60Co-γ輻照紅參提取物對1型糖尿病小鼠的影響

齊 欣 崔承弼 - 金莉英 - 姜 欣 張 露

(延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000)

糖尿病已被列為威脅人類健康的重大慢性疾病之一，而糖尿病患者多因體內(nèi)胰島素分泌不足，不能有效地分解體內(nèi)糖類物質(zhì)，進而引發(fā)高血糖和尿糖等癥狀，多數(shù)患者還伴隨脂代謝紊亂等癥狀，主要表現(xiàn)為血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)增高的高脂血癥，糖尿病的出現(xiàn)會導(dǎo)致多種并發(fā)癥，并難以控制，最終導(dǎo)致糖尿病患者病情進一步惡化[1]。近年來糖尿病已成為繼癌癥、心腦血管疾病后的第三類人類健康殺手。針對糖尿病，臨床治療手段主要還是通過藥物、運動和飲食來控制其發(fā)展惡化[2]，截至目前仍未出現(xiàn)針對糖尿病迅速或徹底的治療手段，常規(guī)西醫(yī)主要通過補充胰島素、增強胰島素受體敏感性、減輕胰島素抵抗作用和增強β細胞分泌、提升機體血糖耐受等途徑來緩解糖尿病病情。但存在一定的副作用，可能造成乳酸中毒、肝細胞損傷、神經(jīng)退行性病變、消化道不適及嚴重的低血糖等，甚至死亡，所以亟需更天然的治療藥物，如人參等天然藥材[3-5]。

人參為五加科人參屬多年生草本植物的根莖，是享譽華夏的千年古藥。其具有多種祛病養(yǎng)生的生理功效，素有“百草之王”之美譽。隨著其有效成分和藥理病理活性與功能的不斷研究，越來越多的專家學(xué)者[6-9]發(fā)現(xiàn)人參能夠緩解糖尿病癥狀，具備輔助治療糖尿病的巨大潛力。人參中具有多種對人體有益的活性成分，但其在儲存和加工過程中易受微生物污染，因此需對其進行無菌處理。傳統(tǒng)滅菌方法，如熱處理和化學(xué)熏蒸法等會對環(huán)境和人體造成危害，而輻照技術(shù)應(yīng)用范圍廣，相比傳統(tǒng)滅菌方法，其殺菌效率高，并且節(jié)能、省時、成本低[10]。

60Co-γ射線輻照滅菌法，其穿透力極強，滅菌效果好，近年來在中藥滅菌中得到越來越廣泛的應(yīng)用[11]。前期試驗[12-13]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)15 kGy劑量的60Co-γ射線輻照，紅參中降血糖相關(guān)人參皂苷Rh4和CK含量提升最顯著，其中人參皂苷Rh4比未輻照前提升了74.89%，同時CK含量提升了59.42%。同時輻照處理也能提升人參的殺菌和貯藏效果[14]。試驗擬以經(jīng)15 kGy60Co-γ射線輻照紅參和未輻照紅參為研究對象，采用50%乙醇提取其活性成分并對1型糖尿病小鼠進行體內(nèi)試驗，研究15 kGy60Co-γ射線輻照紅參和未輻照紅參提取物對于糖尿病小鼠在血糖、血脂及糖化血紅蛋白方面的改善能力，為輻照紅參提取物在預(yù)防糖尿病方面的開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物：體重為20～30 g的清潔級雄性昆明種小鼠，于適宜條件飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進行后續(xù)試驗，延邊大學(xué)動物實驗中心。

1.2 試驗材料及儀器

1.2.1 試驗材料

小鼠飼料(配料表見表1)：延邊大學(xué)動物實驗中心；

紅參：2016年產(chǎn)，長白山科學(xué)研究院提供，于四川省原子能研究院進行輻照處理；

鏈脲佐菌素：美國Sigma公司；

鹽酸二甲雙胍：河北山姆士藥業(yè)有限公司；

檸檬酸、檸檬酸鈉：AR級，天津市華東試劑廠；

表1 小鼠飼料配料表?[3]

? 能量16 857 kJ/kg。

總膽固醇(T-CHO)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、糖化血紅蛋白(HbAlc)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

醫(yī)用酒精：上海金和實業(yè)有限公司；

正丁醇：AR級，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 試驗儀器

高速離心機：8O-2型，上海手術(shù)器械廠；

離心機：TG16A-WS型，上海盧湘儀器有限公司；

數(shù)控超聲波清洗器：KQ3200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：SB-2000型，上海愛郎儀器有限公司；

分析天平：FA2004型，上海上平儀器有限公司；

立式鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9620A型，上海百典儀器設(shè)備有限公司；

