固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)白苞蒿揮發(fā)性有機(jī)物

林 霞

(福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福建福州350002)

白苞蒿(Artemisia lactifloraWall.ex DC.)為菊科(Compositae)蒿屬(Artemisia)的多年生草本植物。白苞蒿是重要藥用植物，是中藥劉寄奴的基原植物之一，被收載于《中國(guó)藥典》2015年版(國(guó)家藥典委員會(huì)，2015)。白苞蒿具有清熱解毒，止咳消炎，活血，健胃等功效，用于治療肝、腎疾病，也用于治療血絲蟲病(肖美添等，2011)，另外其揮發(fā)油對(duì)于治療喘息型慢性氣管炎有特殊療效(萬(wàn)阜昌等，1983；江洪如，1989)。

由于白苞蒿具備重要應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)研究者們陸續(xù)開展了對(duì)其化學(xué)成分的研究。在成分研究方面，主要采用了溶劑提取(肖美添等，2011；夏亮銪等，2011)和水蒸氣蒸餾提取(周萬(wàn)鏡等，2011)等前處理方式。肖美添等(2011)從白苞蒿乙醇提取物的氯仿萃取部分分離得到12個(gè)化合物，為黑麥草內(nèi)酯，異香草酸，二氫異阿魏酸等。夏亮銪等(2011)分析了白苞蒿石油醚提取物，分離出以酯類和萜類物質(zhì)為主的58個(gè)組分，包括了蓓半萜γ-內(nèi)酯，吉馬烯D等。周萬(wàn)鏡等(2011)采用水蒸氣蒸餾法提取白苞蒿揮發(fā)油，分離并鑒定出以萜類為主的64種組分，包括左旋薰衣草醇和吉馬烯D等。而采用固相微萃取法(solid-phase microextraction，SPME)作為樣本前處理，開展白苞蒿的揮發(fā)性有機(jī)物的研究，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

植物揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds，VOCs)是植物體內(nèi)次生代謝途徑合成的小分子化合物(Theis et al，2003)，具有很高的化學(xué)活性(蔣冬月等，2011)。開展植物揮發(fā)性有機(jī)物的研究，對(duì)植物種質(zhì)資源進(jìn)一步開發(fā)與利用具有重要意義。然而傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法，在提取揮發(fā)性有機(jī)物過(guò)程中，會(huì)造成小分子揮發(fā)物的損失。而固相微萃取法無(wú)需溶劑與前處理，能更好體現(xiàn)揮發(fā)物的真實(shí)組成(盧金清等，2013)，成為植物揮發(fā)物提取的重要方法之一。

本研究選用固相微萃取技術(shù)對(duì)白苞蒿花和葉的揮發(fā)性化合物進(jìn)行富集提取，通過(guò)GC-MS對(duì)揮發(fā)物進(jìn)行分離、鑒定，為白苞蒿的進(jìn)一步研究開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試植物

樣品采集時(shí)間為花期(2019年11月)，采集地為福建福州。選擇盆栽成年活體上健康無(wú)病蟲害無(wú)缺刻的鮮花和鮮葉作為試驗(yàn)材料。

1.2 儀器與試劑

本研究采用Agilent 7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)；HP-5MS色譜柱(美國(guó) Agilent公司)；萃取裝置有 SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄(美國(guó) Supleco公司)，65 μm PDMS/DVB(美國(guó)Supleco公司)、20 mL頂空瓶。

1.3 樣本制備

稱取新鮮白苞蒿鮮花、鮮葉各1 g，剪碎后置于密封的頂空瓶中待測(cè)。

1.4 樣品固相微萃取

萃取頭老化：SPME萃取頭采用65 μm PDMS/DVB，用丙酮浸泡30 min，把萃取頭置于250℃下老化0.5 h，收起萃取頭，準(zhǔn)備進(jìn)行樣品萃取。

樣本萃?。簩PME插入裝有樣本的頂空瓶，吸附20 min后收起針頭，準(zhǔn)備進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃，柱溫50℃，保持2 min，以4℃·min-1升到140℃，保持3 min，以7℃·min-1升到 230 ℃，保持 2 min，以 4 ℃·min-1升到 140 ℃，保持 3 min，以7℃·min-1升到230℃，以5℃·min-1升到270℃，以10℃·min-1升到280℃。SPME萃取頭于250℃解吸3 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI；采集模式為全掃描；EMV模式為相對(duì)值；質(zhì)量掃描范圍25.00～550.00 amu；閾值設(shè)為0；輔助加熱溫度280℃；MS離子源溫度230℃，MS四級(jí)桿溫度150℃。

1.6 定性和定量分析

檢測(cè)的化合物經(jīng)NIST05譜庫(kù)檢索，部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行鑒定。揮發(fā)性有機(jī)物相對(duì)含量采用峰面積歸一化法進(jìn)行計(jì)算，表示為各組分的峰面積占總峰面積之比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 白苞蒿花、葉揮發(fā)性有機(jī)物的GC-MS檢測(cè)

