垂穗披堿草對(duì)Cu2+，Zn2+脅迫的生理響應(yīng)

王傳旗， 付娟娟， 劉敏潔， 周青平， 苗彥軍

(1. 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院， 青海 西寧 810016； 2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院， 西藏 林芝 860000； 3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 陜西 楊凌 712100； 4. 西南民族大學(xué)，四川 成都 610041)

隨著錳、鉛、銅、鋁等金屬礦產(chǎn)資源的開(kāi)采和利用，我國(guó)在醫(yī)療、航天等領(lǐng)域得到了快速發(fā)展，但是帶來(lái)了當(dāng)?shù)氐闹亟饘傥廴締?wèn)題。金屬離子可對(duì)礦區(qū)周邊土壤、空氣、水體甚至植被產(chǎn)生污染，進(jìn)而危害動(dòng)物和人類(lèi)的身體健康。因此，對(duì)重金屬污染的治理研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。西藏中部礦產(chǎn)資源豐富，銅的儲(chǔ)量居全國(guó)第2位[1]。銅雖然是植物生長(zhǎng)所必需的微量元素，但過(guò)量的銅會(huì)使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，抑制植物生長(zhǎng)[2-3]。鋅也是植物生長(zhǎng)所必需的微量元素，但土壤中Zn2+含量過(guò)多時(shí)，也會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用[4-5]。由于以往對(duì)西藏中部礦區(qū)的不合理開(kāi)采，使得礦區(qū)周邊的土壤、水體和植被受到了不同程度的金屬污染，也給當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境造成了較大的影響。在藏中礦區(qū)周邊的污染土壤中，銅和鋅常作為共存體對(duì)植物產(chǎn)生危害作用[6]。西藏地處高原，外來(lái)植物難以適應(yīng)高原環(huán)境。因此，需要發(fā)掘鄉(xiāng)土植物對(duì)藏中污染的土壤和植被進(jìn)行修復(fù)。

植物修復(fù)技術(shù)是通過(guò)植物根系將土壤中的重金屬元素吸收到植物的地上部分，然后將其收獲并將它們無(wú)害化處理[7-10]。該技術(shù)可避免當(dāng)?shù)丨h(huán)境的二次污染，且成本較低，已成為我國(guó)重金屬污染修復(fù)的研究熱點(diǎn)[11-12]。有關(guān)牧草耐金屬脅迫的研究，國(guó)內(nèi)己有一些報(bào)道：趙玉紅等[13]研究認(rèn)為銅對(duì)珠芽蓼(PolygonumviviparumL.)幼苗生長(zhǎng)的抑制作用比鋅更顯著；宣毓龍等[14]研究表明低濃度的鋅有利于黑小麥(SecalecerealeL.)種子萌發(fā)；徐雅梅等[15]研究表明Mn2+，Pb2+脅迫對(duì)垂穗披堿草胚根及胚芽均具有抑制作用。鑒于藏中礦區(qū)土壤污染狀況，本試驗(yàn)選擇當(dāng)?shù)乜鼓嫘暂^強(qiáng)的垂穗披堿草為研究對(duì)象，測(cè)定了垂穗披堿草在Cu2+，Zn2+處理下的相關(guān)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果可為研究垂穗披堿草對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生垂穗披堿草種子采自西藏那曲市巴青縣地區(qū)(31°53′57″ N，93°10′44″ E，海拔4 675 m)，之后在西藏農(nóng)牧學(xué)院牧草試驗(yàn)基地(29°40′26″ N，94°20′30″ E，海拔2 999 m)進(jìn)行馴化選育。試驗(yàn)材料為野生馴化品系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取健康的種子，用70%的無(wú)水乙醇溶液消毒2 min，之后用超純水沖洗干凈，晾干備用[16]。重金屬離子濃度及范圍依據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618-2008)進(jìn)行設(shè)定。試驗(yàn)使用的金屬離子：ZnSO4·7H2O和CuSO4·5H2O均為分析純。其溶液濃度分別為：Cu2+(20，40，80，160，300 mg·L-1)，Zn2+(200，300，500，700，900 mg·L-1)，以超純水為對(duì)照(CK)。

種子萌發(fā)在RXZ智能光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。培養(yǎng)皿內(nèi)鋪雙層濾紙，排25粒種子，4次重復(fù)，并分別加入配制好的Cu2+，Zn2+溶液8 mL[17]。發(fā)芽條件為20℃/30℃，12 h/12 h(低溫/高溫)，12 h/12 h(黑暗/光照)，光照強(qiáng)度4 000 Lx[18]。試驗(yàn)周期為15 d，期間每隔2 d用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)重并使用超純水補(bǔ)充水分，使溶液濃度保持不變[18]。以芽長(zhǎng)超過(guò)種子本身長(zhǎng)度的1/2作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù)[15]。第5 d統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)。第15 d統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率并測(cè)定芽長(zhǎng)、根長(zhǎng)及葉綠素、丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率值。

