一株放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物分離鑒定研究

薛長艷，李建宋，郝之奎，奚逢源

論著

一株放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物分離鑒定研究

薛長艷，李建宋，郝之奎，奚逢源

對(duì)放線菌NEAU-Jh3-20 菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定。

發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂HP-20 吸附洗脫、正相硅膠和凝膠 Sephadex LH-20 層析、制備型和半制備型高效液相色譜分離純化，然后運(yùn)用核磁共振、高分辨質(zhì)譜等對(duì)單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

從放線菌NEAU-Jh3-20 菌株發(fā)酵液提取物中獲得 5 個(gè)代謝產(chǎn)物，均為戊二酰亞胺類化合物，除化合物1為新化合物外，其余均為已知化合物，分別鑒定命名為：(5,9,11)-8,10-二甲基-3-(2-氨基-2-氧乙基)-7-十三氧代-5,9,11-三烯酸（1），()-4-[5-甲基-7-(3-甲基環(huán)氧乙烷-2-基)-2-羥基-4-氧代辛-6-烯-1-基]呱啶-2,6-二酮（2），2-{2-[(3,5)-3,5-二甲基-7-羥基-2-氧代辛-3,5-二烯-1-基]-6-氧代四氫-2-吡喃-4-基}乙酰胺（3），3-(4-羥芐基)六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮（4），3-(6-甲基-1-羥基)-庚基-5-(羥甲基)二氫呋喃-2(3)-酮（5），5 個(gè)化合物均為首次從該菌中分離得到。

本研究豐富了微生物化合物多樣性，同時(shí)為其他放線菌產(chǎn)活性物質(zhì)的研究與發(fā)掘提供了參考與理論基礎(chǔ)。

NEAU-Jh3-20； 次級(jí)代謝產(chǎn)物； 結(jié)構(gòu)鑒定

由于抗生素的濫用以及抗藥性菌株的不斷出現(xiàn)，以及臨床上使用的抗癌藥及抗生素 60% ~ 70% 均出自或來源于其前體天然產(chǎn)物[1-2]，使得人們一直致力于發(fā)掘?qū)ふ倚滦突钚晕镔|(zhì)，而放線菌是公認(rèn)的產(chǎn)生活性物質(zhì)微生物中最大的類群，也是研究較多的一類。但由于研究手段和方法的限制，分離到的放線菌僅占所有放線菌的 10%[3]，其中產(chǎn)生生物活性物質(zhì)尤其是抗生素的鏈霉菌占了眾多放線菌的一半[4]，然而不同菌株在所產(chǎn)化合物上有所差異。一直以來從海洋放線菌中發(fā)現(xiàn)具有結(jié)構(gòu)新穎的化合物屢見不鮮[5]。因此，本文對(duì)鏈霉菌進(jìn)行發(fā)酵，對(duì)其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定歸納研究，豐富了微生物化合物多樣性，同時(shí)為其他放線菌產(chǎn)活性物質(zhì)的研究與發(fā)掘提供了參考與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 YJ-875 型超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備廠；37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱購自德國 BinDer 公司；搖床購自美國 New Brunswick Scientific 公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱購自德國 Binder 公司；pH 計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；薄層層析硅膠板購自煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所；YB102 電子天平購自上海?？惦娮觾x器廠；Diaion HP-20 樹脂購自日本三菱公司；Sephadex LH-20 購自 GE Healthcare 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自日本 Eyela 公司；半制備型液相色譜儀（Zorbax SB-C18，5 μm，250 mm × 9.4 mm）購自美國 Agilent 公司；制備型液相色譜儀（LC-8A，C18，5 μm，250 mm × 20 mm）購自日本 Shimadzu 公司；DRX-400 超導(dǎo)核磁共振儀購自德國 Bruker 公司；色譜用試劑購自美國 Fisher 公司；其他試劑為市售分析純。

1.1.2 菌株 實(shí)驗(yàn)菌株為鏈霉菌屬NEAU-Jh3-20，分離自吉林省河流淤泥，16s rRNA 基因序列在 GenBank 中登記號(hào)為：KM000839。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 按接種量5%（v/v），將培養(yǎng)24 ~ 48 h 的種子培養(yǎng)基（酵母粉 0.4%、麥芽提取物 1.0%、葡萄糖 0.4%、可溶性淀粉 2.0%、ISP3/ISP4 微液 1.0 ml/L、CaCO30.2%，pH 7.2 ~ 7.4）接種到 20 L 搖瓶發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基（可溶性淀粉 2%，棉籽餅粉 1%，酵母粉 0.5%，麥芽糊精 2.0%、麥芽提取物 0.5%、CaCO30.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、NaCl 0.2%，pH 7.0 ~ 7.2），裝量為 250 ml/L 搖瓶，28 ℃，250 r/min 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 7 d。

