三七皂苷改善狼瘡腎炎小鼠激素耐藥狀態(tài)及脂代謝紊亂的作用研究

徐崢 丁偉森 魯盈

狼瘡腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡最為常見和最為嚴重的并發(fā)癥，具有病程長、易反復且并發(fā)癥多的特點。糖皮質(zhì)激素是治療狼瘡性腎炎的一線藥物，但部分患者對激素治療不敏感，且由于激素和疾病本身帶來的心血管疾病風險，患者往往會出現(xiàn)脂代謝紊亂的狀態(tài)，很大程度上影響其生活質(zhì)量及遠期生存。以往在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)使用三七制劑聯(lián)合激素治療狼瘡腎炎的療效優(yōu)于單純使用激素，推測三七具有逆轉激素耐藥的作用[1]。筆者對三七皂苷改善狼瘡腎炎小鼠激素耐藥狀態(tài)及脂代謝紊亂的作用作了進一步研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 NZB/WF1狼瘡腎炎小鼠36只，16周齡，雌雄各半，體重20～30g，委托南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院從美國Jackson實驗室引進；正常健康ICR小鼠6只，16周齡，雌雄各半，體重20～25g，由浙江省中醫(yī)藥研究院動物實驗中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 三七總皂苷（凍干粉，100mg/支，國藥準字Z20025652，批號14071610，廣西梧州制藥股份有限公司）；甲潑尼龍片（4mg/片，進口藥品注冊證號H20110064，批號 X836A，Pfizer Italia Srl公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ-siRNA（凍干粉，1OD分裝，按比例溶于DEPC水后使用）、沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT）1-siRNA（凍干粉，1OD分裝，按比例溶于DEPC水后使用）及陰性對照（無沉默SIRT1基因作用序列，凍干粉，1OD分裝）委托上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。主要儀器：HITACHI7600生化分析儀；Beckman3通道流式細胞儀；Bio-rad蛋白電泳系統(tǒng)。

1.3 建模及分組藥物處理 所有小鼠均予高脂飼料（在普通飼料中加入15%脂肪、1.25%膽固醇和0.5%粗鹽）喂養(yǎng)。6只狼瘡腎炎小鼠設為A組，另30只按0.8mg/kg甲強龍（4mg溶于50ml的0.9%氯化鈉溶液中）1次/d連續(xù)灌胃4周誘導激素耐藥，建立激素耐藥模型，繼續(xù)灌胃4周維持并按隨機數(shù)字表法分為5組，每組6只。A組予0.9%氯化鈉溶液約0.8ml、1次/d灌胃8周；B組為激素耐藥模型組，僅予甲強龍灌胃8周；C組為SIRT1-siRNA組，予甲強龍灌胃8周，同時在第4、6、8 周尾靜脈各注射 SIRT1-siRNA（14.286μg/10g）1次；D組為SIRT1-siRNA陰性對照組，予甲強龍灌胃8周，同時第5周開始每周注射SIRT1-siRNA陰性對照（14.286μg/10g）1次；E組為低劑量三七皂苷組，予甲強龍灌胃8周，同時第5周開始腹腔注射三七皂苷50mg/kg（200mg溶于40ml的0.9%氯化鈉溶液中），1次/d；F組為高劑量三七皂苷組，予甲強龍灌胃8周，同時第5周開始腹腔注射三七皂苷100mg/kg，1次/d。另將6只ICR小鼠設為G組，予0.9%氯化鈉溶液約0.8ml灌胃8周，1次/d。在給藥過程中，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、被毛亮澤度、反應性、活動度、體重增減、飲水和進食等情況，記錄有無死亡情況發(fā)生。

1.4 尿糖水平檢測 在實驗前、中（第4周）、后（第8周結束前1d）留取小鼠24h尿液樣本，采用班氏法檢測尿糖水平。

1.5 腎功能及血脂水平檢測 給藥8周后處死小鼠并采集血液標本，使用全自動生化分析儀測定小鼠血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）水平。

1.6 血C反應蛋白（CRP）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）水平檢測 采用ELISA法檢測小鼠上述血液標本CRP、eNOS表達水平，具體操作按試劑盒說明書步驟進行。

1.7 腹主動脈內(nèi)皮細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。剖取小鼠腹主動脈（約0.5cm長），分離周圍脂肪組織，分別以一型膠原酶、胰蛋白酶孵育，收集解離的動脈內(nèi)皮細胞；使用BDannexinV、PI雙染試劑盒檢測內(nèi)皮細胞凋亡率。早期凋亡提示細胞非正常死亡，晚期凋亡提

