新型包埋微生物凝膠吸附、降解水中土霉素的研究

曾 明，潘 芃，宋陳光，魏 建，干 宇，吳 楠，王 昶

(1. 天津科技大學(xué)海洋與環(huán)境學(xué)院，天津 300457；2. 天津農(nóng)學(xué)院工程技術(shù)學(xué)院，天津 300384)

土霉素(OTC)是一種典型的四環(huán)素類抗生素，由于其具有廣譜活性且成本較低，作為生長促進劑被廣泛應(yīng)用于臨床治療和牲畜養(yǎng)殖業(yè)中[1]．殘留的抗生素已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于地表水、沉積物、土壤等環(huán)境中．殘留抗生素不僅會造成化學(xué)污染，還會為抗生素耐藥性的轉(zhuǎn)移和傳播提供選擇條件[2]．

包埋技術(shù)是利用包埋劑交聯(lián)微生物來制備水凝膠的技術(shù)．包埋技術(shù)作為一種固定化技術(shù)，在去除有機污染物和脫氮方面受到越來越多的關(guān)注[3-4]．相比于傳統(tǒng)的活性污泥法，微生物包埋法可以提高廢水處理效率．包埋劑包括聚乙烯醇、聚丙烯酸、卡拉膠、海藻酸鈉、海藻酸鈣等[5]．龐勝華等[6]研究發(fā)現(xiàn)包埋微生物對有機負荷有一定的沖擊抵抗能力，但內(nèi)部傳質(zhì)阻力較大，影響氧的擴散．β-環(huán)糊精(β-CD)是由7 個葡萄糖殘基以α-1，4-糖苷鍵連接而成的環(huán)狀化合物，具有親水的外圍及疏水的內(nèi)腔，在溶液中可與多種有機物(如各類有機污染物)形成包合物[7]．由于β-CD 成本較低而且具有合適內(nèi)徑，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境保護中，例如β-CD 的聚合物被用來去除水中的雌激素類物質(zhì)[8]．Cui 等[9]發(fā)現(xiàn)β-CD 可以增大凝膠結(jié)構(gòu)中的三維網(wǎng)格，使交聯(lián)點分布較均勻，從而賦予凝膠良好的機械性能．Alsbaiee 等[10]合成了一種β-CD 的聚合物，能夠快速吸附水體中的多種有機微污染物，吸附速率是活性炭的15～200 倍，并且吸附上去的污染物可以被化學(xué)性質(zhì)溫和的淋洗劑洗脫，從而使聚合物可以被多次再生．針對凝膠存在較大傳質(zhì)阻力的問題，本團隊研究[11]發(fā)現(xiàn)，β-CD 能夠增大微生物的生物活性，促進營養(yǎng)物質(zhì)向凝膠內(nèi)部的傳質(zhì)，從而提高同步硝化反硝化的脫氮效率．

本文在傳統(tǒng)包埋微生物凝膠中加入β-CD 來制作新型包埋材料，對比研究它對水中OTC 的吸附和生物降解行為，并考察其微生物活性和群落多樣性．

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

聚乙烯醇(PVA，水解度大于97% )、海藻酸鈉(SA)、β-CD、NaNO3、CaCl2以及配制模擬廢水(每升模擬廢水中含有200 mg 蔗糖，2 mg OTC，100 mg NH4Cl，27 mg KH2PO4，500 mg NaHCO3，180 mg CaCl2·2H2O，300 mg MgSO4·7H2O 和1 mL 微量元素液(625 mg/L EDTA，190 mg/L NiCl2·6H2O，430 mg/L ZnSO4·7H2O ，220 mg/L NaMoO4·2H2O ，240 mg/L CoCl2·6H2O ，990 mg/L MnCl2·4H2O ，250 mg/L CuSO4·5H2O))的化學(xué)藥品均購自天津光復(fù)精細化工研究所；OTC，赤峰制藥股份有限公司；乙腈、甲醇，色譜純，Sigma-Aldrich 公司；PBS 緩沖液，Solarbio公司．