1.2.2 分離與提取 將發(fā)酵后的 20 L 發(fā)酵液通過真空抽濾，使得菌絲體和上清液分離，分開后的菌體用去離子水（3 L）沖洗，再用乙醇（3 L）室溫?cái)嚢杞?12 h 后離心，取上清。將 HP-20 樹脂裝入樹脂柱（規(guī)格為 8 cm × 120 cm，裝量為 1 L），上清液加入到 HP-20 樹脂柱進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附 2 次，吸附后用 5 L 去離子水去除樹脂上多余糖分，乙醇（6 L）洗脫樹脂，得到乙醇洗脫液。浸提液和乙醇洗脫液分別在 55 ℃下濃縮至干，取濃縮樣品少量溶解，TLC 薄層層析，結(jié)果顯示兩份樣品主點(diǎn)大體一致，因此將兩份濃縮樣混合在一起，經(jīng)硅膠（100 ~ 200 目）柱層析，以氯仿/甲醇（= 100:0/50:50，v/v）梯度洗脫，TLC 薄層層析檢測，將相似流份合并濃縮后，進(jìn)行 LH-20 凝膠柱層析（直徑5.2 cm，柱高 120 cm），以甲醇/氯仿（1:1，v/v）進(jìn)行洗脫，經(jīng) TLC 薄層層析檢測，再濃縮，樣品通過制備型高效液相、半制備型高效液相反向色譜進(jìn)行化合物分離純化。

1.2.3 結(jié)構(gòu)鑒定 運(yùn)用核磁共振和高分辨質(zhì)譜（HRESIMS）、旋光、紅外光譜（IR）和紫外光譜（UV）等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對(duì)得到單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。對(duì)于簡單常見化合物，與已知類似化合物的1H-NMR 數(shù)據(jù)圖譜對(duì)比，質(zhì)譜分析便可初步推斷該化合物結(jié)構(gòu)、分子式等。不常見圖譜結(jié)構(gòu)，通過核磁共振進(jìn)行DEPT135、1H-1H COSY、HSQC、HMBC、NOESY 信號(hào)掃描、全譜分析，結(jié)合高分辨質(zhì)譜 MS、旋光度、IR 和 UV 對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，推斷其分子量及分子式，繼而確定化合物結(jié)構(gòu)，SciFinder Scholar 檢索，以確定化合物是否為新化合物。

2 結(jié)果

2.1 次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化

從放線菌NEAU-Jh3-20 中共分離得到 5 個(gè)化合物（圖 1），其中化合物1經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定確定為新化合物，表 1 為化合物分離制備條件。

2.2 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1的1H-NMR（400 MHz，CDCl3）譜給出 5 個(gè)烯族質(zhì)子信號(hào)[H5.22（1H，d，=9.7 Hz）、H5.55 m，H5.83（1H，d，= 11.7 Hz），H6.26（1H，d，= 15.56 Hz），H6.84 m]；1 個(gè)烯甲基質(zhì)子信號(hào)[H1.87（3H，s）]；2 個(gè)脂肪族雙峰甲基信號(hào)[H1.20（3H，d，= 6.8 Hz），H1.773H，d，=1.5 Hz）]。13C-NMR 和 DEPT135 譜給出了 17 個(gè)碳信號(hào)，它們分別為 1 個(gè)羰基碳信號(hào)（C200.1），2 個(gè)酰胺羰基碳信號(hào)（C175.4，175.9），5 個(gè)2次甲基碳信號(hào)（C125.1，128.5，130.6，133.0，143.6），1 個(gè)2季碳信號(hào)（C135.1），3 個(gè)亞甲基碳信號(hào)（C37.1，38.2，39.6），3 個(gè)甲基碳信號(hào)（C14.7，16.4，17.2）。

圖 1 化合物1 ~ 5 結(jié)構(gòu)