示細胞正常死亡。凋亡率為早期凋亡與晚期凋亡之和。1.8 肝臟細胞PPARγ、SIRT1 mRNA表達水平檢測處死小鼠后打開腹腔，分離小鼠肝臟，分裝于EP管中，置于-80℃冰箱凍存。取凍存的小鼠肝臟組織100mg，研磨成粉末狀。按照日本Takara公司RNAiso Plus提取小鼠肝組織總RNA并進行純度檢測、反轉錄，采用RTPCR法檢測PPARγ、SIRT1 mRNA表達水平。

1.9免疫共沉淀檢測 取凍存的小鼠肝組織，提取蛋白，加入SIRT1 IP一抗，搖動孵育，proteinA/G plus-agarose捕捉抗原抗體復合物，沸水浴游離抗原、抗體、瓊脂糖珠，取上清液，采用Western blot法檢測PPARγ蛋白表達。若檢測到PPARγ蛋白表達，提示PPARγ與SIRT1之間存在互相作用。

1.10 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內(nèi)各時段比較采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 7組小鼠不同實驗時段的尿糖水平比較 實驗后，A、C、D組小鼠尿糖水平較實驗前均明顯升高（P＜0.05）；與G組比較，A、D組尿糖水平均明顯升高（均P＜0.05）；與A組比較，C、E、F組尿糖水平均明顯降低（均P＜0.05）；C、E、F 組間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 7組小鼠不同實驗時段的尿糖水平比較（mmol/L）

2.2 7組小鼠腎功能檢測結果比較 7組小鼠Scr及BUN水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與G組比較，A、B、C、D組小鼠Scr水平均明顯升高（均P＜0.05），C、D、E、F組BUN水平亦明顯升高（均P＜0.05）；與A組比較，D、E、F組BUN水平均明顯升高（均P＜0.05）；與B組比較，D組BUN水平明顯升高（P＜0.05），見表2。

表2 7組小鼠腎功能檢測結果比較

2.3 7組小鼠血脂水平比較 7組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與G組比較，其他6組小鼠上述4項血脂水平均明顯升高（均P＜0.05）；與 A、B 組比較，C、E、F 組 TC、TG、LDL-C水平均明顯降低（均P＜0.05）；與C組比較，E、F組TG水平均明顯降低（均P＜0.05），見表3。

表3 7組小鼠血脂水平比較

2.4 7組小鼠血CRP、eNOS水平比較 7組小鼠血CRP、eNOS水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與G組比較，其余6組小鼠血CRP水平均明顯升高（均P＜0.05），其中 C、E、F 組低于 A、B 組（均P＜0.05）。C、D、E、F組小鼠eNOS水平與A、B組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表4。

2.5 7組小鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞凋亡率比較 7組小鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞早期凋亡率、晚期凋亡率和凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；其中B組晚期凋亡率較A組明顯升高，C組凋亡率較E、F組降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表5。G組小鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞并不表現(xiàn)為凋亡狀態(tài)，其余各組小鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞均呈有不同程度的凋亡，以A、B、D組凋亡最明顯，見圖1。

表4 7組小鼠血CRP、eNOS水平比較

表5 7組小鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞凋亡率比較（%）

圖1 7組小鼠腹主動脈內(nèi)皮細胞凋亡率的流式細胞圖

2.6 7組小鼠肝臟組織PPARγ、SIRT1 mRNA表達水平比較 7組小鼠肝臟組織PPARγ、SIRT1 mRNA表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與C組比較，A、B組SIRT1 mRNA表達水平均明顯升高（均P＜0.05），PPARγ mRNA 表達水平均明顯降低（均P＜0.05）；與B組比較，C、E、F組SIRT1 mRNA表達水平均明顯下降（均P＜0.05），PPARγ mRNA表達水平均明顯升高（均P＜0.05），見表 6。

2.7 PPARγ與SIRT1之間的互相作用 凍存的小鼠肝組織提取蛋白后進行免疫共沉淀檢測，結果顯示主要存在于細胞核內(nèi)的SIRT1與主要存在于胞質(zhì)的PPARγ存在互相作用，見圖2。

3 討論

本研究結果顯示7組小鼠尿糖水平升高，提示狼瘡腎炎小鼠在實驗結束后出現(xiàn)一定程度的代謝紊亂狀態(tài)，或基礎存在的腎臟損害加重；而SIRT1-siRNA和三七皂苷具有一定的改善脂代謝及腎臟保護作用。血生化檢查提示激素誘導耐藥后，狼瘡腎炎小鼠體內(nèi)本身存在的脂代謝紊亂加重，SIRT1-siRNA和低、高劑量三七皂苷均有降血脂、改善脂代謝的作用。血CRP、eNOS水平檢測結果提示狼瘡腎炎小鼠體內(nèi)存在慢性炎癥狀態(tài)，而使用三七皂苷能起到一定程度的抗炎作用。內(nèi)皮細胞凋亡檢測提示狼瘡腎炎小鼠動脈內(nèi)皮細胞大量死亡，內(nèi)皮功能受損，預示著動脈粥樣硬化的發(fā)生；而使用三七皂苷后表現(xiàn)出與SIRT1-siRNA類似的保護血管內(nèi)皮的作用，其中高劑量的療效更明顯。