Oxi3210 型溶解氧儀，德國WTW 公司；LC-20 A 型高效液相色譜儀，日本島津公司；FSH-2A 型高速攪拌機，上海谷寧儀器有限公司．

1.2 微生物凝膠小球的制備

在90 ℃水浴加熱的條件下，使固體的PVA、SA和β-CD 完全混合溶解，最終三者的質(zhì)量濃度分別為PVA 70 g/L、SA10 g/L 和β-CD 20 g/L．3 500 r/min 離心10 min 得到濃縮的活性污泥(含水率約為10%). 然后將其加入到冷卻至35 ℃的凝膠溶液中，使最終污泥的質(zhì)量濃度(干質(zhì)量)約為2 g/L．用蠕動泵以固定流速將凝膠溶液緩慢滴加到質(zhì)量濃度為500 g/L NaNO3和20 g/L CaCl2的交聯(lián)液中，制成粒徑(3.5±0.3)mm 的凝膠小球，在交聯(lián)液中4 ℃保存12 h，最后用水清洗凝膠小球．本研究對比了有β-CD 小球和無β-CD 小球?qū)TC 的吸附和降解行為．

1.3 OTC吸附實驗

將未包埋微生物的凝膠小球在70 ℃下烘干2 d至質(zhì)量恒定，然后加入到200 mL 100 mg/L 的OTC溶液中，分別于0、1、2.5、5、10、120 min 采集水樣，分析OTC 的質(zhì)量濃度．通過式(1)計算擴散系數(shù)(De)，通過式(2)計算出干燥凝膠小球?qū)TC 的吸附量(Q)[12]．

式中：ρ0為OTC 的初始質(zhì)量濃度，mg/L；ρf為OTC的最終質(zhì)量濃度，mg/L；ρt為t 時刻OTC 的質(zhì)量濃度，mg/L；De為擴散系數(shù)，cm2/s；d 為凝膠小球的直徑，cm；V 為液體體積，mL；m 為加入的干燥凝膠小球的質(zhì)量，g．

1.4 OTC降解實驗

取200 g 包埋微生物的濕質(zhì)量凝膠小球放入容積為6 L 的圓柱形生物反應(yīng)器中，用模擬廢水以0.39 L/h 的流量連續(xù)輸送到反應(yīng)器中進行生物降解反應(yīng)．反應(yīng)器啟動1 個月后，水流流量依次調(diào)整為0.91、0.66、0.39 L/h，每個流量維持兩周時間．之后在0.39 L/h 的流量下，依次調(diào)整蔗糖與OTC 的質(zhì)量比為100∶2、50∶2 和0∶2．每天收集進水和出水，檢測OTC 質(zhì)量濃度和化學(xué)需氧量(COD)．

1.5 呼吸實驗

在20 ℃恒溫條件下，先將包埋有微生物的凝膠小球浸沒在蒸餾水中，使用溶解氧儀測定氧氣消耗速率，計算內(nèi)源呼吸速率．獲得穩(wěn)定內(nèi)源呼吸速率數(shù)據(jù)后，向蒸餾水中加入OTC，計算以O(shè)TC 作為唯一碳源的外源呼吸速率．最后，加入模擬廢水，計算以O(shè)TC 和蔗糖共同作為碳源的外源呼吸速率．根據(jù)凝膠小球內(nèi)包埋的微生物質(zhì)量，可以通過式(3)得到比內(nèi)源及比外源呼吸速率，以此來評估被包埋微生物的活性．包埋微生物濃度是用Chen 等[13]的方法測定小球內(nèi)部微生物蛋白質(zhì)的含量換算得到的．

式中：SOUR 為微生物比呼吸速率，mg/(g·h)；ρi為初始的溶解氧濃度，mg/L；ρe為最終的溶解氧濃度，mg/L；Δt 為ρi到ρe所經(jīng)歷的時間，h；VSS 是微生物的質(zhì)量濃度，g/L．

1.6 分析方法

采用高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)和紫外檢測儀檢測水中OTC 濃度．C18 色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相流量為0.8 mL/min，0.01 mol/L 的草酸溶液為流動相A，V(乙腈)∶V(甲醇)＝2∶1 的混合液為流動相B，檢測波長為355 nm．

1.7 高通量測序

凝膠小球用高速攪拌機打碎混勻使微生物釋放出來，污泥直接采集放入2 mL 的滅菌離心管中，用PBS 緩沖液清洗．分析前一直在-20 ℃下冷藏．微生物群落的產(chǎn)物純化和高通量測序分析在北京奧維森基因科技有限公司的Illumina MiSeq 平臺上操作．

