Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用評價*

黃旭，劉成成，徐婷，唐晨杰，夏文穎，倪芳，王芳，劉根焰

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部，南京 210029)

Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用評價*

黃旭，劉成成，徐婷，唐晨杰，夏文穎，倪芳，王芳，劉根焰

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗學(xué)部，南京 210029)

目的 評估Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的臨床應(yīng)用價值。方法 選取43份腹瀉糞便標本，采用厭氧培養(yǎng)法、VIDAS檢測A/B毒素法和Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)檢測艱難梭菌，以產(chǎn)毒培養(yǎng)法作為金標準對檢測方法進行評價，并比較不同檢測方法對臨床標本檢測結(jié)果的一致性。通過自配027型標準菌株模擬糞便標本，驗證Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)篩選027型流行株的能力。結(jié)果 以產(chǎn)毒培養(yǎng)法為金標準，Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的敏感性和特異性分別為90.9%和93.8%，陽性和陰性預(yù)測值分別為 83.3%和96.8%。與產(chǎn)毒培養(yǎng)法結(jié)果一致性檢驗Kappa值為0.822(P<0.05)，與VIDAS檢測A/B毒素法結(jié)果一致性檢驗Kappa值為0.419(P<0.05)；027型標準菌株模擬糞便標本檢測結(jié)果陽性并報告為027型。結(jié)論 Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)能夠快速準確地檢測糞便標本中的艱難梭菌相關(guān)基因，且能準確報告027型高產(chǎn)毒力菌株。

艱難梭菌；Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)；產(chǎn)毒培養(yǎng)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)是一種專性厭氧的革蘭陽性粗大芽胞桿菌，屬腸道條件致病菌，其感染可以導(dǎo)致輕中度腹瀉、偽膜性腸炎(pseudomembranous colitis，PMC)甚至中毒性巨結(jié)腸[1]。近年來，我國艱難梭菌的感染率逐年上升，院內(nèi)感染相關(guān)腹瀉患者平均感染率為14%，部分地區(qū)高達23%，且歐美地區(qū)流行的027型高產(chǎn)毒力菌株也在國內(nèi)多個地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[2]。因此，積極開展艱難梭菌檢測新技術(shù)非常重要。

艱難梭菌感染的實驗診斷方法主要有厭氧培養(yǎng)法、毒素的免疫法檢測和基于相關(guān)毒素基因的分子檢測。Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)(XpertC.difficileAssay)是基于熒光定量PCR技術(shù)的一站式糞便標本快速檢測技術(shù)，能同時檢測tcdB、二元毒素(binary toxin,cdtA和cdtB)和缺失ntΔ117的tcdC3種基因，且可以推測菌株是否為027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒流行株。國外研究認為其可以快速直接檢測糞便標本中的產(chǎn)毒艱難梭菌，具有高敏感性和高特異性[3-4]。國內(nèi)少數(shù)實驗室近年來也陸續(xù)引入Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)，其中瑞金醫(yī)院微生物室還與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行了比較研究，但沒有與產(chǎn)毒培養(yǎng)法進行比較和評估，也未評估其檢測027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒流行株的性能[5]。本研究以產(chǎn)毒培養(yǎng)(toxigenic culture)法為參比方法，評估Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)的敏感性和特異性，并以027/NAP1/BI標準菌株的模擬糞便標本驗證其預(yù)測027型高產(chǎn)毒力菌株的能力，同時還分析比較了Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)與現(xiàn)有檢測方法的優(yōu)缺點。

1 材料和方法

1.1 標本收集 收集2016年3月至7月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院患者腹瀉糞便標本43份，包括32份凍存標本和11份新鮮標本。實驗室自配ATCC BAA-1870(核糖體分型為027型)標準菌株(廣州醫(yī)科大學(xué)吳愛武教授惠贈)的菌液及模擬糞便標本。

