循環(huán)腫瘤DNA在胃癌診斷中的臨床應(yīng)用

楊克西 陳衛(wèi)昌

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科(215008)

胃癌是全球第5大高發(fā)癌癥，亦是第3大癌癥死亡原因[1]。在中國，胃癌的發(fā)病率和死亡率均位列第2位，僅次于肺癌。胃癌的常規(guī)治療包括手術(shù)切除和輔助治療等。目前許多國家還未普及胃癌篩查，超過50%的患者早期癥狀不典型，診斷時已處于晚期，往往已有腹膜轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來，雖然早期胃癌檢出率有所提高，手術(shù)方法有所改進(jìn)，但患者生存率亦不理想。

當(dāng)前胃癌診治難點主要存在以下幾個方面：①早期難以發(fā)現(xiàn)；②組織活檢為有創(chuàng)檢查，難以反復(fù)獲取，且腫瘤內(nèi)有異質(zhì)性；③現(xiàn)有腫瘤標(biāo)志物敏感性和特異性不高；④個體差異較大；⑤受檢查手段(CT或MRI)限制不能實時對治療效果進(jìn)行檢測。研究者不斷探索更敏感的檢測手段來檢測胃癌的發(fā)生、發(fā)展，除通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究血清腫瘤標(biāo)志物外，目前還引入了循環(huán)腫瘤DNA的概念，液體活檢作為新興技術(shù)得到了蓬勃發(fā)展。液體活檢指通過以微創(chuàng)或非侵入性的方式獲得血液或其他體液的取樣來分析腫瘤(如細(xì)胞或核酸)，主要包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)、外泌體(exosome)、微 RNA(microRNA，miRNA)等的檢測。ctDNA作為液體活檢的生物學(xué)標(biāo)志物之一，與傳統(tǒng)診斷手段相比，具有諸多優(yōu)勢。本文就ctDNA在胃癌診斷中的臨床應(yīng)用作一綜述，旨在說明該指標(biāo)在診斷、指導(dǎo)、監(jiān)測治療、預(yù)后評估等方面的優(yōu)劣性。

一、ctDNA的生物學(xué)特性

Mandel等[2]于1948年首次描述了人類血液中無細(xì)胞核酸片段的存在。1977年Leon等[3]首次報道了癌癥患者血清ctDNA濃度升高。但此變化亦可見于其他生理或病理情況，如運動[4]和急性顱腦外傷[5]。1989年Stroun等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，癌癥患者部分血漿ctDNA來自于癌細(xì)胞。1991年Sidransky等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，來自浸潤性膀胱癌患者尿沉渣中的DNA攜帶p53基因突變。之后，與結(jié)直腸癌、胰腺癌或肺癌的突變相匹配的KRAS突變相繼在糞便或痰液中被發(fā)現(xiàn)。1994年首次發(fā)現(xiàn)在患者血漿無細(xì)胞DNA(cfDNA)中的KRAS突變序列，證實血漿中的突變DNA片段來源于腫瘤[8]。健康受試者的血液cfDNA水平為0～100 ng/mL，平均為30 ng/mL，而在癌癥患者中為0～1 000 ng/mL，平均為180 ng/mL[9]。在癌癥患者中，ctDNA只占cfDNA總量的一小部分，此比例取決于腫瘤負(fù)擔(dān)、癌癥分期、細(xì)胞代謝以及對治療的反應(yīng)[10]。據(jù)估計，患者的實體腫瘤重量每100 g(約3×1010個腫瘤細(xì)胞)將釋放3.3%的腫瘤DNA至循環(huán)[11]。除血液外，在多種體液中均可檢測到ctDNA，包括腹水、母乳、淋巴和腹膜液、骨髓抽吸液、尿液、前列腺液、腹腔灌洗液、痰液、腦脊液、胃液、膽汁和糞便[12]。

二、ctDNA的分析方法

從理論上講，所有可檢測基因組信息的手段均可檢測ctDNA，但腫瘤患者血液中ctDNA含量極低，不易檢測，因此需敏感性和特異性均較高的檢測方法。對于已知致癌突變位點的檢測，一般采用數(shù)字PCR(digital PCR, dPCR)、微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、BEAMing技術(shù)(beads， emulsion， amplification， magnetics)等。而下一代測序(next generation sequencing, NGS)技術(shù)因其通量和智能程度高，可在短時間內(nèi)完成對上百億堿基對的測序，顯著提高了ctDNA的檢測水平。同時，正在發(fā)展的還有“第3代”全基因組測序技術(shù)，其在癌癥患者精準(zhǔn)管理中有良好的應(yīng)用前景。

三、ctDNA在胃癌中的應(yīng)用

1. 診斷：目前，ctDNA檢測為胃癌的診斷提供了新思路。多項研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者和健康人群血漿ctDNA水平存在顯著差異。Kim等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血漿cfDNA水平高于健康人群，且晚期(Ⅲ期/Ⅳ期)患者血漿cfDNA 水平顯著高于早期胃癌患者。Park等[14]對54例胃癌患者血漿cfDNA水平進(jìn)行研究，結(jié)果顯示胃癌患者較同年齡健康對照者升高2.4倍。

