北沙參多糖復(fù)合酶提取工藝及理化性質(zhì)研究

景永帥 - 張丹參 - 張瑞娟 - 韓 鈺 劉東波 - 鄭玉光 - 吳蘭芳 -

(1. 河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2. 河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜(GlehniaLittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的干燥根，是傳統(tǒng)的名貴藥材和藥食同源物品，具有滋陰清肺、益胃生津等功效[1-2]。其有效成分主要為香豆素類、聚炔類及多糖類物質(zhì)，其中多糖類含量最高，具有抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等功能[3-4]。

北沙參多糖提取方法主要有熱水回流提取法[5]、微波輔助提取法[3]、超聲波輔助提取法[6]、酸堿提取法[7]、酶提取法[7]等。酶提取法因其提取條件溫和，可加速有效成分釋放、純化提取液中的提取物等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于植物中有效成分的提取[8-10]。常用的酶有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶或復(fù)合酶。纖維素是細(xì)胞壁的主要成分，也是多糖溶出的主要屏障，利用纖維素酶水解細(xì)胞壁，可加速多糖的溶出，且對(duì)細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)影響；木瓜蛋白酶是含巰基肽鏈的內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，可水解蛋白質(zhì)，幫助多糖溶出[11]。使用單一酶提取北沙參多糖已有研究[7]，而研究采用復(fù)合酶提取北沙參多糖較少[12]。

試驗(yàn)擬選用纖維素酶和木瓜蛋白酶按一定比例進(jìn)行北沙參多糖提取，應(yīng)用響應(yīng)面法確定最佳提取工藝，并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，考察其對(duì)DPPH自由基的清除作用，為提高北沙參多糖的提取率及開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北沙參：產(chǎn)自河北保定，亳州市問(wèn)善堂藥業(yè)科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、DEAE-52纖維素：色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司；

纖維素酶：1×105U/g，寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；

木瓜蛋白酶：1×105U/g，南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇金壇宏華儀器廠；

磁力加熱攪拌器：DF-2型，江蘇金壇宏華儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELAN-1100型，日本東京理化株式會(huì)社；

超聲波清洗器：KS-300DE型，昆山潔力美超聲儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：S-100型，德國(guó)珀金埃爾默公司；

TSK-GEL凝膠柱：G4000 PWXL、G2500 PWXL型，日本東京株式會(huì)社；

液相色譜儀：LC1220型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；

液相色譜儀：e2695型，美國(guó)Alliance公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 北沙參預(yù)處理 取北沙參粉碎，過(guò)40目篩，用3倍體積的95%乙醇回流提取2次，除去脂溶性成分，藥渣干燥后，備用。

1.3.2 北沙參多糖提取工藝優(yōu)化

(1) 酶解時(shí)間：取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，液料比20∶1 (mL/g)，纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1∶1，酶添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，考察酶解時(shí)間(1，2，3，4 h)對(duì)多糖提取率的影響。

(2) 酶解溫度：取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末，液料比20∶1 (mL/g)，纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1∶1，酶添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，酶解2 h，考察酶解溫度(40，50，60，70，80 ℃)對(duì)多糖提取率的影響。

(3) 液料比：取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比1∶1，酶添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，酶解3 h，考察液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]對(duì)多糖提取率的影響。

(4) 酶添加量：取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，液料比30∶1 (mL/g)，纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比3∶1，酶解3 h，考察酶添加量(1%，2%，3%，4%，質(zhì)量分?jǐn)?shù))對(duì)多糖提取率的影響。

(5) 纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比：取5 g經(jīng)預(yù)處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，液料比30∶1 (mL/g)，酶添加量1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，酶解3 h，考察纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比(1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1)對(duì)多糖提取率的影響。

(6) 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化：根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取酶解時(shí)間、液料比和酶添加量為響應(yīng)面因素，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.3.3 多糖提取率的測(cè)定 按式(1)計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：

E——多糖提取率，%；

C1——粗多糖質(zhì)量，g；

C2——樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 分離純化 采用DEAE-52纖維素柱層析法對(duì)北沙參粗多糖進(jìn)行分離純化。取北沙參多糖(GLP-E)約200 mg，加入10 mL蒸餾水溶解，離心，上樣，分別以蒸餾水和0～1 mol/L NaCl洗脫，并用自動(dòng)收集器收集，每10 min 收集一管，苯酚—硫酸法顯色。

1.3.5 理化性質(zhì)分析

(1) 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析：檢測(cè)北沙參多糖在4 000～450 cm-1處的FT-IR[13]。

