添加活性酵母和莫能菌素對蒸汽壓片玉米活體外產(chǎn)氣量及瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

丁 健， 孟慶翔

（1.全國畜牧總站，北京100125；2.中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京100094）

谷物蒸汽壓片加工技術通過提高谷物淀粉在瘤胃和全消化道的消化率， 提高了谷物的飼喂效果，在反芻動物飼養(yǎng)中得到廣泛應用。但蒸氣壓片谷物淀粉糊化度的提高， 加快了其在瘤胃內(nèi)的發(fā)酵速度， 對于飼喂以谷物為主的高精料日糧的肥育牛羊而言，易引發(fā)瘤胃有機酸的積累，導致微生物區(qū)系失調(diào)和功能紊亂， 從而提高誘發(fā)急慢性瘤胃酸中毒的可能。莫能菌素作為瘤胃調(diào)控劑，被用于穩(wěn)定反芻動物瘤胃內(nèi)環(huán)境。 但由于抗生素耐藥性轉(zhuǎn)移、 藥物殘留等食品安全問題引起人們廣泛擔憂，其使用也受到限制?；钚越湍钢饕ㄟ^活酵母菌來穩(wěn)定瘤胃功能， 由于其不存在藥物殘留等問題，近年來被廣泛應用。但酵母產(chǎn)品由于其活性及使用方法的差異，目前的研究報告顯示，其對瘤胃發(fā)酵及動物生產(chǎn)性能的影響效果不一致。 本試驗利用活體外產(chǎn)氣法，以蒸汽壓片玉米為底物，研究比較活性酵母和莫能菌素對瘤胃發(fā)酵的影響，為瘤胃調(diào)控劑在以蒸汽壓片谷物為日糧的反芻家畜生產(chǎn)中的應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 蒸汽壓片玉米的制備：選取河北省本地玉米進行蒸汽壓片處理。 壓片參數(shù)：95 ℃蒸汽調(diào)質(zhì)55 min，壓片厚度2 mm，容重390 g/L。風干樣品通過旋風磨粉碎機粉碎后過1 mm 米篩， 常溫保存、 備用。 活性酵母（Saccharomyces cerevisiae CNCM I-1077）由拉曼動物營養(yǎng)公司提供（活細胞數(shù)≥2.0×1010cfu/g）。 莫能菌素由浙江海正興發(fā)獸藥有限公司提供（含量20%）。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 試驗處理 采用Menke 等（1979）的活體外產(chǎn)氣法進行體外試驗。 試驗設三個處理：（1）對照組（CK 組）；（2）活性酵母（LY 組）添加組，添加量16.7 mg/L （3.3×108cfu//L）；（3） 莫能菌素（MO組）添加組，添加量3.3 mg/L。

1.2.2 活體外培養(yǎng) 將0.2000 g 蒸汽壓片玉米放入特制的100 mL 注射器樣玻璃消化管中，試驗組分別添加活性酵母（16.7 mg/L）和莫能霉素（3.3 mg/L），39 ℃水浴鍋預熱。 用自動加液器向各培養(yǎng)管加入30 mL 混合培養(yǎng)液，迅速放入已預熱（39 ℃）的人工瘤胃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 分別記錄各處理組在培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、18、24、28、32、36、40、44、48、56、64 和72 h 的產(chǎn)氣量，每個時間點3 個重復。 同時將各處理組進行另一個批次3 個重復的培養(yǎng)， 測定24 h 干物質(zhì)消化率，并測定上清液中pH、VFA 和NH3-N 濃度等活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)。

1.2.3 混合培養(yǎng)液的制備 于晨飼前通過瘤胃瘺管分別采集4 頭西門塔爾雜交閹公牛的瘤胃內(nèi)容物，等體積混合后，以4 層紗布過濾，并迅速加入裝有經(jīng)CO2飽和并預熱的39 ℃緩沖液中，配制成混合培養(yǎng)液（瘤胃液與緩沖液配比為1：2）。

1.2.4 產(chǎn)氣參數(shù)計算公式

采用模型GP=B×｛1-exp［-c×（t-lag）］｝，計算動態(tài)消化產(chǎn)氣參數(shù)；

式中：GP 為t 時間點0.2000 g 底物干物質(zhì)（DM）產(chǎn)氣量，mL；B 為0.2000 g 底物DM 理論最大產(chǎn)氣量，mL；c 為樣本的產(chǎn)氣速度，h-1；lag 為樣本的產(chǎn)氣延滯期，h；t 為體外培養(yǎng)時間，h。