與其他血清腫瘤標(biāo)志物相比，ctDNA在診斷方面亦顯示出獨有優(yōu)勢。Sun等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，SEPT9對結(jié)直腸癌診斷和復(fù)發(fā)監(jiān)測的敏感性和特異性均高于癌胚抗原(CEA)、糖鏈抗原19-9(CA19-9)和CA72-4。Berger等[16]發(fā)現(xiàn)CA19-9和血小板反應(yīng)蛋白2(THBS2)診斷胰腺癌的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.80和0.73, CA19-9聯(lián)合THBS2的AUC提高至0.87，當(dāng)兩者結(jié)合ctDNA時，AUC進(jìn)一步升至0.94，提示ctDNA在協(xié)同診斷中發(fā)揮一定作用。雖然ctDNA在診斷方面具有顯著優(yōu)勢，但尚未發(fā)現(xiàn)胃癌特異性ctDNA。

2. 指導(dǎo)用藥、監(jiān)測治療效果：在過去20年內(nèi)，靶向治療發(fā)展迅速，已廣泛應(yīng)用于多種腫瘤中。根據(jù)患者個體間的差異進(jìn)行個體化治療是當(dāng)下醫(yī)學(xué)發(fā)展的核心，而克服腫瘤異質(zhì)性是胃癌個體化治療的主要挑戰(zhàn)，尤其是針對人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)的靶向治療。Liu等[17]采用ddPCR檢測胃癌患者血漿與福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣品中HER2擴(kuò)增的符合率為81.4%，敏感性為76.5%，特異性為83.8%。治療2個月后血漿HER2/延伸因子Tu GTP結(jié)合域2(EFTUD2)比值顯著降低。隨訪期間7例患者疾病出現(xiàn)進(jìn)展，其中4例死亡。中位無進(jìn)展生存期為9.8個月。Wang等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA中HER2拷貝數(shù)變化可有效監(jiān)測曲妥珠單抗的療效，其效應(yīng)優(yōu)于常用的CEA和CA19-9，提示HER2在臨床中具有潛在的應(yīng)用價值。

靶向治療在應(yīng)用過程中會逐漸失去作用，ctDNA可幫助監(jiān)測病情變化，查明耐藥原因?？诉蛱婺崾且环N間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(mesenchymal to epithelial transition factor, MET)抑制劑，已證實其對 MET擴(kuò)增的胃癌有效。Lennerz等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，4例經(jīng)克唑替尼治療的MET擴(kuò)增腫瘤中2例腫瘤縮小，但分別在3.7個月和3.5個月后進(jìn)展。另一項研究[20]通過ctDNA分析1例晚期胃癌(Ⅳ期)患者接受克唑替尼治療2個月后發(fā)生耐藥的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MET擴(kuò)增再發(fā)生、多個繼發(fā)性MET突變、成纖維細(xì)胞生長因子受體2(FGFR2)基因相對拷貝數(shù)的急劇增加以及其他下游和旁路元件突變，上述變化可能與患者的癌癥進(jìn)展有關(guān)，亦是導(dǎo)致MET抑制劑無效的原因。

3. 復(fù)發(fā)的監(jiān)測和預(yù)后的判斷：諸多研究對cfDNA水平在胃癌手術(shù)切除后的臨床價值進(jìn)行探討。Pu等[21]的一項縱向研究發(fā)現(xiàn)，ctDNA在術(shù)前和術(shù)后第21天升高，但在術(shù)后3個月下降，如疾病有進(jìn)展則再次升高。Lan等[22]對428例胃癌患者的一項大型研究發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切除后持續(xù)高ctDNA水平是胃癌復(fù)發(fā)的指標(biāo)。一項針對277例Ⅳ期胃癌患者的研究[23]發(fā)現(xiàn)，對術(shù)前存在較高水平ctDNA突變的患者，5年隨訪期內(nèi)復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加，總體生存率降低。

多項研究評估了cfDNA拷貝數(shù)與預(yù)后的關(guān)系。Shoda等[24]對61例Ⅰ、Ⅱ期胃癌手術(shù)切除患者的研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后ctDNA的HER2/核糖核酸酶P RNA組分H1(RPPH1)比值隨復(fù)發(fā)而增加。另一項研究[25]探討了EB病毒(EBV)DNA在153例胃癌切除患者中的診斷價值。在21例EBV相關(guān)性胃癌患者中，通過循環(huán)EBV DNA水平評估了9例術(shù)后ctDNA缺失患者的臨床特征，其中1例隨訪2年以上者的EBV ctDNA升高早于臨床確診的復(fù)發(fā)。