Figure 1 Structure of compounds 1-5

表 1 化合物1 ~ 5的 HPLC 分離條件

圖 2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY 和HMBC 相關(guān)譜圖

Figure 2 The key1H-1H COSY and HMBC spectrum of compound 1

化合物1通過在 H-3/H2-4/H-5，H-9/H-8/H3-14，H-11/H-12/H3-13 的1H-1H COSY 相關(guān)性證明了 C-3 到 C-5，C-9 到 C-14，和 C-11 到 C-13 三個(gè)結(jié)構(gòu)單元，從 H-5，H-9 到 C-7，從 H3-14 到 C-7，C-8，C-9，從 H3-15 到 C-9，C-10，C-11 的 HMBC 信號(hào)可以確定 C-3-C-13 的信號(hào)連接（圖 2）。兩個(gè)酰胺羰基碳（C175.4，C175.9）和四個(gè)質(zhì)子對(duì)亞甲基信號(hào)H2.33（1H，m），2.34（1H，m），2.42（1H，m），2.46（1H，m）存在HMBC 信號(hào)，同時(shí)，這四個(gè)質(zhì)子對(duì)亞甲基信號(hào)H2.33（1H，m），2.34（1H，m），2.42（1H，m），2.46（1H，m）和H2.33（1H，m）存在1H-1H COSY 信號(hào)。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)6.84（1H，m）；6.26（1H，d，= 15.56 Hz）；5.83（1H，d，= 11.7 Hz）；5.55（1H，m）；5.22（1H，d，=9.7 Hz）；3.60（1H，m）；2.55（1H，d，= 5.7 Hz）；2.46（1H，m）；2.42（1H，m）；2.34（1H，m）；2.33（3H，m）；1.87（3H，s）；1.77（3H，d，=1.5 Hz）；1.20（3H，d，= 6.8 Hz）。

13C-NMR（100 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)200.1（C-7）；175.9（C-2'）；175.4（C-1）；143.6（C-5）；135.1（C-10）；133.0（C-9）；130.6（C-6）；128.5（C-11）；125.1（C-12）；45.0（C-8）；39.6（C-2）；38.2（C-1'）；37.1（C-4）；32.0（C-3）；17.2（C-15）；16.4（C-14）；14.7（C-13）。

綜上數(shù)據(jù)，同時(shí)參考相似化合物[6]核磁數(shù)據(jù)解析出化合物1的結(jié)構(gòu)，通過 SciFinder 檢索，未發(fā)現(xiàn)該化合物的相關(guān)報(bào)道，表明這是一個(gè)新的戊二酰亞胺類化合物，依據(jù)系統(tǒng)命名法命名為：(5,9, 11)-8,10-二甲基-3-(2-氨基-2-氧乙基)-7-十三氧代-5,9,11-三烯酸。

2.2.2 化合物2 分子式 C17H25NO5，淺黃色油狀物質(zhì)；ESI-MS322.12 [M-H]-，分子量為 323。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)5.29（1H，dm，= 9.8，1.3 Hz）；4.09（1H，m）；3.42（1H，dq，= 9.8，6.8 Hz）；3.35（1H，dd，= 4.2，1.3 Hz）；3.19（1H，dq，= 4.2，5.3 Hz）；2.76（2H，m）；2.54（2H，d，= 5.3 Hz）；2.48（1H，m）；2.31（2H，m）；1.74（3H，dd，= 1.3 Hz）；1.58（1H，ddd，= 13.9，10.5，4.8 Hz）；1.30（1H，ddd，= 13.9，8.7，2.6 Hz）；1.18（3H，d，= 6.8 Hz）；1.12（3H，d，= 5.3 Hz）。

根據(jù)1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜解析出化合物2的結(jié)構(gòu)，通過 SciFinder Scholar 檢索，與文獻(xiàn)[7]中化合物進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，確定化合物2為已知的戊二酰亞胺類化合物：()-4-[5-甲基-7-(3-甲基環(huán)氧乙烷-2-基)-2-羥基-4-氧代辛-6-烯-1-基]呱啶-2,6-二酮。

2.2.3 化合物3 分子式 C17H25NO5，為無色油狀物質(zhì)；ESI-MS322 [M-H]-，分子量為 323。

1H-NMR（400 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)6.94（1H，d，= 10.0 Hz）；5.66（1H，d，= 7.8 Hz）；4.62（1H，m）；4.48（1H，d，= 6.3，5.1 Hz）；3.18（1H，dd，= 18.0，6.5 Hz）；2.88（1H，dd，= 18.0，5.6 Hz）；2.67（1H，dd，= 16.0，6.0 Hz）；2.61（1H，m）；2.34（2H，d，= 7.1 Hz）；2.33（1H，dd，= 16.0，8.0 Hz）；1.82（2H，t，= 6.7 Hz）；1.69（3H，s）；1.64（3H，s）；1.57（3H，s）。根據(jù)1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜解析出化合物的結(jié)構(gòu)，通過 SciFinder Scholar 檢索發(fā)現(xiàn)為已知的戊二酰亞胺類化合物：2-{2-[(3,5)-3,5-二甲基-7-羥基-2-氧代辛-3,5-二烯-1-基]-6-氧代四氫-2-吡喃-4-基}乙酰胺，且與文獻(xiàn)[6，8]中化合物相似。