1.2.2測(cè)定指標(biāo)方法 發(fā)芽率(Germination percentage)=(發(fā)芽種子數(shù)/100)×100%；發(fā)芽勢(shì)(Germination vigor)=(5 d內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/100)×100%；根長(zhǎng)(Root length)和芽長(zhǎng)(Bud length)的測(cè)定：從每個(gè)濃度的培養(yǎng)皿內(nèi)隨機(jī)取20 株幼苗，用直尺測(cè)量，取平均值[19]。葉綠素含量測(cè)定采用丙酮浸提法[20]，細(xì)胞質(zhì)膜透性測(cè)定采用電導(dǎo)儀法，丙二醛含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用Tukey’s HSD檢驗(yàn)，對(duì)各處理的差異進(jìn)行比較(P<0.05)。使用線性回歸方程用來(lái)確定相關(guān)指標(biāo)與金屬脅迫之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+，Zn2+對(duì)種子萌發(fā)的影響

隨著Cu2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)表現(xiàn)為下降趨勢(shì)(表1)，且Cu2+溶液濃度越高，抑制作用越顯著。160 mg·L-1Cu2+處理下，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均顯著下降(P<0.05)。300 mg·L-1Cu2+處理下，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均受到了極顯著抑制(P<0.01)。

隨著Zn2+溶液濃度的升高，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)(表2)。200 mg·L-1Zn2+處理下，種子發(fā)芽率高于對(duì)照組，但差異不顯著。500 mg·L-1Zn2+處理下，種子發(fā)芽率顯著下降(P<0.05)。700 mg·L﹣1Zn2+處理下，種子發(fā)芽勢(shì)下降顯著(P<0.05)。

Cu2+，Zn2+離子脅迫對(duì)垂穗披堿草根和芽的生長(zhǎng)影響較大(圖1、圖2)。垂穗披堿草根長(zhǎng)隨Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高呈先升后降趨勢(shì)。20 mg·L-1Cu2+處理下，根長(zhǎng)略高于對(duì)照組，之后隨著Cu2+溶液濃度的升高表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。80 mg·L-1Cu2+處理組與對(duì)照組相比，根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)均顯著下降(P<0.05)。

與Cu2+處理變化相似，垂穗披堿草種子在200 mg·L-1Zn2+處理下其根長(zhǎng)高于對(duì)照，但差異不顯著，之后隨著Zn2+溶液濃度的升高而表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。900 mg·L-1Zn2+處理下，垂穗披堿草芽長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；Zn2+≥700 mg·L-1處理下的根長(zhǎng)與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

表1 Cu2+對(duì)種子萌發(fā)影響Table 1 Effects of Cu2+ on the seed germination

注：同行中，不同小寫(xiě)字母差異顯著(P<0.05)，不同大寫(xiě)字母差異極顯著(P<0.01)。下同

Note:In the same row,different lowercase letters represent significant differences at the 0.05 level,different capital letters represent significant differences at the 0.01 level.The same as below

表2 Zn2+對(duì)種子萌發(fā)影響Table 2 Effects of Zn2+ on the seed germination

圖1 Cu2+對(duì)垂穗披堿草根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響Fig.1 Effects of Cu2+ on the root lengthand shoot length of Elymus nutans

圖2 Zn2+對(duì)垂穗披堿草根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of Zn2+ on the root length andshoot length of Elymus nutans

2.2 Cu2+，Zn2+對(duì)幼苗葉片生理指標(biāo)的影響

隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高，幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b含量不斷下降(表3、表4)。與對(duì)照組相比，80 mg·L-1Cu2+和500 mg·L-1Zn2+溶液濃度處理下垂穗披堿草幼苗葉片葉綠素a和葉綠素b含量下降顯著(P<0.05)。300 mg·L-1Cu2+和900 mg·L-1Zn2+處理下，葉綠素a和葉綠素b含量均達(dá)到了最低水平，較對(duì)照組分別降低了10.97 mg·L-1，7.95 mg·L-1和10.15 mg·L-1，7.61 mg·L-1。通過(guò)線性回歸分析可知，Cu2+溶液濃度與葉片葉綠素a和葉片葉綠素b含量的關(guān)系分別為y=—2.13x+13.81(R2=0.94)，y=—1.65x+11.43(R2=0.99)；Zn2+溶液濃度與葉片葉綠素a和葉片葉綠素b含量的關(guān)系分別為y=-1.18x+13.55(R2=0.92)，y=-1.01x+10.08(R2=0.95)。

垂穗披堿草幼苗葉片MDA含量隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高呈上升趨勢(shì)。通過(guò)線性回歸分析可知，Cu2+溶液濃度與葉片MDA含量的關(guān)系為y=6.05x-0.7(R2=0.95)；Zn2+溶液濃度與葉片MDA含量的關(guān)系為y=3.76x-1.84(R2=0.99)。

幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率值隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高而增大。當(dāng)Cu2+溶液濃度為80 mg·L-1和Zn2+溶液濃度為500 mg·L-1時(shí)，葉片相對(duì)電導(dǎo)率值與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；300 mg·L-1Cu2+和900 mg·L-1Zn2+處理下，幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率值均達(dá)到了最高水平。通過(guò)線性回歸分析可知，Cu2+溶液濃度與葉片相對(duì)電導(dǎo)率的關(guān)系為y=5.89x+2.8(R2=0.98)；Zn2+溶液濃度與葉片相對(duì)電導(dǎo)率的關(guān)系為y=3.41x+3.14(R2=0.99)。

表3 Cu2+對(duì)幼苗葉片生理指標(biāo)的影響Table 3 Effects of Cu2+ on Physiological Indexes of seedling Leaves

表4 Zn2+對(duì)幼苗葉片生理指標(biāo)的影響Table 4 Effects of Zn2+ on Physiological Indexes of seedling Leaves

3 討論

研究表明，低濃度金屬溶液對(duì)牧草有促進(jìn)作用而高濃度金屬溶液則對(duì)牧草有抑制作用[21-22]。本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，隨著Zn2+溶液濃度的升高，種子發(fā)芽率呈先升后降趨勢(shì)，其中200 mg·L-1的Zn2+溶液對(duì)垂穗披堿草種子發(fā)芽率具有促進(jìn)作用?？赡苁且欢舛鹊腪nSO4刺激了種子內(nèi)部的酶系統(tǒng)，提高了種子的活力。這與于鳳鳴等[23]鋅對(duì)高羊茅(Festucaelata)種子萌發(fā)及生理指標(biāo)的影響研究結(jié)果相似。當(dāng)Zn2+溶液濃度高于300 mg·L-1時(shí)，垂穗披堿草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，可能是ZnSO4使種子內(nèi)部酶活力下降甚至死亡從而降低了種子的萌發(fā)數(shù)。垂穗披堿草對(duì)Cu2+脅迫是比較敏感的。隨著Cu2+溶液濃度的升高，垂穗披堿草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均出現(xiàn)了不同程度的下降現(xiàn)象。可能是銅的富集作用使種子萌發(fā)所需物質(zhì)和能量的供應(yīng)受阻，從而降低了種子萌發(fā)率[24]。

20 mg·L-1Cu2+和200 mg·L-1Zn2+處理下的垂穗披堿草種子根長(zhǎng)略長(zhǎng)于對(duì)照組，但差異不顯著，表明輕度金屬脅迫下，垂穗披堿草將更多的生物量、養(yǎng)分等資源集中于根部生長(zhǎng)。這是垂穗披堿草對(duì)外界金屬脅迫環(huán)境的適應(yīng)性調(diào)節(jié)反應(yīng)，對(duì)于其在適應(yīng)輕度金屬污染的土壤環(huán)境具有重要意義。Cu2+，Zn2+脅迫抑制了垂穗披堿草芽的伸長(zhǎng)，且隨著Cu2+，Zn2+脅迫的增強(qiáng)，抑制作用越大?？赡苁歉邼舛扰囵B(yǎng)液使大量Cu2+，Zn2+富集在垂穗披堿草根部，抑制了根的伸長(zhǎng)，最終影響到整個(gè)植株的生長(zhǎng)[25]。

葉綠素含量是反映植物和逆境關(guān)系的重要指標(biāo)，且正常情況下與脅迫程度呈負(fù)相關(guān)[26-27]。本試驗(yàn)中，幼苗葉片葉綠素a和b均隨Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高而降低。這與多人研究結(jié)果相類(lèi)似[28-29]。Cu2+，Zn2+金屬脅迫使幼苗葉片葉綠素含量下降的機(jī)理尚未明確，可能是金屬毒害離子抑制了葉綠體內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致葉綠素含量下降；也可能是Cu2+，Zn2+離子毒害使葉片產(chǎn)生過(guò)多自由基直接導(dǎo)致葉綠素分子結(jié)構(gòu)破壞[30]。

相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量是鑒別植物細(xì)胞膜破壞程度的重要指標(biāo)。本研究表明，隨著Cu2+，Zn2+溶液濃度的升高，幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量持續(xù)上升。可能是因?yàn)楦邼舛鹊腃u2+，Zn2+脅迫使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的一些可溶性物質(zhì)外滲，增大了膜的滲透性[31]。

4 結(jié)論

Cu2+離子脅迫抑制了垂穗披堿草種子萌發(fā)，并對(duì)其根和芽的伸長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。低濃度的Zn2+脅迫對(duì)種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，且在200 mg·L-1Zn2+處理下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)及胚根長(zhǎng)等均達(dá)到了最優(yōu)值；500 mg·L-1