Sigma-1受體在小鼠肝缺血再灌注損傷中的表達和作用

沈昀泰，陳德喜，臧 英，關 鴿，劉 歡，臧運金

肝缺血再灌注損傷是肝部分切除及肝移植等肝膽外科手術中常見的并發(fā)癥[1]。尤其是在肝移植中，肝缺血再灌注損傷可造成已移植肝功能障礙，肝功能恢復時間延遲，甚至引起肝衰竭[2]。已有研究證實凋亡、氧化應激和炎癥反應等與肝缺血再灌注損傷密切相關[3-6]。Sigma-1受體是分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白，其分子量約為25 KD[7]，在氧化應激、炎癥反應等多種生理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[8-10]，并且在肝組織中有較高的表達[11-12]。本研究通過構(gòu)建小鼠肝缺血再灌注模型，研究Sigma-1受體在肝缺血再灌注損傷中表達變化，同時采用Sigma-1受體激動劑和抑制劑預處理小鼠，探討Sigma-1受體表達變化與肝缺血再灌注中炎癥反應的關系，進一步闡明Sigma-1受體在小鼠肝缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J小鼠40只，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，體重18～22 g[SCXK(京)2016-0006]；Trizol(美國Introvigen公司)；RIPA裂解液(北京索萊寶科技有限公司)；蛋白定量試劑盒(上海碧云天生物技術研究所)；Sigma-1受體激動劑4-苯基-1-(4-苯丁基)哌啶[4-phenyl-1-(4-phenylbutyl) piperidine，PPBP](美國Sigma-Aldrich公司)和Sigma-1受體抑制劑NE-100(英國Tocris Bioscience公司)；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(日本TaKaRa公司)；Sigma-1受體抗體和β-actin抗體(美國Cell Signaling公司)；山羊抗兔抗體(武漢博士德公司)；肝組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素(interleukin，IL)-6和IL-10 ELISA檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；正置生物顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 為檢測肝缺血再灌注后小鼠肝組織中Sigma-1受體表達水平變化，將20只C57BL/6J小鼠隨機分組如下：①對照組；②肝缺血再灌注組：肝缺血1 h再灌注6 h、再灌注12 h、再灌注24 h組；每組5只小鼠。為進一步研究Sigma-1受體在小鼠肝缺血再灌注損傷中作用，將20只小鼠隨機分組如下:①對照組；②肝缺血再灌注組；③Sigma-1受體激動劑組；④Sigma-1受體激動劑加抑制劑組；每組5只小鼠。

1.2.2 小鼠肝缺血再灌注模型構(gòu)建 10%水合氯醛麻醉C57BL/6J小鼠，固定后腹部備皮、鋪巾，經(jīng)腹部正中切口，逐層切開腹壁。充分顯露肝左葉及肝中葉，顯微血管夾夾閉肝動脈及門靜脈，造成70%的肝臟缺血。臨時阻斷血流1 h后取下顯微血管夾，再灌注時間分別為6、12和24 h。Sigma-1受體激動劑組小鼠于建立模型前1 h以1 mg/kg的劑量腹腔注射PPBP溶液，Sigma-1受體激動劑加抑制劑組小鼠于建立肝缺血再灌注模型前3 h以1 mg/kg的劑量腹腔注射NE-100溶液，建立模型前2 h以1 mg/kg的劑量腹腔注射PPBP溶液，再于建立模型前1 h以1 mg/kg的劑量腹腔注射PPBP溶液。對照組和缺血再灌注組小鼠注射等體積生理鹽水。對照組僅進行開腹、暴露肝門及關腹操作，不夾閉血管。

1.2.3 收集標本 收集小鼠血標本，分離獲得血清，用于檢測小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)和細胞因子水平。收集小鼠肝組織，剪為小塊分裝保存-80 ℃冰箱用于提取RNA及蛋白質(zhì)或浸泡于4%多聚甲醛溶液固定，用于觀察肝組織病理學變化。

1.2.4 qRT-PCR 采用Trizol提取小鼠肝組織的RNA，分光光度計檢測RNA純度和濃度，RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行qRT-PCR。所用引物序列如表1。