表6 7組小鼠肝臟組織PPARγ、SIRT1 mRNA表達水平比較

圖2 狼瘡腎炎小鼠肝組織SIRT1與PPARγ之間相互作用的電泳圖

PPAR是一種Ⅱ型核激素受體，參與調(diào)控脂肪前體細胞分化的多個基因轉錄，主要與脂肪細胞分化[2]、脂類代謝[3]和血管病變[4]等有關。SIRT1是SIRT家族的7種同源體之一，參與調(diào)節(jié)核糖體DNA重組、基因沉默、DNA修復等重要生理過程[5]。近年來針對PPARγ與SIRT1的關系研究較多。Cao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ/SIRT1反饋環(huán)路在人膀胱癌的細胞周期代謝中發(fā)揮作用。另一項研究結果顯示，肝星狀細胞脂代謝中SIRT1還受到PPARγ的反饋性調(diào)節(jié)[7]。本研究以小劑量甲潑尼龍誘導狼瘡腎炎小鼠產(chǎn)生激素耐藥后，肝組織內(nèi)SIRT1表達升高，PPARγ表達下降；以SIRT1-siRNA干預后，PPARγ表達升高，結合免疫共沉淀檢測結果，證實狼瘡腎炎小鼠體內(nèi)存在SIRT1/PPARγ負性反饋作用。我們的前期研究證實，三七皂苷能通過調(diào)控SIRT1/FoxO1/MDR1mRNA通路影響P-糖蛋白表達，起到改善狼瘡腎炎激素耐藥的作用[8]。本研究低、高劑量三七皂苷處理后的小鼠SIRT1表達下調(diào)，PPARγ表達上調(diào)，在證實前期研究結果的同時，也提示SIRT1、PPARγ間反饋環(huán)路的存在。

本研究結果顯示狼瘡腎炎小鼠血脂水平高于正常小鼠，提示體內(nèi)本身已存在脂代謝紊亂。使用SIRT1-siRNA干預后，血LDL-C水平下降，提示SIRT1可影響體內(nèi)脂質(zhì)代謝。SIRT1活性缺失時，LDL的生成減少或分解增多，血中游離的脂質(zhì)成分減少（可能由于極低密度脂蛋白異化形成LDL以及肝臟合成LDL減少）。有研究表明，脂肪細胞中SIRT1表達上調(diào)，可抑制PPARγ活性和脂質(zhì)累積[9]；而下調(diào)SIRT1表達水平和活性，則能上調(diào)PPARγ表達，降低脂肪細胞外TG，促進小鼠外周血脂肪酸氧化分解[10]。這說明SIRT1/PPARγ通路的激活能降低血TC及LDL-C水平，對維持機體的脂類代謝平衡具重要作用。相關研究表明，PPARγ具有防止動脈粥樣硬化的作用，主要表現(xiàn)為抑制炎癥反應和調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增生和遷移[11-12]。SIRT1具有改善血管內(nèi)皮功能、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊的作用[13]，該作用是通過抑制VCAM表達、抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化和抗氧化應激反應實現(xiàn)的[14-15]。PPARγ與SIRT1均有抗炎、抗動脈粥樣硬化的作用，但兩者間存在負反饋調(diào)節(jié)效應，因此筆者推測在動脈粥樣硬化的病理過程中，兩者存在協(xié)同的保護作用，PPARγ/SIRT1表達的平衡對延緩動脈粥樣硬化進程具有積極意義。本研究中，狼瘡腎炎小鼠體內(nèi)血CRP水平較正常小鼠升高，SIRT1-siRNA干預后，CRP水平降低，說明狼瘡腎炎小鼠體內(nèi)存在慢性炎癥狀態(tài)，SIRT1活性被抑制后，炎癥減輕，分析可能原因是PPARγ表達上調(diào)后，由其介導的抗炎癥反應亦得到強化所致。

綜上所述，三七皂苷通過對PPARγ/SIRT1通路的調(diào)控作用起到改善狼瘡小鼠激素耐藥及脂代謝紊亂狀態(tài)的雙重效應。