1.2 主要儀器與試劑 GeneXpert熒光定量檢測系統(tǒng)和XpertC.difficile檢測試劑盒(美國Cepheid公司)；哥倫比亞血平板、GENbag厭氧產(chǎn)氣袋、梅里埃Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定系統(tǒng)、ANC卡、VIDAS全自動免疫分析儀和艱難梭菌毒素A/B(CDAB)檢測試劑盒(法國生物梅里埃公司)；2720型基因擴增儀(美國Applied Biosystems公司)；GelDoc XR 凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)；2×PCR Master Mix、RNA-free water(TaKaRa公司)；PCR引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.3 Xpert艱難梭菌檢測 嚴格按照艱難梭菌檢測試劑盒說明書進行稀便標本的前處理，然后按照GeneXpert儀器操作說明書進行熒光定量PCR，檢測標本中艱難梭菌的tcdB、二元毒素和缺失型tcdC基因。臨床樣本及模擬糞便樣本的檢測均按照以上流程進行。模擬糞便標本制備：挑取黃豆大小正常糞便標本于1.5 mL EP管中，加1 mL生理鹽水稀釋，用10 μL接種環(huán)挑取0.5麥氏濁度單位027型標準菌株菌懸液于糞便稀釋液中(約相當(dāng)于106菌量)，震蕩混勻，制成模擬糞便標本。

1.4 艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)法 根據(jù)美國醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會(SHEA)和美國感染病學(xué)會(IDSA)指南[6]，選擇艱難梭菌產(chǎn)毒培養(yǎng)作為Xpert方法評估的金標準，艱難梭菌培養(yǎng)陽性并且其tcdA和(或)tcdB基因陽性定義為產(chǎn)毒培養(yǎng)陽性。培養(yǎng)時將收集的稀便標本接種2塊哥倫比亞血瓊脂平板，其中一塊平板和厭氧指示劑同時放入?yún)捬醮鼉?nèi)，置于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h；另一塊直接置于35 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h。細菌鑒定采用生物梅里埃公司的Vitek 2 Compact儀器和配套的ANC厭氧菌鑒定卡，并按說明書進行操作。菌株的毒素基因鑒定采用實驗室自建tcdA和tcdB基因PCR檢測技術(shù)[7]。

1.5 A/B毒素酶聯(lián)熒光免疫檢測 采用生物梅里埃公司的VIDAS系統(tǒng)和CDAB試劑盒，并按說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 以產(chǎn)毒培養(yǎng)為金標準，用SPSS 21軟件計算敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值。并將Xpert艱難梭菌檢測結(jié)果與產(chǎn)毒培養(yǎng)法、VIDAS檢測A/B毒素法檢測結(jié)果分別作一致性檢驗。以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方法比較 43例標本共分離培養(yǎng)艱難梭菌11株，且產(chǎn)毒培養(yǎng)法鑒定均為A/B毒素基因雙陽性產(chǎn)毒株，其余32例培養(yǎng)陰性。Xpert艱難梭菌檢測法結(jié)果為12例陽性，31例陰性，未發(fā)現(xiàn)027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒流行株，見表1。以產(chǎn)毒培養(yǎng)法為金標準，Xpert艱難梭菌檢測法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為90.9%、93.8%、83.3%和96.8%。Xpert艱難梭菌檢測法和產(chǎn)毒培養(yǎng)法比較，一致性檢驗Kappa值為0.822(P<0.05)。

表1 Xpert艱難梭菌檢測法結(jié)果

43例標本經(jīng)VIDAS系統(tǒng)CDAB試劑盒定量檢測艱難梭菌A/B毒素，結(jié)果4例陽性，39例陰性，和Xpert艱難梭菌檢測法比較，一致性檢驗結(jié)果為Kappa值為0.419(P<0.05)，見表2。

表2 Xpert艱難梭菌檢測法與VIDAS系統(tǒng)CDAB檢測法一致性檢驗

Xpert艱難梭菌檢測法VIDAS系統(tǒng)A/B毒素法陽性陰性總數(shù)陽性4812陰性03131總數(shù)43943

2.2 模擬糞便標本檢測結(jié)果 Xpert檢測系統(tǒng)檢測實驗室自配ATCC BAA-1870模擬糞便標本，報告結(jié)果為tcdB、tcdC和Binary Toxin基因陽性，統(tǒng)計過程控制(statistical process control, SPC)顯示在控，并預(yù)測該菌株為027型高產(chǎn)毒力菌株，見圖1。