表1 qRT-PCR引物

1.2.5 Western Blot RIPA裂解液提取小鼠肝組織總蛋白，98 ℃加熱10 min使蛋白變性；BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度；經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，室溫TBST液洗膜3次后，加入Sigma-1受體抗體和β-actin抗體后4 ℃搖床過夜；洗膜后加入相應的羊抗兔抗體室溫孵育1 h；經(jīng)ECL超敏發(fā)光液曝光并拍照。

1.2.6 血清ALT、AST水平檢測 取不同分組小鼠血清標本，經(jīng)全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST水平。

1.2.7 血清細胞因子檢測 根據(jù)ELISA試劑盒說明書，采用ELISA法檢測小鼠血清細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10水平。

1.2.8 觀察肝組織病理學變化 取各組小鼠適量肝組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜后進行石蠟包埋、切片、蘇木精-尹紅染色法染色。顯微鏡隨機選取5個高倍視野評估小鼠肝組織病理學變化情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝缺血再灌注后Sigma-1受體mRNA和蛋白表達變化 通過qRT-PCR法檢測Sigma-1受體在不同再灌注時間點的mRNA表達水平。結(jié)果顯示不同再灌注時間點的各組小鼠肝Sigma-1受體mRNA表達水平均比對照組高，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Sigma-1受體mRNA表達水平在再灌注12 h達到高峰，再灌注6、24 h Sigma-1受體mRNA表達水平均較再灌注12 h低(圖1A)。Western Blot實驗檢測Sigma-1受體在不同再灌注時間點的蛋白表達水平。結(jié)果顯示缺血再灌注組的小鼠肝組織Sigma-1受體蛋白表達水平在再灌注12 h達到高峰，缺血再灌注組Sigma-1受體蛋白表達水平均比對照組表達水平高(圖1B)。因此，選擇缺血1 h再灌注12 h作為后續(xù)構(gòu)建模型的時間點。

1.對照組；2.肝缺血再灌注6 h組；3.肝缺血再灌注12 h組；4.肝缺血再灌注24 h組圖1 小鼠肝缺血再灌注后Sigma-1受體mRNA和蛋白表達變化

2.2 Sigma-1受體激動劑和抑制劑預處理對小鼠肝功能損傷影響 對照組小鼠未見肝小葉結(jié)構(gòu)明顯異常，未發(fā)現(xiàn)明顯肝細胞壞死及炎癥細胞浸潤，血清ALT及AST水平較低。同缺血再灌注組比較，Sigma-1受體激動劑組血清ALT及AST水平明顯降低，差異比較具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Sigma-1受體激動劑組預處理后，可觀察到小鼠肝竇區(qū)變窄程度降低，炎癥細胞浸潤較少，肝細胞壞死程度降低。Sigma-1受體激動劑加抑制劑組小鼠血清ALT及AST水平高于Sigma-1受體激動劑組(P<0.05)。Sigma-1受體激動劑加抑制劑組肝組織損傷程度較Sigma-1受體激動劑組明顯加重(表2、圖2)。

表2 小鼠血清ALT、AST水平變化

圖2 小鼠肝組織病理學變化

2.3 Sigma-1受體激動劑和抑制劑預處理對小鼠肝組織細胞因子表達及血清細胞因子水平的影響 結(jié)果顯示經(jīng)Sigma-1受體激動劑PPBP預處理后，小鼠肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達水平低于缺血再灌注組，IL-10 mRNA表達水平高于缺血再灌注組(P<0.05)。激動劑組小鼠血清TNF-α、IL-6水平低于缺血再灌注組，血清IL-10水平高于缺血再灌注組(P<0.05)。Sigma-1受體激動劑加抑制劑組小鼠肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達水平高于Sigma-1受體激動劑組，IL-10 mRNA表達水平較Sigma-1受體激動劑組降低(P<0.05)。同Sigma-1受體激動劑組比較，Sigma-1受體激動劑加抑制劑組小鼠血清TNF-α、IL-6水平升高，IL-10水平降低(P<0.05)。圖3，表3。

