Kisspeptin和N-氨甲酰谷氨酸對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

馮 濤, 韋尚麗, 許曉玲, 白佳樺, 肖銀霞, 鄭 琛, 田見暉, 劉 彥

(1. 北京市農(nóng)林科學院 畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100097; 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院, 蘭州 730070; 3. 中國農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院, 北京 100193)

下丘腦產(chǎn)生和分泌的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)是啟動和調控繁殖機能的關鍵步驟[1]。下丘腦GnRH神經(jīng)元作為哺乳動物中樞生殖調控體系的最終共同通路，GnRH的合成和分泌受到諸多因子的直接和間接調控以及神經(jīng)元之間相互作用的調控[2]。雖如此，但GnRH神經(jīng)元在人和哺乳動物的腦內數(shù)量很少，且彌散地分布于前腦的嗅區(qū)、隔區(qū)及下丘腦等區(qū)域，要想在體內精確對GnRH神經(jīng)元及其相關功能開展研究難度很大；同時通過原代培養(yǎng)的方法直接研究下丘腦GnRH神經(jīng)元的功能也存在很大困難[3]。目前，相當多的研究是利用下丘腦永生的GnRH神經(jīng)元細胞系GT1-7細胞作為工具開展相關研究工作[4]。GT1-7細胞在表型形態(tài)、超微結構、基因表達、激素儲存以及分泌的方式均與GnRH神經(jīng)元完全一樣，且能在體外分裂傳代，是體外研究GnRH神經(jīng)元的理想細胞模型[5-7]。

哺乳動物在初情期前，KiSS-1和GPR54基因表達水平會升高[8-9]，而中樞注射kisspeptin(KiSS-1基因編碼的肽)能增加初情期前和成年哺乳動物GnRH釋放[10-11]；此外，人和小鼠GPR54(kisspeptin的受體)突變會導致出現(xiàn)不育等表型的性腺機能衰退癥[12-13]。因此，KISS/GPR54系統(tǒng)被認為是青春期啟動的開關[3]。前期有研究表明kisspeptin-10刺激GT1-7細胞可促進GnRH分泌[14]。我們的研究表明，體外N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylgulamate，NCG)處理GT1-7細胞12 h呈劑量依賴性抑制GnRH分泌，其原因之一是下調了GT1-7細胞KiSS-1基因的表達[2]；但體內在后備母豬日糧中添加NCG可提升血液中雌激素水平，促進性器官和卵泡發(fā)育，促進初情期發(fā)育[2]。而kisspeptin和NCG組合添加對于GT1-7細胞GnRH分泌會產(chǎn)生什么樣的影響目前尚不清楚。本研究利用GT1-7細胞，體外模擬初情期前的生理環(huán)境，研究kisspeptin和NCG對GT1-7細胞增殖和GnRH分泌的影響，進一步闡明NCG促進性發(fā)育可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

本試驗所用GT1-7細胞系為美國加州大學Mellon教授惠贈。主要實驗儀器有：CO2恒溫培養(yǎng)箱、酶標儀(Thermo公司)、生物安全柜(Heal Force公司)、臺式高速冷凍離心機、紫外分光光度計(Eppendorf公司)、倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)等。

1.2 試劑與耗材

DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、青鏈霉素混合液、Try-EDTA(Gbico公司)、kisspeptin-10(AnaSpec公司)、NCG(Sigma公司)、小鼠GnRH酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(TSZ公司)。

1.3 GT1-7細胞培養(yǎng)

將GT1-7細胞從液氮取出后，37 ℃水浴復蘇于含有10%胎牛血清(FBS)、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液中，然后900 r/min離心4 min，在超凈工作臺中使用新鮮的完全培養(yǎng)液重懸后接種于培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)于恒溫37 ℃、飽和濕度、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中，每隔24 h更換新的培養(yǎng)液。待GT1-7細胞鋪滿至培養(yǎng)瓶底面的80%～90%時，使用0.25%的胰酶(Try-EDTA)消化，待細胞開始從培養(yǎng)瓶壁上掉落時使用含有血清的完全培養(yǎng)液終止消化并多次吹打，將細胞懸液轉移至無菌Ep管后900 r/min離心4 min棄上清，重懸后接入新的培養(yǎng)瓶進行傳代。培養(yǎng)至3代以上細胞狀態(tài)穩(wěn)定時[2, 15]。