1.3 測定指標與方法 pH： 發(fā)酵結(jié)束后用雷磁PHS－3C 型精密pH 計（數(shù)顯讀數(shù)精度0.01）迅速測定。

VFA 濃度：采用Varian 3420 氣相色譜儀（北京分析儀器廠）測定。 取1 mL 分離液相，加入0.2 mL 25%（W/V）偏磷酸，搖勻后冰浴超過30 min，10000 g 離心10 min，取上清液用于色譜分析。 色譜條件：PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱， 色譜柱為內(nèi)徑3 mm，長2 m；載氣為氮氣，流速45 mL/min，氫氣流速35 mL/min，空氣流速250 mL/min，氫焰離子檢測器，柱溫150 ℃，離子化室溫度220 ℃，靈敏度107，衰減4，進樣量0.6 μL。

NH3-N 濃度：苯酚－次氯酸鈉比色法測定。1.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)采用SAS 統(tǒng)計分析軟件（SAS，1999）中的廣義線性模型（GLM）進行單因子試驗方差分析， 采用鄧肯氏新復極差法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 添加活性酵母和莫能菌素對72 h 動態(tài)產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣參數(shù)的影響 圖1 為添加LY 和MO 后蒸汽壓片玉米在72 h 內(nèi)的動態(tài)產(chǎn)氣曲線。 產(chǎn)氣量數(shù)據(jù)擬合非線性回歸方程得出各發(fā)酵參數(shù)值見表1。 由表1 可知，與對照組相比，LY 添加顯著降低了蒸汽壓片玉米的產(chǎn)氣速度 （P ＜0.05），但對產(chǎn)氣延滯期24 h 和72 h 總產(chǎn)氣量及理論最大產(chǎn)氣量影響不顯著；添加MO 顯著提高了產(chǎn)氣速度 （P ＜0.05）， 縮短了產(chǎn)氣延滯期 （P ＜0.05），并顯著降低了24 h 和72 h 總產(chǎn)氣量及理論最大產(chǎn)氣量（P ＜0.05）。

圖1 添加活性酵母和莫能菌素后蒸汽壓片玉米72 h 的產(chǎn)氣趨勢

表1 添加活性酵母和莫能菌素對蒸汽壓片玉米體外產(chǎn)氣動態(tài)參數(shù)的影響

2.2 添加活性酵母和莫能菌素對底物干物質(zhì)消化率的影響 添加LY 和MO 對蒸汽壓片玉米24 h DM 消化率無顯著影響（P ＞0.05），結(jié)果見圖2。

圖2 添加活性酵母和莫能菌素后蒸汽壓片玉米24 h DM 消化率

2.3 添加活性酵母和莫能菌素對24 h 活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 從表2 可以看出， 添加LY顯著提高了發(fā)酵液NH3-N 濃度 （P ＜0.05），對VFA 組成比例無顯著影響；添加MO 顯著降低了發(fā)酵液NH3-N 濃度，乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸及異戊酸摩爾比例（P ＜0.05），顯著提高了丙酸比例（P ＜0.05），從而顯著地降低了乙：丙比（P ＜0.05）。兩者對體外瘤胃pH 和總VFA 的影響均不顯著。

表2 添加活性酵母和莫能菌素對蒸汽壓片玉米活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

3 討論

3.1 添加活性酵母和莫能菌素對72 h 動態(tài)產(chǎn)氣量、 產(chǎn)氣參數(shù)和DM 消化率的影響 據(jù)報道，莫能菌素能選擇性抑制革蘭氏陽性菌生長，產(chǎn)甲烷菌被抑制導致瘤胃發(fā)酵甲烷的量減少，同時CO2產(chǎn)量也會有所降低，導致總產(chǎn)氣量減少，這與本試驗中添加莫能菌素顯著降低了24 h 和72 h 的總產(chǎn)氣量一致。 但從試驗結(jié)果也可以看出，試驗中莫能菌素對產(chǎn)氣量的抑制主要體現(xiàn)在發(fā)酵12 h以后， 而在發(fā)酵前12 h 莫能菌素反而提高了產(chǎn)氣量，最終表現(xiàn)為添加莫能菌素顯著加快了產(chǎn)氣速度，并縮短了發(fā)酵底物的產(chǎn)氣延滯期。 添加活性酵母雖未對產(chǎn)氣延滯期產(chǎn)生影響，但卻顯著降低了產(chǎn)氣速度，實質(zhì)是減緩了蒸汽壓片玉米的瘤胃發(fā)酵速度。 根據(jù)本試驗結(jié)果推測，相對于莫能菌素，活性酵母對在蒸汽壓片玉米等含高快速降解碳水化合物日糧中緩解瘤胃酸中毒可能更為有效，但這一推論還有待于試驗的進一步驗證。