(2) 北沙參多糖相對(duì)分子質(zhì)量：采用HPGPC-ELSD法[14]。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，相對(duì)分子質(zhì)量為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-0.310 8x+11.749，R2=0.991 1)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算北沙參多糖相對(duì)分子質(zhì)量。色譜柱為TSK-GEL G4000 PWXL、TSK-GEL G2500 PWXL；流動(dòng)相為超純水；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；漂移管溫度60 ℃；霧化溫度30 ℃；載氣為N2；載氣流量2.0 mL/min。

(3) HPLC分析：根據(jù)文獻(xiàn)[15]略作修改。Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫30 ℃；上樣量20 μL；流速1 mL/min；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.85)—乙腈(83∶17，體積比)；洗脫方式為等度洗脫。

1.3.6 清除DPPH自由基能力 參照文獻(xiàn)[16-17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0、Origin 8、SPSS 16.0和Excel等分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對(duì)北沙參多糖提取率的影響 由圖1可知，隨著酶解時(shí)間的增加，提取率總體呈先增后減趨勢(shì)，酶解3 h時(shí)提取率達(dá)峰值，可能是隨著酶解時(shí)間的增長(zhǎng)，酶解作用充分發(fā)揮，使得提取率增大，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分多糖被酶解導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇酶解3 h。

圖1 酶解時(shí)間對(duì)北沙參多糖提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對(duì)北沙參多糖提取率的影響 由圖2可知，30～70 ℃時(shí)提取率隨酶解溫度的升高而上升；溫度繼續(xù)升高，提取率下降。隨著溫度的升高，多糖在溶劑中的溶解度、擴(kuò)散系數(shù)增大，提取率增加；溫度過(guò)高，多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，且酶逐漸失活，提取率降低。因此，選擇酶解溫度為70 ℃。

2.1.3 液料比對(duì)北沙參多糖提取率的影響 由圖3可知，當(dāng)液料比為30∶1 (mL/g)時(shí)，提取率最高，繼續(xù)增大液料比，提取率反而降低，其原因可能與液料比過(guò)高不利于多糖溶出有關(guān)。因此，選擇液料比為30∶1 (mL/g)。

圖2 酶解溫度對(duì)北沙參多糖提取率的影響

Figure 2 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharide fromGlehniaeRadix

圖3 液料比對(duì)北沙參多糖提取率的影響

Figure 3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction rate of polysaccharide fromGlehniaeRadix

2.1.4 酶添加量對(duì)北沙參多糖提取率的影響 由圖4可知，北沙參多糖提取率隨著酶添加量的增加先上升后下降，當(dāng)酶添加量為3%時(shí)，提取率最高，可能是在一定范圍內(nèi)，增加酶的用量有利于水解植物細(xì)胞組織，從而利于多糖的溶出；當(dāng)酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，北沙參多糖被過(guò)量的纖維素酶和木瓜蛋白酶降解，導(dǎo)致提取率降低。因此，選擇酶添加量為3%。

2.1.5 纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比對(duì)多糖提取率的影響 由圖5可知，當(dāng)纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為3∶1時(shí)，多糖提取率最高達(dá)21.9%；當(dāng)纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為1∶3時(shí)，多糖提取率最低為12.7%，二者之間存在顯著差異。可能是酶種類不同，作用位點(diǎn)不同，纖維素酶可水解細(xì)胞壁，木瓜蛋白酶可水解蛋白質(zhì)，有助于多糖溶出，當(dāng)二者以適當(dāng)比例復(fù)合時(shí)，才能顯著提高多糖提取率。因此，選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比為3∶1。

圖4 酶添加量對(duì)多糖提取率的影響

圖5 酶比對(duì)多糖提取率的影響

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

采用Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，通過(guò)響應(yīng)面分析尋求最優(yōu)工藝參數(shù)[18]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定多糖酶解時(shí)間、液料比、酶添加量的各項(xiàng)參數(shù)水平(見(jiàn)表1)。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)北沙參多糖提取進(jìn)行工藝優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2。

由軟件分析所得各因素和響應(yīng)值關(guān)系的二次多元回歸方程為：

Y=22.23+0.069A+0.17B-0.71C-0.34AB+0.93AC+0.40BC-1.36A2-2.26B2-2.12C2。

(2)

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析?