1.4 Kisspeptin-10和NCG處理GT1-7細胞

待傳代后的GT1-7細胞在培養(yǎng)瓶底面匯合至80%～90%時可消化重懸后用于試驗。將得到的GT1-7細胞懸液使用細胞計數(shù)儀測其密度，根據(jù)濃度稀釋至5×105個/mL的濃度均勻接種至12孔板中，每孔2 mL，每個處理3個重復，培養(yǎng)于二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱。待細胞匯合至80%～90%時，取出至無菌工作臺，輕輕吸去培養(yǎng)液，各孔用1 mL PBS洗滌2遍，以去除血清對試驗的干擾，然后每孔接入2 mL無血清DMEM配制的不同濃度kisspeptin-10和/或NCG進行處理，重新置于二氧化碳培養(yǎng)箱并計時[2, 15]。

首先進行不同濃度kisspetin-10單獨處理GT1-7細胞的研究，kisspeptin-10的終濃度分別為10 pmol/L、100 pmol/L、1 nmol/L和10 nmol/L[14]，處理時間為12 h。在此基礎上選擇顯著促進GT1-7細胞增殖的kisspeptin-10濃度(100 pmol/L)開展共培養(yǎng)實驗。共培養(yǎng)實驗中NCG的濃度分別為 10 μmol/L、100 μmol/L和1 mmol/L[2]，處理時間為12 h。

1.5 GT1-7細胞計數(shù)

處理結束后將細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，吸取細胞培養(yǎng)液并收集細胞。培養(yǎng)液用無菌Ep管收集，2000 r/min離心20 min，取上清液測定GnRH濃度。細胞沉淀的收集使用胰蛋白酶處理法，吸除多余培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液PBS洗滌細胞2次，然后向孔中緩慢加入200 μL 0.25%胰酶消化至脫離容器壁時，使用含有血清的完全培養(yǎng)液300 μL終止消化，吹打混勻后將細胞懸液轉移至RNase-Free Ep管中，再用500 μL的DMEM沖洗細胞培養(yǎng)孔后將液體轉移至Ep管中，充分重懸后吸取10 μL利用細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)[2]。

1.6 GnRH濃度測定

實驗使用美國TSZ公司生產(chǎn)的小鼠GnRH酶聯(lián)免疫標記檢測試劑盒檢測GT1-7細胞GnRH的分泌。使用已知濃度的標準品制作GnRH標準曲線，然后利用酶標儀根據(jù)樣品在420 nm處的吸光值，計算樣品GnRH濃度。具體操作按照試劑盒使用說明進行，本研究中GnRH標準曲線的R2為0.9996，測定批次間和批次內的變異系數(shù)分別是8.5%和9.9%。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 Kisspeptin-10對GT1-7細胞增殖和GnRH分泌的影響

體外用kisspeptin-10處理GT1-7細胞，細胞增殖呈劑量依賴性變化(圖1)。當kisspeptin-10濃度為10～100 pmol/L時，對細胞增殖呈劑量依賴性促進作用(P<0.05)，而當kisspeptin-10濃度為100 pmol/L～10 nmol/L時，隨處理濃度增加對細胞增殖的促進作用減弱(P<0.05)。與對照組相比，100 pmol/L和1 nmol/L的kisspeptin-10處理12 h后細胞數(shù)可分別增加92%和34%(P<0.05)。

相同小寫字母表示無顯著差異(P>0.05)；不同小寫字母表示存在顯著差異(P<0.05)；下同

圖1不同濃度kisspeptin-10對GT1-7細胞增殖的影響

Figure 1 Effects of different levels of kisspeptin-10 on GT1-7 cell proliferation