2.2.4 化合物4 分子式 C14H16N2O3，無色無定型固體；ESI-MS261[M+H]+，分子量為 260。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)7.08（1H，s）；7.06（1H，s）；6.74（1H，s）；6.72（1H，s）；6.11（1H，s）；4.22（1H，dd，= 2.9，9.6 Hz）；4.08（1H，m）；3.57（2H，m）；3.42（2H，dd，= 11.0，14.0 Hz）；2.32（1H，m）；1.96（1H，m）；1.85（2H，m）；根據(jù)1H-NMR 和 ESI-MS 圖譜，推導(dǎo)出化合物4的結(jié)構(gòu)，通過 SciFinder Scholar 檢索，發(fā)現(xiàn)化合物4與文獻(xiàn)[9]中化合物核磁數(shù)據(jù)基本一致，為環(huán)二肽類化合物：3-(4-羥芐基)六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮。

2.2.5 化合物5 分子式 C13H24O4，淡黃色油狀物質(zhì)；ESI-MS m/z 243 [M-H]-，分子量 244。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）數(shù)據(jù)δ 4.62（1H，m）；4.06（1H，m）；3.83（1H，dd，= 1.5，7 Hz）；3.55（1H，dd，= 2.5，7 Hz）；2.78（1H，dd，= 2.6，8 Hz）；2.35（1H，dd，= 8，12.8 Hz）；2.05（1H，dd，= 4，10 Hz）；1.05-1.55（9H，m）；0.81（6H，d，= 7.2 Hz）。

根據(jù)以上核磁數(shù)據(jù)解析確定出化合物5的結(jié)構(gòu)，通過 SciFinder Scholar 檢索，與文獻(xiàn)[10]中丁內(nèi)酯數(shù)據(jù)基本一致，為丁烷內(nèi)酯類化合物：3-(6-甲基-1-羥基)-庚基-5-(羥甲基)二氫呋喃-2(3)-酮。

3 討論

從海洋微生物中獲取結(jié)構(gòu)新穎的抗腫瘤天然產(chǎn)物是學(xué)者們研究的熱點(diǎn)，也是亟需解決的任務(wù)，而被冠以豐富資源庫的海洋放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物又是“藥物先導(dǎo)化合物”的重要來源[11]，因此本研究對(duì)分離自河流淤泥的鏈霉菌NEAU-Jh3-20 菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，分離得到 5 個(gè)化合物，主要為酰胺類化合物，化合物1為新化合物。據(jù)文獻(xiàn)記載該類化合物因其具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎癥等多種生物活性而被廣泛研究[12-14]。本文為以放線菌為研究前提，探索開發(fā)活性天然化合物及商業(yè)用藥提供了參考意義，具有巨大潛在研究價(jià)值和開發(fā)前景。

[1] Van Lanen SG, Shen B. Microbial genomics for the improvement of natural productdiscovery. Curr Opin Microbiol, 2006, 9(3):252-260.

[2] Challis GL. Mining microbial genomes for new natural products and biosynthetic pathways. Microbiology, 2008, 154(6):1555-1569.

[3] Zhang JZ, Huang JJ, Sheng ZD, et al. Microbial taxonomy. Shanghai: Fudan University Press, 1985:214-218. (in Chinese)

張紀(jì)忠, 黃靜娟, 盛宗斗, 等. 微生物分類學(xué). 上海: 復(fù)旦大學(xué)出版社, 1985:214-218.

[4] McKenzie NL, Thaker M, Koteva K, et al. Induction of antimicrobial activities in heterologous streptomycetes using alleles of the Streptomyces coelicolor gene absA1. J Antibiot (Tokyo), 2010, 63(4): 177-182.

[5] Jiang LX, Wu Y, Chen JH, et al. Identification of six Actinomycetes strains isolated from mangrove rhizosphere soil and determination of their activity. J Pathogen Biol, 2017, 12(6):513-518. (in Chinese)

蔣蓮秀, 吳越, 陳建宏, 等. 6株紅樹林根際土壤放線菌的分離鑒定及活性測定. 中國病原生物學(xué)雜志, 2017, 12(6):513-518.