2 結(jié)果與討論

2.1 OTC的吸附

圖1 為OTC 在凝膠小球內(nèi)部傳質(zhì)性能隨時間變化圖，可以發(fā)現(xiàn)有β-CD 小球的擬合曲線斜率大于無 β-CD 小球的，有β-CD 小球的擴散系數(shù)與吸附OTC的質(zhì)量分別達到了6.1×10-7cm2/s 和8.1 mg/g；而無β-CD 的凝膠小球這兩組數(shù)值僅分別為4.9×10-7cm2/s和7.6 mg/g．這說明β-CD 能夠一定程度地增大OTC在小球內(nèi)部的擴散系數(shù)，緩解傳質(zhì)阻力較大的問題．除此以外，還發(fā)現(xiàn)β-CD 可以增加轉(zhuǎn)移到凝膠小球內(nèi)的OTC 的量，可能是因為它對有機物強烈的吸附能力．已有研究證明，β-CD 可以和多種有機物形成主客體包結(jié)物．例如，苯甲酸進入內(nèi)部疏水的β-CD 孔隙中會被誘導(dǎo)形成1∶1 的軸向主客體的包結(jié)物[14]．因此推測β-CD 應(yīng)該能與OTC 形成包結(jié)物．

圖1 OTC在凝膠小球內(nèi)部傳質(zhì)性能隨時間變化圖 Fig. 1 Transfer capacity of OTC into gel beads with timevariation

2.2 OTC的生物降解

由于凝膠對OTC 有強烈的吸附作用，而本研究使用的OTC 濃度不高，如果采用序批式實驗，凝膠小球會大量吸附模擬廢水中的OTC，無法研究其降解效果，因此用連續(xù)進水實驗來研究OTC 的生物降解，結(jié)果見表1．

隨著流量的降低，出水OTC 濃度逐漸減?。疅oβ-CD 小球?qū)TC 的去除率從11%增長到33%，有β-CD 小球?qū)?OTC 的去除率則從 18% 增長到37%．主要原因是停留時間的增大讓凝膠中微生物與污染物接觸時間變長，而流量較高、水力停留時間較低時，由于廢水中的OTC 沒有充分被吸附，也沒有充分進入包埋顆粒內(nèi)部，因此去除率相對較低．靖丹楓等[15]發(fā)現(xiàn)當固定化膜生物反應(yīng)器的停留時間由6 h提高到24 h，OTC 的去除率由64%提高到75%．

另外對比有β-CD 小球和無β-CD 小球，可以看出兩種凝膠小球的OTC 去除率在所有條件下都比較接近，沒有較大的差異，僅蔗糖與OTC 的比例高的條件下，有β-CD 小球比無β-CD 小球的OTC 去除率略高一些．說明能夠降解OTC 的微生物在這兩種小球中的生長狀態(tài)一致，差異不明顯的原因可能是OTC 的濃度較低．但是對于COD 的生物降解而言，有β-CD 小球比無β-CD 小球的COD 去除率要高(表1)，最大能達到90%，尤其是在較高水流流量的情況下．這可能與β-CD 對微生物的保護作用有關(guān)，孔德洋等[16]研究了環(huán)糊精對硝基苯的生物降解的影響， 發(fā)現(xiàn)環(huán)糊精可以提高降解菌對硝基苯的耐受濃度，縮短降解菌的停滯時間，促進降解菌的生長，加快硝基苯的降解．但是本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)β-CD 對OTC降解有明顯的促進作用，或許經(jīng)過長時間馴化培養(yǎng)后，β-CD 小球能促進OTC 的降解．

表1 不同條件下OTC和COD的去除效率總結(jié) Tab. 1 OTC and COD removal efficiency under different operation conditions

OTC 屬于難生物降解的有機物，降解機理屬于共代謝，因此評估了蔗糖與OTC 質(zhì)量比對OTC 去除率的影響(表1)．隨著蔗糖與OTC 質(zhì)量比的減小，出水OTC 的濃度增加，OTC 的去除率從42%顯著降低到4%，這個結(jié)果進一步證明了共代謝對OTC 的降解起主要作用．同樣的，趙聯(lián)芳等[17]發(fā)現(xiàn)人工濕地的進水COD 濃度越高，OTC 的去除率越高，特別是當COD 濃度大于400 mg/L 時，OTC 的去除率均達到90%以上．