Kisspeptin-10體外對GT1-7細胞GnRH的分泌活性會產(chǎn)生影響。如圖2所示，kisspeptin-10對GnRH分泌呈現(xiàn)劑量依賴性作用，也呈現(xiàn)出先促進后抑制的作用(P<0.05)。與對照組相比，10 pmol/L、100 pmol/L和1 nmol/L的kisspeptin-10處理12 h后GnRH濃度分別增加了2.3、3.3和2.1倍(P<0.05)。

圖2 不同濃度kisspeptin-10對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

2.2 Kisspeptin-10和NCG對GT1-7細胞增殖和GnRH分泌的影響

如圖3所示，100 pmol/L的kisspeptin-10和1 mmol/L的NCG單獨添加均可促進GT1-7細胞增殖(P<0.05)；固定kisspeptin-10處理濃度為100 pmol/L，復合添加10 μmol/L和100 μmol/L的NCG培養(yǎng)12 h后，GT1-7細胞數(shù)與單獨添加kisspeptin-10或NCG相比顯著增加(P<0.05)，而1 mmol/L的NCG與kisspetin-10復合添加與二者單獨添加相比細胞數(shù)則無顯著變化(P>0.05)。

K: Kisspeptin-10; N: NCG

圖3 Kisspeptin-10和NCG對GT1-7細胞增殖的影響

Figure 3 Effects of kisspeptin-10 and/or NCG on GT1-7 cell proliferation

100 pmol/L的kisspeptin-10和1 mmol/L的NCG單獨添加對GT1-7細胞GnRH的分泌活性產(chǎn)生了不同的影響，kisspeptin-10可促進GnRH分泌(P<0.05)，而NCG則抑制了GnRH的分泌(P<0.05)，見圖4。固定kisspeptin-10處理濃度為100 pmol/L，復合添加NCG共培養(yǎng)12 h后，GT1-7細胞的GnRH分泌水平隨NCG添加濃度升高呈現(xiàn)劑量依賴性變化。如圖4所示，與kisspeptin-10單獨處理相比，100 μmol/L的NCG和kisspeptin-10共同處理對GnRH分泌水平無顯著影響(P>0.05)，而1 mmol/L的NCG和kisspeptin-10共同處理可提高GnRH分泌水平57%(P<0.05)；與NCG單獨處理相比，NCG和kisspeptin-10共同處理可顯著提高GnRH分泌水平4.9～9.8倍(P<0.05)。

K: kisspeptin-10; N: NCG

圖4Kisspeptin-10和NCG對GT1-7細胞GnRH分泌的影響

Figure 4 Effect of kisspeptin-10 and/or NCG on GnRH secretion in GT1-7 cells

3 討論

本實驗研究了kisspeptin-10和NCG單獨及組合處理對GT1-7細胞增殖以及GnRH分泌的影響，利用體外GnRH神經(jīng)元細胞GT1-7模擬了性發(fā)育過程中kisspeptin-10和體外添加NCG對GnRH分泌的影響，對解析性發(fā)育過程中體外營養(yǎng)因子與體內生理環(huán)境的互作對GnRH的調控作用提供了參考。

下丘腦GnRH神經(jīng)元是動物發(fā)情周期啟動的關鍵部位，GnRH神經(jīng)元細胞受到多種因子的調控。已有研究表明多種營養(yǎng)因子可調控GnRH神經(jīng)元的活性，如kisspeptin[17-18]、谷氨酰胺[19-20]、神經(jīng)激肽B[1, 21]、NCG[2]、精氨酸[2]等，其中kisspeptin和NCG在體內均可以促進動物的性發(fā)育[2, 11]，這種促進作用主要是通過調控GnRH的分泌實現(xiàn)的。