白苞蒿花、葉的揮發(fā)性有機(jī)物，總離子流圖如圖1所示。其中，白苞蒿花的揮發(fā)性化合物峰主要集中于9～16 min、22～32 min區(qū)間；而白苞蒿葉的揮發(fā)性化合物峰的分布也在9～16 min、22～32 min區(qū)間。

圖1 白苞蒿樣品揮發(fā)性有機(jī)物的總離子圖Figure 1 Total ion chromatography of A.lactiflora

2.2 白苞蒿花、葉高匹配揮發(fā)性有機(jī)物分析

數(shù)據(jù)與Nist05庫(kù)對(duì)比后，將與譜庫(kù)匹配度高于85%的成分定義為高匹配揮發(fā)性有機(jī)物。從白苞蒿樣本(花和葉)中共檢測(cè)出的高匹配揮發(fā)性有機(jī)物46種(表1)。其中，白苞蒿鮮花中高匹配揮發(fā)性有機(jī)物有33種，占其總香氣成分的91.00%；而鮮葉中高匹配成分有28種，占其總香成分的83.15%。

表1 白苞蒿花、葉中的高匹配揮發(fā)性有機(jī)物Table 1 High matching volatile organic compounds in the flowers and leaves of A.lactiflora

續(xù)表1Table 1(Continued)

2.3 白苞蒿花、葉高含量揮發(fā)性有機(jī)物分析

把相對(duì)含量高于5%的揮發(fā)性有機(jī)物，定位為高含量揮發(fā)性有機(jī)物。分析了白苞蒿樣本的高含量揮發(fā)性有機(jī)物(表2)，結(jié)果表明，白苞蒿花和葉的揮發(fā)物存著較大的相似度。

在白苞蒿花樣品中，檢測(cè)出高含量揮發(fā)物有7個(gè)，占其總揮發(fā)物相對(duì)含量的79.09%，其中相對(duì)含量最高的為 α-姜烯(39.03%)，其次為順式-羅勒烯(8.22%)和 1，2，3，4，4a，7-六氫-1，6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘(8.00%)等；而葉中高含量揮發(fā)物有7個(gè)，占其總揮發(fā)物的82.51%，含量最高的為順式-羅勒烯(19.31%)，其次為α-姜烯(17.53%)、和石竹烯(16.69%)等。

表2 白苞蒿花、葉中的高含量揮發(fā)性有機(jī)物Table 2 High content volatile organic compounds in the flowers and leaves of A.lactiflora

2.4 白苞蒿花、葉揮發(fā)性有機(jī)物分析對(duì)比

2.4.1 白苞蒿花、葉共有揮發(fā)性有機(jī)物分析 以花和葉的揮發(fā)性有機(jī)物為研究對(duì)象，討論白苞蒿不同器官共有的揮發(fā)物。兩者共有的揮發(fā)性有機(jī)物有15種，在白苞蒿花中，共有揮發(fā)物占其總揮發(fā)物相對(duì)含量的72.52%，而在葉片中，則占到了78.70%。這些共有的揮發(fā)性有機(jī)物分別為：α-姜烯、順式-羅勒烯、石竹烯、δ-杜松萜烯、Z，Z，Z-1，5，9，9-四甲基-1，4，7-環(huán)-十一碳三烯、(E)-β-金合歡烯、β-雙酚、β-月桂烯、α-蓽澄茄油烯、反式-β-羅勒烯、β-欖香烯、別羅勒烯、β-蓽澄茄油烯、大根香葉烯和2，6-二甲基-6-(4-甲基-3-戊烯基)雙環(huán)[3.1.1]七碳-2-烯。

2.4.2 白苞蒿花、葉特異揮發(fā)性有機(jī)物分析 白苞蒿的花和葉的揮發(fā)性有機(jī)物存在差異，但含量較共有的揮發(fā)物低。

白苞蒿花中存在特異性揮發(fā)物有18種，占其總相對(duì)含量的18.48%，包括了順式-β-法尼烯、芳樟醇、α-依蘭烯、α-古蕓烯、α-紅沒(méi)藥醇、石竹素-(13)、β-蒎烯、(-)-α-人參烯、(+)-γ-杜松烯、反式-α-佛手柑油烯、8-異丙烯 l-1，5-二甲基-1，5-二烯環(huán)十烷、1-(1，5-二甲基-4-hexenyl)-4-甲基-苯、α-蓽澄茄油烯、異戊酸順-3-己烯酯、α-廣藿香萜烯、1，2，3，4，4a，7-六氫-1，6-二甲基-4-(1-甲基乙基)萘、鄰苯二甲酸異丁酯和1-羥基-1，7二甲基-4-異丙基-2，7-環(huán)癸二烯。