研究表明， 谷物飼料在瘤胃中發(fā)酵速度越快，其發(fā)酵程度越高。但在本次試驗中，酵母的添加雖然降低了蒸汽壓片玉米的發(fā)酵速度， 但其24 h 累積產(chǎn)氣量與對照組無顯著差異，因此并未觀察到DM 消化率的降低，反而在數(shù)值上略有升高。Miller-Webster 等（2002）發(fā)現(xiàn)，酵母或酵母培養(yǎng)物的添加，能夠增加瘤胃內(nèi)的細菌總數(shù)，提高細菌活力及營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃的消化率。 相反，莫能菌素雖然提高了壓片玉米的產(chǎn)氣速度，但發(fā)酵至24 h 時，瘤胃產(chǎn)氣量卻顯著降低了，因此體現(xiàn)在DM 消化率數(shù)值上反而略有降低。 有研究發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)培養(yǎng)試驗中添加莫能菌素能降低飼料DM 的消化率，谷物類型也會影響離子載體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化。

3.2 添加活性酵母和莫能菌素對活體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響 本試驗采用蒸汽壓片玉米作為活體外發(fā)酵底物，因其淀粉糊化度提高，在瘤胃內(nèi)降解速度快， 易導致有機酸積累和pH 下降。但根據(jù)本試驗發(fā)酵液pH 的范圍看，瘤胃發(fā)酵處于一個正常pH 的發(fā)酵狀態(tài)。 Miller-Webster 等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，在較高pH 條件下活性酵母對pH 調(diào)節(jié)的效應則不能有效發(fā)揮。本試驗中，活性酵母和莫能菌素的添加都未對體外瘤胃pH 產(chǎn)生顯著影響，可能是因為活體外發(fā)酵本身處于一個較高的pH 水平。 活性酵母的添加顯著提高了NH3-N 濃度，可能是因為酵母培養(yǎng)物能夠提高底物蛋白質(zhì)在瘤胃中的消化，從而導致瘤胃NH3-N濃度的升高。 與之相反，莫能菌素顯著降低了發(fā)酵液中NH3-N 濃度， 可能與莫能菌素對格蘭氏陽性菌的抑制作用會降低蛋白質(zhì)瘤胃代謝，從而降低瘤胃氨氮濃度有關。柏研等（2019）在荷斯坦犢牛上也得到了相同的結(jié)果。

本試驗中， 活性酵母對發(fā)酵液中總VFA 產(chǎn)量、各VFA 的摩爾百分比及乙丙比均未產(chǎn)生顯著影響， 這與其他研究添加酵母產(chǎn)品對瘤胃發(fā)酵的影響結(jié)果不一致。 Wen 等（2017）報道，在給采食低質(zhì)粗飼料的泌乳奶牛的日糧中添加活性酵母，能顯著提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸的濃度， 但不影響各類VFA 摩爾比例， 與Andrighetto 等（1993）在給采食高精料日糧的綿羊添加酵母培養(yǎng)物的結(jié)論一致。 Zeleňák 等（1994）在體外試驗中發(fā)現(xiàn)，添加活性酵母對瘤胃VFA 產(chǎn)量及摩爾比例的影響隨發(fā)酵底物的精粗比而改變。 Lynch 和Martin（2002）報道，當以粉碎玉米作為發(fā)酵底物時，活性酵母對丙酸及丁酸濃度無顯著影響， 但能顯著降低乙酸產(chǎn)量，從而降低乙丙比；而當以可發(fā)酵淀粉為底物時，活性酵母對乙酸影響不大，對丙酸產(chǎn)量有所提高，但差異不顯著，最終顯著地降低了乙丙比。顯然，酵母類產(chǎn)品對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響規(guī)律并不一致，其會隨日糧特性的不同而發(fā)生改變。莫能菌素能提高丙酸比例， 降低乙丙比的這一作用已被前人研究一致證實， 本試驗也得到了與之一致的結(jié)果， 而高丙酸型發(fā)酵有利于提高反芻動物的能量利用效率。

4 結(jié)論

以蒸汽壓片玉米為發(fā)酵底物時， 活性酵母的添加能夠減緩谷物的體外發(fā)酵速度， 但對產(chǎn)氣量及體外瘤胃發(fā)酵參數(shù)無顯著影響。 莫能菌素則能顯著提高谷物的體外產(chǎn)氣速度，縮短產(chǎn)氣延滯期，并顯著降低乙酸比例，提高丙酸產(chǎn)量，降低乙：丙比例。