血糖儀：AG-605型，天津九安醫(yī)療電子股份有限公司；

多功能熒光酶標(biāo)儀：SP-Max3500FL型，上海閃譜生物科技有限公司；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9082型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；

電子天平：Scout SE-SE202FZH型，奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅參提取物的制備 紅參樣品粉碎過80目篩后，以50%乙醇溶液按料液比1∶10 (g/mL)提取3次，40 kHz 超聲提取3次，每次60 min，合并3次上清液，烘箱中80 ℃過夜后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，蒸餾水溶解后，以60 mL 水飽和正丁醇于分液漏斗多次萃取至上層有機層澄清，并合并上層旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后以少量蒸餾水溶解置于-80 ℃冷凍后凍干得紅參提取物。

1.3.2 血糖含量的測定 小鼠隔夜禁食12 h后(21時～次日9時)，進行剪尾取血，棄去第1滴尾尖血后檢測血糖值，并記錄。

1.3.3 糖尿病小鼠建模

(1) 將1.1中的小鼠在動物飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機選取6只作為空白試驗組，對所有小鼠禁食處理，禁食方法為隔夜禁食不禁水12 h(21時～次日9時)。

(2) 測量并記錄小鼠禁食體重及空腹血糖水平后，建立1型糖尿病模型，STZ濃度為12 mg/mL，空白組同時腹腔注射緩沖溶液做假性處理。

(3) 建模7 d后對各組小鼠禁食，空腹時稱量體重，并測其空腹血糖值，建模成功標(biāo)準(zhǔn)：建模7 d后，小鼠空腹血糖值>11.1 mmol/L (200 mg/dL)，剔除建模失敗小鼠。

1.3.4 受試物劑量設(shè)計 將血糖值>11.1 mmol/L(200 mg/dL)的小鼠隨機分為6組，將輻照紅參與未輻照紅參提取物按表2中劑量配置，其中輻照人參提取物劑量依據(jù)預(yù)試驗結(jié)果進行設(shè)置，分組和劑量設(shè)置見表2。

連續(xù)灌胃30 d，ⅰ、ⅱ組灌胃相同體積的蒸餾水，末次灌胃后進行眼球取血并脫頸處死，隨后進行解剖。

1.3.5 小鼠全血HbAlc和血清TC、TG的測定 各組小鼠最后一次灌胃后進行眼球取血，處死并收集血漿至1.5 mL 離心管中，按照相應(yīng)試劑盒使用方法，用酶標(biāo)儀在固定波長下檢測相應(yīng)的吸光值，分別計算TC、TG和HbAlc含量。

表2 分組及劑量設(shè)置

2 結(jié)果與討論

2.1 紅參提取物對小鼠飲食及食物效價的影響

建模后，經(jīng)過連續(xù)30 d灌胃試驗后發(fā)現(xiàn)，試驗組小鼠隨著灌胃時間的延長，毛發(fā)由枯黃干燥變得濃密順滑；ⅰ組小鼠在攝食量與攝水量上均無異常變化，模型組小鼠攝食量隨著灌胃時間的延長呈現(xiàn)下降的趨勢，其中與ⅱ組相比，α、λ和ⅲ組攝食量與攝水量明顯減少，其食物利用率也明顯提升，但α組數(shù)值更接近ⅲ組。由此可知，經(jīng)紅參提取物灌胃后均可有效改善小鼠狀態(tài)，提高體重增量，提高食物效價。

表3 試驗期間各組小鼠體重及攝食飲水情況?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 紅參皂苷提取物對各試驗組小鼠體重及血糖的影響

由圖1可知，ⅰ組小鼠在飼養(yǎng)期間體重整體呈上升趨勢，且體重增幅均遠遠超過其他各試驗組；ⅱ組小鼠在灌胃期間體重呈不增長或負增長；ⅲ組和α、β、γ、λ組小鼠體重增降趨勢基本一致，α組小鼠體重增幅僅次于ⅲ組，均優(yōu)于其他各試驗組，λ組小鼠體重增加量略高于β、γ組，而β組體重增幅又略高于γ組。說明在試驗劑量范圍內(nèi)隨劑量的增加，能夠有效提高1型糖尿病小鼠的體重，且輻照人參高劑量組在改善小鼠體重方面好于未輻照人參高劑量組。