2.3 微生物活性

表2 匯總了活性污泥(SS)，有β-CD 和無β-CD小球中微生物的呼吸速率．

表2 活性污泥(SS)、有β-CD和無β-CD小球的比內(nèi)源和最大比外源呼吸速率對比 Tab. 2 Comparison of endogenous and maximum specific exogenous respiration rates of suspended sludge(SS)and gel beads with and without β-CD

由表2 可知，包埋能顯著增加微生物的呼吸速率，即微生物活性，如包埋小球的比內(nèi)源呼吸速率和最大比外源呼吸速率都遠大于活性污泥．可以發(fā)現(xiàn)，當以O(shè)TC 作為唯一碳源時，包埋小球的比內(nèi)源呼吸速率和最大比外源呼吸速率差異不大，說明微生物并沒有較強的能力以O(shè)TC 作為碳源進行外源呼吸作用，這與表1 中較低的OTC 去除效率一致．但是，2 mg/L 的OTC 也沒能對被凝膠包埋的微生物產(chǎn)生強烈抑制作用，在加入蔗糖基質(zhì)后，被包埋的微生物的最大比外源呼吸速率有了極大的提高，主要原因是微生物開始大量利用容易降解的碳源進行呼吸作用，這一現(xiàn)象與表1 中較高的COD 去除效率一致．當OTC和蔗糖質(zhì)量比為2∶200 時，有β-CD 小球最大比外源呼吸速率為1.22 mg/(g·h)，無β-CD 小球的為0.61 mg/(g·h)，速率最低的是活性污泥，僅為0.07 mg/(g·h)．這說明加入β-CD 可以顯著增加微生物的活性，其原因可能是β-CD 對包埋的微生物起到一些保護作用．例如，Chen 等[18]對比了含環(huán)糊精和不含環(huán)糊精的超支化聚酰胺水凝膠材料的細胞毒性，發(fā)現(xiàn)將環(huán)糊精通過共價鍵引入超支化聚酰胺降低了凝膠材料對細胞的毒性．β-CD 對于能降解OTC 的微生物的促進作用并不明顯，可能是由于馴化時間較短．

2.4 微生物多樣性分析

活性污泥、有β-CD 和無β-CD 小球的微生物群落多樣性指數(shù)見表3．

表3 活性污泥(SS)、有β-CD和無β-CD小球的微生物群落多樣性指數(shù) Tab. 3 Diversity indexes of bacterial community in suspended sludge and gel beads with and without β-CD

活性污泥中發(fā)現(xiàn)的原核微生物種類最多，綜合Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)，SS 的多樣性指數(shù)最高，說明活性污泥的微生物群落多樣性最高，其次是有β-CD 小球，而無β-CD 的凝膠小球微生物多樣性最低．原因可能是經(jīng)過微生物固定化技術(shù)淘汰了一些活性污泥中的微生物，因為包埋的過程中需要經(jīng)歷一段低溫和高滲透壓的條件．有β-CD 凝膠小球由于β-CD 的添加，對微生物的活性保持具有一定的促進作用[13]，因此微生物多樣性相對較高．Coverage 指數(shù)表示樣品的覆蓋度，3 組Coverage 指數(shù)數(shù)值均在0.99以上，表明樣品中序列沒有被測出的概率較低．

活性污泥、無β-CD 小球和有β-CD 小球包埋的微生物門水平上的相對豐度如圖2 所示．按照相對豐度由大到小的排列順序如下：變形菌門(Proteobacteria) ＞擬桿菌門(Bacteroidetes) ＞放線菌門(Actinobacteria)＞Saccharibacteria 等．變形菌門在3種樣品中都處于優(yōu)勢菌，包埋小球中變形菌門的數(shù)量較活性污泥有所增加，其在有β-CD 小球、無β-CD 小球和活性污泥中所占比例依次為66.30%、62.95%、48.37%．這與李帥[19]的研究結(jié)果一致，他發(fā)現(xiàn)在抗生素的作用下，變形菌門豐度明顯上升．另外，吳穎[20]發(fā)現(xiàn)變形菌門和放線菌門都能夠攜帶抗性基因．本研究發(fā)現(xiàn)在抗生素逆境的脅迫下，包埋小球中上述攜帶抗性基因的菌門數(shù)量有所增加，而其他菌門的數(shù)量有所減少(圖2)．擬桿菌門也是一類常見的抗生素耐藥菌[21]，本研究也發(fā)現(xiàn)它主要存在于無β-CD 凝膠小球中，其次是活性污泥，含量最少的是有β-CD 凝膠小球，所占比例依次為33.96%、21.92%和15.47%．