目前評估DNA突變對胃癌預(yù)后影響的研究較少。Fang等[26]對277例進(jìn)展期胃癌患者的8個基因(共68個突變)進(jìn)行研究，結(jié)果證實晚期胃癌患者ctDNA水平升高與腹膜復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)，晚期胃癌患者ctDNA突變與預(yù)后不良有關(guān)。一項研究[27]對42例接受手術(shù)切除的Ⅱ期胃癌患者進(jìn)行縱向研究，評估TP53突變濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ctDNA含量變化與患者病情一致，即術(shù)后ctDNA含量下降，復(fù)發(fā)者ctDNA含量增加。

表觀遺傳學(xué)改變是胃癌發(fā)生的重要事件之一，包括組蛋白修飾、甲基化等。兩項研究[28-29]分別探討了ctDNA生物學(xué)標(biāo)志物MINT2啟動子和組織金屬蛋白酶抑制因子-3(TIMP-3)對92例胃癌手術(shù)切除患者無進(jìn)展生存期和復(fù)發(fā)風(fēng)險的評估價值，結(jié)果顯示術(shù)前ctDNA中MINT2啟動子甲基化異常與腹膜播散和腫瘤進(jìn)展有關(guān)；TIMP-3甲基化與無病生存率下降相關(guān)。Pimson等[30]的研究顯示，101例晚期胃癌患者中，PCDH10和RASSF1A甲基化率分別為94.1%和83.2%，此甲基化異常可導(dǎo)致患者的中位生存期降至8個月。Balgkouranidou等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，73例可手術(shù)胃癌患者術(shù)前ctDNA中，SOX17甲基化可降低患者總體生存率(overall survival, OS)。目前缺乏對ctDNA評估胃癌預(yù)后的深入研究，亦無研究表明ctDNA是一個獨立的復(fù)發(fā)預(yù)測因子，甲基化RASSF1A和SOX有望成為獨立的預(yù)測OS的指標(biāo)。由于越來越多的研究關(guān)注ctDNA在腫瘤預(yù)后方面的價值，Yang等[32]提出了腫瘤TNMB分期系統(tǒng)，較之于TNM分期系統(tǒng)，該系統(tǒng)增加了液體活檢的評估，使患者的癌癥診斷、治療和預(yù)后評價更準(zhǔn)確。

四、局限性

ctDNA作為液體活檢的重要組成部分，在胃癌個體化診療的各個方面發(fā)揮越來越重要的作用，但其發(fā)展過程仍然面臨諸多問題。①ctDNA檢測手段很多，但缺乏金標(biāo)準(zhǔn)；②現(xiàn)有ctDNA檢測技術(shù)價格高昂，需改進(jìn)技術(shù)的同時降低成本；③需行前瞻性研究，并在大規(guī)模后續(xù)研究中驗證結(jié)果，以確保臨床適用性。

人群種族多樣性有限是目前胃癌ctDNA研究的重要局限，ctDNA的數(shù)據(jù)均來自于亞洲患者群體。由于種族差異會影響腫瘤的發(fā)生和遺傳背景[33]，因此亞洲患者數(shù)據(jù)集應(yīng)用于其他種族背景的患者需謹(jǐn)慎。

美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)和美國病理醫(yī)師學(xué)會對已發(fā)表的ctDNA研究進(jìn)行綜述，證實ctDNA檢測方法在某些類型晚期癌癥中有較好的臨床有效性和實用性，但并不適用于所有腫瘤。已證實ctDNA結(jié)果與腫瘤組織基因分型存在不一致，因ctDNA可能會遺漏，故目前更支持腫瘤組織基因分型的結(jié)果。尚無充足證據(jù)表明ctDNA在早期診斷、治療監(jiān)測或殘留疾病檢測以及癌癥篩查中的臨床有效性[34]。

五、總結(jié)和展望

總之，液體活檢因方便、快捷、實時等特點在腫瘤學(xué)中占據(jù)越來越重要的位置。ctDNA與腫瘤具有千絲萬縷的聯(lián)系，NGS技術(shù)的發(fā)展可加快對ctDNA的理解和認(rèn)識。在診斷方面，ctDNA已被證實可作為新型腫瘤標(biāo)志物用于診斷腫瘤。然而，與其他腫瘤如結(jié)直腸癌、肺癌相比，其在胃癌中的研究時日尚短，尚未發(fā)現(xiàn)特異性ctDNA。同時應(yīng)將ctDNA與胃癌的標(biāo)志物進(jìn)行對比，證實其可靠性。在指導(dǎo)用藥和監(jiān)測療效方面，HER2擴(kuò)增扮演了重要角色，但期望更多研究能提示ctDNA與腫瘤分子耐藥機(jī)制間的關(guān)系，從而給臨床提供更多選擇和思考；最后，在預(yù)后方面，尚未證實ctDNA可作為判斷預(yù)后的獨立因素。除甲基化外，仍需對ctDNA濃度、數(shù)量、突變等行更大樣本量研究。此外，目前尚缺乏ctDNA與胃癌組織類型、解剖學(xué)分類關(guān)系的研究。對ctDNA的探索尤其在胃癌中的研究仍處于初級階段，未來需行進(jìn)一步研究探討其診斷、評估療效、預(yù)后的作用。