圖1 Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)鑒定027型艱難梭菌的陽性曲線

3 討論

艱難梭菌是院內(nèi)感染性腹瀉最常見的病原菌，快速檢測是臨床診治和感染控制的關(guān)鍵。盡管產(chǎn)毒培養(yǎng)法敏感性和特異性都很高，但厭氧培養(yǎng)和細菌鑒定設(shè)備和技術(shù)要求高，且報告周期長(48～72 h)，臨床推廣使用困難[1]。本研究所評價的Xpert艱難梭菌商品化檢測系統(tǒng)直接檢測臨床糞便標本，除5 min左右的樣本前處理操作外，其余檢測均一站式解決，耗時只需要45 min。研究結(jié)果顯示，Xpert艱難梭菌檢測系統(tǒng)和產(chǎn)毒培養(yǎng)法比較的敏感性和特異性均高于90%，2種方法存在較高的一致性，與國外研究結(jié)果一致[3-4]。當(dāng)與VIDAS免疫法毒素檢測系統(tǒng)比較時，2種方法的結(jié)果一致性差(Kappa=0.419)，這與免疫法檢測A/B毒素的敏感性和特異性顯著低于毒素基因的分子檢測技術(shù)有關(guān)。因此建議免疫法檢測艱難梭菌A/B毒素應(yīng)和高敏感性谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase,GDH)試驗結(jié)合，實現(xiàn)毒素定量檢測的同時，降低毒素免疫學(xué)檢測的假陰性[8]。本研究通過模擬標本驗證了Xpert艱難梭菌系統(tǒng)檢測027型高產(chǎn)毒株的性能，該性能有助于實驗室常規(guī)監(jiān)測027/NAP1/BI型高產(chǎn)毒株，提升醫(yī)院感染控制和預(yù)防高產(chǎn)毒株暴發(fā)流行的能力[4,9]。

本研究標本量偏少，11例陽性分離株均為產(chǎn)毒株，未分離到非產(chǎn)毒株，對于評價Xpert艱難梭菌系統(tǒng)在產(chǎn)毒株鑒別方面尚存不足。而臨床不產(chǎn)毒艱難梭菌在成人和兒童腸道定植菌中均有存在，有報道2歲以下兒童不產(chǎn)毒艱難梭菌定植率高達26.5%[10]。Xpert艱難梭菌系統(tǒng)主要通過檢測tcdB

基因來診斷產(chǎn)毒艱難梭菌感染，臨床產(chǎn)毒株的毒素基因型絕大部分是tcdA+tcdB+型，少數(shù)表現(xiàn)為tcdA-tcdB+，尚未發(fā)現(xiàn)tcdA+tcdB-型艱難梭菌。因此，Xpert艱難梭菌系統(tǒng)的檢測模式符合臨床需求，可以用于臨床艱難梭菌感染的快速診斷，且可以預(yù)警027型高產(chǎn)毒株的流行。

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(本文編輯：周萬青，劉群)

Clinical application evaluation of Xpert detection system ofClostridiumdifficile

HUANGXu,LIUCheng-cheng,XUTing,TANGChen-jie,XIAWen-ying,NIFang,WANGFang,LIUGen-yan

(DepartmentofLaboratoryMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,Jiangsu,China)

Objective To evaluate the clinical application value of Xpert detection system ofClostridiumdifficile(C.difficile). Methods A total of 43 stool specimens from the patients with diarrhea were collected, andC.difficilein stool specimens were detected by the Xpert detection system, the toxigenic culture method, and the toxin detection method which detected the toxin ofC.difficileby VIDAS automatic analyzer after anaerobic culture, respectively. The analytic performance of Xpert detection system was evaluted based on the toxigenic culture method as the gold standard. Meanwhile, the consistency of the results from different detection methods was compared. The ribotype 027 strain (ATCC BAA-1870) simulating the stool specimen was further used to verify the Xpert detection system. Results Based on the gold standard of the toxigenic culture method, the sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value of the Xpert detection system were 90.9%, 93.8%, 83.3% and 96.8%, respectively. The Kappa values for the consistency between the Xpert detection system and the toxigenic culture method or the toxin detection method were 0.822 (P<0.05) and 0.419 (P<0.05), respectively. Moreover, the ribotype 027 strain simulating the stool specimen was verified by the Xpert detection system successfully. Conclusion The Xpert detection system may rapidly and accurately detect theC.difficilein stool specimens, especially the ribotype 027 strain with high toxicity.

Clostridiumdifficile; Xpert detection system ofClostridiumdifficile; toxigenic culture

10.13602/j.cnki.jcls.2017.01.09

江蘇省“興衛(wèi)工程”實驗診斷學(xué)重點實驗室(XK201114);衛(wèi)生部腸道病重點實驗室(EM201401)。

黃旭，1991年生，女，碩士研究生，主要從事臨床微生物的分子診斷研究。

劉根焰，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：liugenyan@njmu.edu.cn。

R446.5

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2016-11-31)