2.3 等高線圖和響應(yīng)曲面圖

由圖6～8可知，各等高線圖均呈橢圓形，說(shuō)明酶解時(shí)間與液料比、酶解時(shí)間與酶添加量、液料比與酶添加量之間存在交互作用。

2.4 模型的驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件分析，北沙參多糖提取的最佳工藝條件為酶解時(shí)間2.98 h，液料比30.12∶1(mL/g)，酶添加量2.91%，為檢測(cè)該法的可靠性，考慮到實(shí)際操作的便利，最優(yōu)工藝修正為酶解時(shí)間3 h，液料比30∶1 (mL/g)，酶添加量3%，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，北沙參多糖提取率為(22.04±0.23)%，與預(yù)測(cè)值22.30%相差0.25%，說(shuō)明用該模型對(duì)北沙參多糖的提取進(jìn)行工藝優(yōu)化具有一定的實(shí)際可操作性。該條件下的北沙參多糖提取率(22.04%)高于課題組前期研究[6]的(12.13%)，說(shuō)明復(fù)合酶法提取多糖，有更好的協(xié)同作用，效率更高。

2.5 北沙參粗多糖分離純化

由圖9可知，蒸餾水和NaCl作為洗脫相，均有一個(gè)洗脫峰，分別命名為GLP-E1、GLP-E2。

2.6 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2理化性質(zhì)分析

圖6 酶解時(shí)間與液料比對(duì)多糖提取率的交互作用

圖7 酶解時(shí)間與酶添加量對(duì)多糖提取率的交互作用

圖8 液料比與酶添加量對(duì)多糖提取率的交互作用

圖9 北沙參粗多糖DEAE-52纖維素洗脫曲線圖

2.6.2 單糖組成 由圖11可知，GLP-E由GlcA、Glc、Gal和Ara組成；GLP-E1由GlcA、Glc、Gal和Ara組成；GLP-E2由Glc組成。

2.6.3 相對(duì)分子質(zhì)量 由圖12可知，GLP-E具有3個(gè)吸

圖10 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2紅外圖譜

1. Man 2. Rha 3. GlcA 4. GalA 5. Glc 6. Gal 7. Xyl8. Ara 9. Fuc

圖12 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2相對(duì)分子質(zhì)量分布圖

收峰，相對(duì)分子質(zhì)量分別為4 662.98，376.89，10.40 kDa；GLP-E1具有2個(gè)吸收峰，相對(duì)分子質(zhì)量分別為4 221.45，377.96 kDa；GLP-E2具有2個(gè)吸收峰，相對(duì)分子質(zhì)量分別為4 626.41，10.24 kDa。由此可見(jiàn)，GLP-E、GLP-E1和GLP-E2為非均一多糖。

2.7 體外抗氧化活性

由圖13可知，在0～8 mg/mL濃度范圍內(nèi)，GLP-E、GLP-E1、GLP-E2對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，且呈濃度依賴性。三者清除DPPH自由基的IC50值分別為1.918，7.422，3.392 mg/mL，清除能力大小為GLP-E>GLP-E2>GLP-E1，優(yōu)于超聲波輔助提取法的(1.99 mg/mL)[7]和纖維素酶法的(6.317 mg/mL)[8]，但均低于陽(yáng)性對(duì)照VC(IC50為0.005 mg/mL)的清除能力。

圖13 GLP-E、GLP-E1和GLP-E2對(duì)DPPH自由基的清除作用

李亞輝等[21]研究表明復(fù)合酶提取的多糖對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的清除作用均略大于同質(zhì)量濃度的VC。故復(fù)合酶法提取的多糖具有較好的抗氧化作用，可能由于：① 雙重酶解作用，有利于多糖的溶出；② 提取時(shí)間短、條件溫和，對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)破壞較小；③ 木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)，多糖溶出的同時(shí)，提高了多糖的純度[22]。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面綜合分析，得到復(fù)合酶法提取北沙參多糖的最優(yōu)提取工藝為酶解溫度70 ℃，酶解時(shí)間3 h，液料比30∶1 (mL/g)，酶添加量3%，纖維素酶與木瓜蛋白酶質(zhì)量比3∶1，此條件下的提取率為(22.04±0.23)%。經(jīng)DEAE-52纖維素純化后得到兩個(gè)組分，GLP-E1 與GLP-E2。GLP-E由GlcA、Glc、Gal和Ara組成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為4 662.98，376.88，10.40 kDa；GLP-E1由GlcA、Glc、Gal和Ara組成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為4 221.45，377.96 kDa；GLP-E2由Glc組成，相對(duì)分子質(zhì)量分別為4 626.41，10.24 kDa；且3種組分均表現(xiàn)出一定的清除DPPH自由基的能力，其IC50值分別為1.918，7.422，3.392 mg/mL。后期將對(duì)北沙參多糖的結(jié)構(gòu)特征及體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行研究。