體外培養(yǎng)并測定細胞數(shù)量變化是評價營養(yǎng)因子影響細胞生長的最佳方法[22]。利用體外培養(yǎng)的方法，我們發(fā)現(xiàn)kisspeptin和NCG均可以顯著促進GT1-7細胞的增殖，這與Novaira等[14, 18]和 Liu等[2]的研究結果一致，也充分說明了GT1-7細胞模型可以用于體外評價營養(yǎng)因子對GnRH的調控作用。本研究中也發(fā)現(xiàn)了kisspeptin可呈劑量依賴性促進GT1-7細胞增殖，濃度在100 pmol/L時刺激效果最明顯，隨著kisspeptin濃度增加，對GT1-7細胞增殖呈現(xiàn)劑量依賴性抑制作用，繼而影響GnRH的分泌，類似的現(xiàn)象在NCG體外處理牛卵巢顆粒細胞中也有報道[23]，可能的原因是隨著處理濃度的增加添加物對細胞的毒性進一步增強；而Novaira等[14, 18]在研究中均選用了1 nmol/L的劑量，這種處理劑量的差異可能與體外處理的時間有關，文獻中的最長處理時間為6 h，而本研究的處理時間為12 h，可見高濃度短時間處理和低濃度長時間處理均有促進GT1-7細胞增殖的作用。本研究選擇NCG的濃度為10 μmol/L、100 μmol/L和1 mmol/L，其原因主要是體外培養(yǎng)GT1-7細胞12 h，以上濃度的NCG可呈劑量依賴性促進GT1-7細胞增殖，其中以1 mmol/L刺激效果最為顯著[2]。體外用kisspeptin和NCG共同處理GT1-7細胞屬首次報道，與kisspeptin和NCG單獨添加相比，共同添加可顯著促進GT1-7細胞增殖，這也說明了在體外kisspeptin和NCG在促進GT1-7細胞增殖方面具有協(xié)同作用，可能的分子機制是kisspeptin的添加緩解了NCG處理對KiSS-1基因表達的抑制作用，也有可能是激活了細胞增殖相關的信號通路，這還有待進一步深入研究。

動物初情期啟動的主要原因是GnRH分泌增強，繼而觸發(fā)下游促性腺激素FSH和LH的釋放，引起卵巢和繁殖器官等發(fā)生一系列有助于排卵和適應妊娠的變化[14]。Kisspeptin可以引發(fā)初情期的主要原因是促進了GnRH的分泌[11]，這一機理在本研究的體外實驗中也得到驗證，即無論是kisspeptin-10處理6 h或12 h，均可以顯著促進GT1-7細胞GnRH的分泌。在后備母豬日糧中添加NCG可促進性發(fā)育，并提前初情期的時間[2]，體外GT1-7細胞培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)1 mmol/L的NCG處理12 h在顯著促進細胞增殖的同時卻抑制了GnRH的分泌[2]，原因可能是NCG抑制了GT1-7細胞GnRH、nNOS、KiSS-1等基因的表達[2]。本研究在原來的工作基礎上[2]，體外為NCG促進性發(fā)育的機理提供了更多的證據(jù)，即NCG單獨處理GT1-7細胞可促進細胞增殖卻抑制GnRH分泌，kisspeptin-10單獨處理可同時促進GT1-7細胞增殖和GnRH分泌，二者共同作用對GT1-7細胞增殖有協(xié)同刺激效應，但更重要的是對GnRH分泌的促進作用，可能是因為kisspeptin-10緩解了NCG處理對KiSS-1等初情期相關基因表達的抑制作用，并隨著NCG濃度的增加對GnRH分泌呈劑量依賴性促進作用。這進一步說明了NCG在體內外可通過kisspeptin或與kisspeptin相互作用對性發(fā)育發(fā)揮積極的調控作用。

4 結論

利用GT1-7細胞體外研究表明，kisspeptin-10和NCG能協(xié)同促進GT1-7細胞增殖，NCG單獨處理GT1-7細胞抑制GnRH分泌，但在一定濃度kisspeptin-10存在的條件下，NCG能夠呈劑量依賴性促進GnRH的分泌。