1.對照組；2.肝缺血再灌注組；3.Sigma-1受體激動劑組；4.Sigma-1受體激動劑加抑制劑組圖3 小鼠肝組織細胞因子mRNA表達變化

表3 各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-10水平變化

3 討論

肝臟缺血再灌注損傷是肝部分切除、肝移植等肝膽外科手術中常見的組織器官損傷，是涉及氧化應激、凋亡、炎癥反應等多因素的復雜病理過程。近年來的研究表明促進Sigma-1受體活化可減輕多種缺血再灌注損傷，發(fā)揮良好的保護作用。Gao等[13]研究表明Sigma-1受體激動劑PRE-084可通過抑制細胞凋亡而減輕心臟缺血再灌注損傷。另有研究表明促進Sigma-1受體活化可增強eNOS活性進而增加NO含量，發(fā)揮腎保護作用[14]。Sigma-1受體激動劑PPBP可減少大鼠腦缺血時皮質(zhì)梗死體積，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。因此，Sigma-1受體是否參與肝缺血再灌注損傷，改變Sigma-1受體的表達是否能夠減輕肝缺血再灌注損傷，引起我們的關注。本研究發(fā)現(xiàn)Sigma-1受體表達量在缺血再灌注6 h開始升高，再灌注12 h Sigma-1受體表達升高最明顯，表明Sigma-1受體可能參與肝缺血再灌注損傷的發(fā)展。

為明確Sigma-1受體表達變化對肝缺血再灌注損傷的影響，分別通過Sigma-1受體特異性激動劑及抑制劑處理小鼠，觀察到促進Sigma-1受體活化后，肝組織TNF-α、IL-6 mRNA表達水平下降，IL-10 mRNA表達水平升高。血清TNF-α和IL-6水平下降，IL-10水平升高，血清ALT及AST水平降低，提示Sigma-1受體激動劑預處理可抑制炎癥反應而減輕肝功能損傷。研究表明Kuppfer細胞在肝缺血再灌注過程中激活后，可通過產(chǎn)生包括TNF-α、IL-6在內(nèi)的促炎細胞因子損傷肝組織[5]。IL-10是抑制炎癥反應的重要細胞因子，可有效抑制TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的產(chǎn)生[16]。在肝缺血再灌注中發(fā)現(xiàn)IL-10具有抑制炎癥反應、保護肝組織的作用。Dinant等[17]研究表明IL-10可以抑制IL-6的產(chǎn)生，并能促進肝細胞的增殖而減輕肝缺血再灌注損傷。Yoshidome等[18]研究發(fā)現(xiàn)IL-10可抑制TNF-α的表達抑制肝缺血再灌注損傷。Bourrie等[19]研究發(fā)現(xiàn)促進Sigma-1受體活化可抑制炎癥反應，增強IL-10的表達和產(chǎn)生，抑制TNF-α的表達和產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應。Bourrie等[20]利用Sigma-1受體激動劑SSR125329A預處理小鼠,可提高抑炎細胞因子IL-10并降低小鼠血清促炎細胞因子TNF-α的水平，發(fā)揮抗炎作用。因此，我們推斷Sigma-1受體活化后可能促進IL-10的表達和產(chǎn)生，IL-10可以抑制TNF-α、IL-6表達和產(chǎn)生，有效抑制炎癥反應，從而減輕肝損傷并改善肝功能。促進Sigma-1受體活化產(chǎn)生的保護作用可能與調(diào)節(jié)細胞因子表達和抑制炎癥反應相關。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠肝缺血再灌注模型中Sigma-1受體表達升高，提示Sigma-1受體可能在肝缺血再灌注損傷具有重要調(diào)節(jié)作用。通過Sigma-1受體激動劑預處理小鼠促進Sigma-1受體活化可降低炎癥反應，進一步降低肝缺血再灌注損傷。因此，研究新型Sigma-1受體激動劑，促進Sigma-1受體活化，有助于減輕肝缺血再灌注損傷，為防治肝缺血再灌注損傷提供新思路。本研究從炎癥反應的角度對Sigma-1受體活化可減輕肝缺血再灌注損傷進行初步研究，但對Sigma-1受體活化是調(diào)控哪些信號通路減輕肝缺血再灌注損傷并不清楚，需要進一步的研究。