[6] Zhao XL, Wang H, Xue ZL, et al. Two new glutarimide antibiotics from Streptomyces sp. HS-NF-780. J Antibiot (Tokyo), 2019, 72(4): 241-245.

[7] Otani T, Sasaki T, Minami Y, et al. New glutarimide antibiotics, S-632-B1 and B2. I. Taxonomy of producing strain, fermentation and biological properties. J Antibiot (Tokyo), 1989, 42(5):647-653.

[8] Urakawa A, Otani T, Yoshida K, et al. Isolation, structure determination and biological activities of a novel antifungal antibiotic, S-632-C, closely related to glutarimide antibiotics. J Antibiot (Tokyo), 1993, 46(12):1827-1833.

[9] Pérez-Mellor A, Alata I, Lepère V, et al. Conformational study of the jet-cooled diketopiperazine peptide cyclo tyrosyl-prolyl. J Phys Chem B, 2019, 123(28):6023-6033.

[10] Pathirana C, Dwight R, Jensen PR, et al. Structure and synthesis of anew butanolide from a marine actinomycete. Tetrahedron Lett, 1991, 32(48):7001-7004.

[11] Marris E. Marine natural products: drugs from the deep. Nature, 2006, 443(7114):904-905.

[12] Cheng C, Liu Q, Chen L, et al. Isolation, structure determination and biological activity of a new glutarimide antibiotic, S632A3. J Asian Nat Prod Res, 2006, 8(1-2):55-60.

[13] Deng H, Zhang N, Wang Y, et al. S632A3, a new glutarimideantibiotic, suppresses lipopolysaccharide-induced pro-inflammatory responses via inhibiting the activation of glycogen synthase kinase 3β. Exp Cell Res, 2012, 318(20):2592-2603.

[14] Wang HP, Lou J, Chen LC, et al. Cyclodipeptides from Bacillus sp. HZ16. Nat Product Res Dev, 2017, 29(5):783-786. (in Chinese)

王宏鵬, 樓堅(jiān), 陳麗春, 等. 芽孢桿菌HZ16發(fā)酵產(chǎn)物中的環(huán)二肽類化學(xué)成分. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2017, 29(5):783-786.

Isolation and identification of secondary metabolites from a strain of

XUE Chang-yan, LI Jian-song, HAO Zhi-kui, XI Feng-yuan

To isolate and identify secondary metabolites fromNEAU-Jh3-20.

The fermentation liquid was separated and purified by HP-20 resin adsorption, normal silica gel and Sephadex LH-20 chromatography, preparative and semi-preparative HPLC. The structures of monomer compounds were identified by modern instrumental spectral analysis techniques such as NMR and HRMS.

Five compounds were extracted from the fermentation broth ofNEAU-Jh3-20, among them compound 1 was identified as a new compound. All compounds were identified separately as follows: (5,9,11)-3-(2-amino- 2-oxoethyl)-8,10-dimethyl-7-oxotrideca-5,9,11-trienoic acid (1), ()-4-[2-hydroxy-5-methyl-7-(3-methyloxiran-2-yl)-4-oxooct-6- en-1-yl]piperidine-2,6-dione (2), 2-{2-[(3,5)-7-hydroxy-3,5-dimethyl-2-oxoocta-3,5-dien-1-yl]-6-oxotetrahydro-2H-pyran-4-yl} acetamide (3), 3-(4-hydroxybenzyl)hexahydropyrrolo(1,2-a)pyrazine-1,4-dione (4), 3-(1-hydroxy-6-methylheptyl)-5-(hydroxymethyl) dihydrofuran-2(3H)-one (5).

This study enriched the diversity of microbial compounds and provided references for the research and excavation of active substances produced by other actinomycetes.

NEAU-Jh3-20; Second metabolites; Structure identification

XUE Chang-yan, Email: xcydawn@163.com

Author Affiliations: Biotechnology Research Institute, Taizhou Vocational & Technical College, Zhejiang 318000, China (XUE Chang-yan, LI Jian-song, HAO Zhi-kui); Taizhou Technician College, Zhejiang 318000, China (XI Feng-yuan)

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.06.006

浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃（LGG18E020003）；臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（1801gy24）；臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院校級(jí)課題（2019YB05）；臺(tái)州技師學(xué)院（籌）（2018TJXZ01）

318000 浙江，臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所（薛長艷、李建宋、郝之奎）；318000 浙江，臺(tái)州技師學(xué)院（奚逢源）

薛長艷，Email：xcydawn@163.com

2019-09-04