白苞蒿葉中存在特異性揮發(fā)物有13種，占其總相對(duì)含量的4.45%，包括了萘、(-)-β-波旁烯、古巴烯、α-法尼烯、石竹烯氧化物、α-杜松萜烯、2-異丙基-5-甲基-9-亞甲基-雙環(huán)[4.4.0]-1-癸烯、1，5，5-三甲基-6-亞甲基-環(huán)己烯、1，2，4a，5，6，8a-六氫-4，7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-萘、(+)-雙環(huán)倍半水芹烯、橙花叔醇、3，4-二甲基-2，4，6-辛三烯和 2，4，5，6，7，7a-六氫化-4，4，7a-三甲基-1H-茚酚乙酸酯。

3 討論與結(jié)論

本研究以固相微萃取(SPME)技術(shù)作為前處理，富集提取白苞蒿揮發(fā)性有機(jī)物，再通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行分離和初步鑒定。分別從白苞蒿鮮花中檢測(cè)出的高匹配揮發(fā)性有機(jī)物(與NIST譜庫(kù)的匹配度＞85%)33種，占總香氣成分的91.00%；而白苞蒿鮮葉中高匹配揮發(fā)性有機(jī)物有28種，占總香氣成分的83.15%。，本試驗(yàn)檢測(cè)出的揮發(fā)物，與前期研究者們關(guān)于白苞蒿化合物的報(bào)道相符，包括了芳樟醇(周萬(wàn)鏡等，2011)，大根香葉烯(夏亮銪等，2011；周萬(wàn)鏡等，2011)，α-姜烯(夏亮銪等，2011；周萬(wàn)鏡等，2011；李子鴻等，2001)，δ-杜松萜烯(夏亮銪等，2011；周萬(wàn)鏡等，2011)，γ-杜松萜烯(周萬(wàn)鏡等，2011)，石竹烯氧化物(周萬(wàn)鏡等，2011；李子鴻等，2001)，橙花叔醇(周萬(wàn)鏡等，2011；李子鴻等，2001)，α-杜松萜烯(周萬(wàn)鏡等，2011)，β-蓽澄茄油烯(夏亮銪等，2011)，(E)-β-金合歡烯(夏亮銪等，2011；李子鴻等，2001)，古巴烯(李子鴻等，2001)和β-欖香烯(李子鴻等，2001)等。因此，固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(SPME-GC/MS)適合應(yīng)用在白苞蒿屬植物花和葉的揮發(fā)性有機(jī)物的檢測(cè)上。

通過(guò)對(duì)白苞蒿不同器官的揮發(fā)性有機(jī)物的異同進(jìn)行數(shù)據(jù)比對(duì)，結(jié)果表明：(1)花、葉中存在的共有成分為15種，各自占總揮發(fā)物相對(duì)含量的72.52%和78.70%，表明白苞蒿花和葉的揮發(fā)物存著較大的相似度，花和葉共有的揮發(fā)物包括了α-姜烯、順式-羅勒烯、石竹烯、δ-杜松萜烯等。(2)花、葉樣本中也存在特異性成分，但含量較低。在白苞蒿花中有18種特異性揮發(fā)物，占其總相對(duì)含量的18.48%，包括了順式-β-法尼烯、芳樟醇、α-依蘭烯等；而在葉中存著特異性揮發(fā)物有13種，占其總相對(duì)含量的4.45%，包括了萘、(-)-β-波旁烯、古巴烯等。

白苞蒿除藥用功能外，還具有其他生物活性，如抑制植物病原菌(郭恩輝等，2017)和抗氧化活性(邱麗花等，2018)等。白苞蒿丙酮提取物對(duì)黃瓜炭疽病的室內(nèi)藥效達(dá)56.41%(郭恩輝等，2017)；甲醇提取物清除羥自由基率達(dá)95.5%，具有較強(qiáng)的抗氧化活性(邱麗花等，2018)。白苞蒿所具備的生物活性，與其所分泌的次生代謝物密切相關(guān)。本研究中檢出物質(zhì)的部分功能如下：α-姜烯(花 39.03%，葉 17.53%)具有抗癌，抗氧化活性(陸小元，2015)；羅勒烯(花8.22%，葉19.31%)能誘導(dǎo)植物啟動(dòng)一系列防御機(jī)制，提高植物防御能力(Pichersky et al，2002；Kishimoto et al，2006；桂茜，2017)；石竹烯和大根香葉烯廣泛應(yīng)用于香料、食品和藥物合成(閻建輝等，2003)；欖香烯是一種抗癌成分，用于治療腦癌、肺癌和消化道腫瘤等(李斯等，2016)；芳樟醇具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性(姜冬梅等，2015)等。因此，白苞蒿還有很多功能未被人們認(rèn)知、挖掘和利用。

通過(guò)對(duì)揮發(fā)性化合物的分離與鑒定，為進(jìn)一步解析白苞蒿的生物活性提供數(shù)據(jù)支持，也為白苞蒿的研究、開發(fā)與利用提供參考。在試驗(yàn)中，氣候變化、水分，溫度，光照，土壤營(yíng)養(yǎng)、植株不同生長(zhǎng)階段，植株差異等因素，是否會(huì)對(duì)白苞蒿的揮發(fā)性有機(jī)物有影響，還有待進(jìn)一步研究。