圖2 活性污泥、有β-CD 和無β-CD 小球的微生物門水平的微生物相對豐度(顯示豐度大于0.1‰的門) Fig. 2 Taxonomic classification of bacterial communities of suspended sludge and gel beads with and without β-CD gel beads at a phylum level(greater than 0.1‰)

為了深入研究微生物群落組成，對比了活性污泥、無β-CD 小球和有β-CD 小球包埋微生物屬水平的微生物相對豐度，結(jié)果如圖3 所示．

圖3 活性污泥、有β-CD和無β-CD小球的微生物屬水平的微生物相對豐度(顯示豐度大于0.1%的屬) Fig. 3 Taxonomic classification of bacterial communities of suspended sludge and gel beads with and without β-CD gel beads at a genus level(greater than 0.1%)

可以發(fā)現(xiàn)，3 種樣品屬水平的微生物各不相同，在有β-CD 小球中，棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、Alicycliphilus、Flavihumibacter 和假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)含量較多，分別為16.42%、10.11%、7.21%、6.84%和6.00%．有研究[22]表明，棒狀桿菌在好氧條件下具有較強的降解抗生素藥物中間體的能力，廢水COD 的去除率達到37.8%，與本文的40%左右的OTC 去除率一致，不動桿菌屬也被報道會對常用抗生素產(chǎn)生耐藥性[23]．無 β-CD 小球中的主要菌屬為 Flavihumibacter，占比 22.53% ，其次是嗜酸菌屬(Acidovorax)，占6.16%，最后是假黃單胞菌屬，占6.00%；然而關(guān)于這些菌群抗生素耐藥性的研究不多，作者推測這些菌群可能也具有一定的耐藥性和抗生素降解性能，還需要從抗性基因方面深入研究．活性污泥中的優(yōu)勢菌屬相對于凝膠小球則完全不同，分別為鞘脂菌屬(Sphingobium)、Nakamurella、Ferruginibacter，占比依次為8.59%、8.18%和7.98%．因此，通過屬水平分析可知，活性污泥被凝膠包埋后在抗生素脅迫條件下，微生物群落有了很大變化，而且β-CD 的加入也能改變凝膠小球內(nèi)部的微生物群落，有β-CD 小球含有較多的抗藥性微生物菌屬．

總之，凝膠小球?qū)τ贠TC 有較高的吸附性能，也會大大促進微生物的活性，對包埋的微生物起到保護作用．有β-CD 小球與無β-CD 小球在OTC 的降解方面基本沒有差別，但是在COD 的降解方面差別比較大(表1)，推測這一現(xiàn)象與β-CD 包埋的凝膠小球的吸附性能和微生物活性、群落組成的特性有關(guān)．在本研究中，β-CD 主要影響的并不是降解OTC 的微生物，而是其他的異養(yǎng)型的微生物．

3 結(jié) 論

(1)凝膠小球?qū)TC 有很好的吸附效果，在添加β-CD 后吸附效果更加明顯，能夠增大傳質(zhì)系數(shù)和吸附量．

(2)OTC 的生物降解屬于共代謝，并且隨著流量的降低，出水OTC 濃度逐漸減?。笑?CD 小球和無β-CD 小球的OTC 去除率差異不大，而在COD 去除效果和生物活性方面，有β-CD 小球的表現(xiàn)更好．

(3)高通量測序結(jié)果顯示，凝膠小球比活性污泥的微生物多樣性要小，變形菌門(Proteobacteria)是豐度最高的門，而3 種樣品屬水平的微生物各不相同，有β-CD 小球中的棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、不動桿菌屬(Acinetobacter)是報道較多的抗生素耐藥菌.

致謝：感謝天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃(201910057238)和天津科技大學(xué)實驗室創(chuàng)新基金(1605A107)對于本研究提供的資金支持．