日韩欧美三级三区| 九色国产91popny在线| 国产主播在线观看一区二区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 美女 人体艺术 gogo| 久热爱精品视频在线9| 亚洲七黄色美女视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 国产一区二区激情短视频| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 少妇被粗大的猛进出69影院| 午夜久久久在线观看| 91成人精品电影| 国产国语露脸激情在线看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美中文日本在线观看视频| 午夜福利18| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产精品 国内视频| 757午夜福利合集在线观看| 丝袜美腿诱惑在线| 一本大道久久a久久精品| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲国产高清在线一区二区三 | 国产成人av教育| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 又大又爽又粗| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 午夜免费激情av| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 1024视频免费在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 制服丝袜大香蕉在线| 色综合婷婷激情| 国产三级黄色录像| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美日本视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 一本综合久久免费| 51午夜福利影视在线观看| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产成人精品久久二区二区免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 咕卡用的链子| 叶爱在线成人免费视频播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲专区中文字幕在线| 热99re8久久精品国产| 亚洲 国产 在线| 亚洲人成电影免费在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| aaaaa片日本免费| 97碰自拍视频| 桃色一区二区三区在线观看| 美女大奶头视频| 欧美中文日本在线观看视频| 99re在线观看精品视频| √禁漫天堂资源中文www| 国产不卡一卡二| 国产亚洲欧美精品永久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 中文字幕人妻熟女乱码| 韩国精品一区二区三区| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品影院久久| 在线av久久热| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日韩欧美在线二视频| 国产高清激情床上av| √禁漫天堂资源中文www| 日韩欧美一区视频在线观看| 午夜久久久久精精品| 一进一出好大好爽视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 黄色视频不卡| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 两个人视频免费观看高清| 日韩精品中文字幕看吧| 国产精品 国内视频| 久久国产精品影院| 久久午夜亚洲精品久久| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 最新在线观看一区二区三区| 欧美在线黄色| svipshipincom国产片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 久久香蕉国产精品| 男男h啪啪无遮挡| 久久久精品欧美日韩精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美激情高清一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品av久久久久免费| 真人做人爱边吃奶动态| 88av欧美| 中出人妻视频一区二区| 乱人伦中国视频| 国产精品久久视频播放| 色综合婷婷激情| 黄片小视频在线播放| 91麻豆av在线| 神马国产精品三级电影在线观看 | 成人三级黄色视频| 午夜老司机福利片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 视频区欧美日本亚洲| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久热这里只有精品99| 日本一区二区免费在线视频| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 99国产精品免费福利视频| 午夜成年电影在线免费观看| 91成人精品电影| 热99re8久久精品国产| 麻豆久久精品国产亚洲av| 这个男人来自地球电影免费观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 美女高潮到喷水免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产色视频综合| 女性被躁到高潮视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产人伦9x9x在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 免费在线观看黄色视频的| 国产视频一区二区在线看| 日本a在线网址| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲成人国产一区在线观看| 校园春色视频在线观看| 国产精品影院久久| 久久亚洲真实| 色播在线永久视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产激情久久老熟女| 人人妻人人澡欧美一区二区 | 动漫黄色视频在线观看| 国产成人精品无人区| 无限看片的www在线观看| 国产一区二区激情短视频| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲精品在线美女| 夜夜爽天天搞| 不卡av一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 脱女人内裤的视频| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美精品亚洲一区二区| 制服诱惑二区| 999精品在线视频| 禁无遮挡网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美乱色亚洲激情| 90打野战视频偷拍视频| 免费在线观看日本一区| 宅男免费午夜| www.熟女人妻精品国产| 久热这里只有精品99| 狂野欧美激情性xxxx| 97碰自拍视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲全国av大片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 热re99久久国产66热| 欧美成人性av电影在线观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产xxxxx性猛交| xxx96com| 国产精品av久久久久免费| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美日韩一级在线毛片| 美女午夜性视频免费| 9色porny在线观看| 国产av精品麻豆| 国产精品1区2区在线观看.| 久久香蕉激情| 国产在线观看jvid| 亚洲情色 制服丝袜| 久久久久久久午夜电影| 亚洲av五月六月丁香网| 69精品国产乱码久久久| 国产xxxxx性猛交| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久中文字幕一级| 亚洲成人免费电影在线观看| 欧美色欧美亚洲另类二区 | 老司机午夜福利在线观看视频| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲午夜理论影院| 中国美女看黄片| 亚洲 国产 在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品粉嫩美女一区| 美女国产高潮福利片在线看| 69精品国产乱码久久久| 99re在线观看精品视频| 国产99久久九九免费精品| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产精品1区2区在线观看.| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 嫩草影院精品99| 麻豆成人av在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 婷婷六月久久综合丁香| 一区二区三区国产精品乱码| a级毛片在线看网站| 亚洲全国av大片| www.精华液| 天堂动漫精品| 少妇熟女aⅴ在线视频| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 久久人妻av系列| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲电影在线观看av| 性少妇av在线| 在线免费观看的www视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲人成电影观看| 日本五十路高清| 国产精品一区二区在线不卡| 久久中文字幕一级| 999久久久精品免费观看国产| 在线av久久热| 91精品三级在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产又爽黄色视频| 窝窝影院91人妻| 亚洲黑人精品在线| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲中文av在线| 国产乱人伦免费视频| 99久久国产精品久久久| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线观看舔阴道视频| 一区二区三区精品91| 精品久久久久久,| 欧美一级a爱片免费观看看 | 日本五十路高清| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 免费高清在线观看日韩| 757午夜福利合集在线观看| 一级片免费观看大全| 国产精品亚洲一级av第二区| 香蕉国产在线看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 很黄的视频免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜福利欧美成人| 午夜久久久在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 级片在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 99国产极品粉嫩在线观看| 中文字幕色久视频| 国产真人三级小视频在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 男女下面进入的视频免费午夜 | 久久性视频一级片| 激情视频va一区二区三区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品中文字幕在线视频| tocl精华| 国产男靠女视频免费网站| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 色综合亚洲欧美另类图片| 我的亚洲天堂| 亚洲无线在线观看| 一本大道久久a久久精品| 国产精品 国内视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 精品无人区乱码1区二区| 午夜福利18| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 啦啦啦免费观看视频1| svipshipincom国产片| 在线免费观看的www视频| 久久青草综合色| 久久中文字幕人妻熟女| 色婷婷久久久亚洲欧美| 男人的好看免费观看在线视频 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一级毛片精品| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日韩精品中文字幕看吧| 禁无遮挡网站| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜福利一区二区在线看| 怎么达到女性高潮| 精品国产乱码久久久久久男人| 一级a爱视频在线免费观看| 69精品国产乱码久久久| 亚洲美女黄片视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| www.999成人在线观看| 一本综合久久免费|