由表4可知，隨著試驗的進行，ⅰ組血糖水平略有升高，但保持在正常血糖范圍內(nèi)，ⅱ組血糖呈明顯上升趨勢，ⅲ組血糖水平呈先上升后下降的趨勢，輻照人參提取物α、β、γ組和未輻照人參提取物λ組與ⅲ組趨勢相同。第14天時，其余各組血糖水平均顯著高于ⅰ組(P<0.05)；第24天時，其余各組血糖水平也均顯著高于ⅰ組(P<0.05)，ⅱ組顯著高于ⅲ組和α、β、γ、λ組(P<0.05)，α組顯著低于β、γ、λ組(P<0.05)。說明二甲雙胍陽性藥和α、β、γ、λ組提取物懸濁液均對糖尿病小鼠的血糖上升有一定的緩解作用，且α組的降血糖效果優(yōu)于λ組。第33天，ⅲ組仍顯著高于ⅰ組(P<0.05)，同時ⅲ組顯著低于α、β、γ、λ組(P<0.05)，α和λ組無顯著差異(P>0.05)，但從空腹血糖值來看α組更接近ⅲ組。第43天時，ⅲ組與ⅰ組無顯著差異(P>0.05)，α組和λ組無顯著差異(P>0.05)，但從空腹血糖值來看仍是α組更接近ⅲ組。說明陽性對照組小鼠血糖值已基本恢復(fù)正常值，輻照高劑量組降血糖效果優(yōu)于未輻照高劑量組?？梢?，輻照紅參提取物能夠起到降低糖尿病小鼠血糖的作用，并且輻照后的紅參提取物好于未輻照的。

圖1 輻照與未輻照紅參提取物對各試驗組小鼠體重的影響

Figure 1 Effects of irradiated and non-irradiated red ginseng extract on body weight of mice (n=6)

表4 試驗各組小鼠血糖變化?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 紅參皂苷提取物對小鼠血液相關(guān)指標(biāo)的影響

由表5可知，從血清TC含量來看，ⅱ組顯著高于ⅰ組和其余各組(P<0.05)，α組和ⅲ組無顯著差異(P>0.05)，且α組顯著低于λ組(P<0.05)。說明輻照紅參高劑量組與未輻照紅參高劑量組相比，在降低糖尿病小鼠血清TC含量的效果上更接近于二甲雙胍。從血清TG含量來看，α組和ⅲ組無顯著差異(P>0.05)，α組與λ組無顯著差異(P>0.05)，但從TG含量來看，α組更接近于ⅲ組。說明輻照紅參高劑量組降低糖尿病小鼠血清TG含量的效果更好。從糖化血紅蛋白測定結(jié)果來看，α組和λ組測定結(jié)果較接近于ⅲ組，說明這兩組小鼠的血糖控制情況較好。胰島素的缺乏會導(dǎo)致攝入的脂肪等不能被人體利用，并且機體中的某些大分子物質(zhì)，如脂肪分解的產(chǎn)物，游離脂肪酸進入肝臟，會生成甘油三酯和酮體，而脂肪組織中脂類的溶解使甘油三酯(TG)水平上升、同時由于高密度脂蛋白(HDL)水平的降低，從周圍組織攝取膽固醇的能力降低，使機體膽固醇聚集水平升高，總膽固醇(TC)水平上升，而經(jīng)輻照紅參提取物灌胃后能夠較好地改善TC、TG以及Hablc的水平。

表5 紅參提取物對HbAlc、TC、TG的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 紅參皂苷提取物對小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)(臟體比)指機體某臟器質(zhì)量占體重的百分比。正常生長發(fā)育下的同一物種其機體各臟器與體重的比值較恒定。而在動物染毒或存在病理缺陷時，臟器發(fā)生氧化損傷或水腫、增生等，臟體比相應(yīng)增大或減小，臟器系數(shù)隨之改變，由此可來判斷小鼠的健康狀況。根據(jù)表6可知，各組間心臟臟器系數(shù)除ⅱ組顯著升高(P<0.05)；肝臟臟器系數(shù)ⅱ組顯著升高而經(jīng)過不同劑量受試物干預(yù)后肝臟增生肥大情況得到顯著改善(P<0.05)，其中α組和λ組恢復(fù)情況顯著(P<0.05)高于其他組，僅次于ⅲ組；脾臟臟器系數(shù)ⅱ組與γ組顯著高于其余各組(P<0.05),但彼此無顯著差異(P>0.05)，α組脾臟器系數(shù)顯著降低(P<0.05)且效果最優(yōu)，表明15 kGy高劑量輻照紅參提取物能顯著緩解糖尿病小鼠脾充血腫大的狀態(tài)，其效果接近于特定劑量的鹽酸二甲雙胍；糖尿病造成腎負擔(dān)加重，表中顯示ⅱ組腎臟肥大臟器系數(shù)顯著高于其余各組(P<0.05)，經(jīng)過不同劑量受試物干預(yù)后，α組和λ組腎臟臟器系數(shù)顯著改善(P<0.05)，表明高劑量的紅參皂苷提取物能顯著恢復(fù)腎臟狀態(tài)(P<0.05)。以上結(jié)果共同說明了高劑量15 kGy輻照紅參皂苷提取物能顯著改善心、肝、脾、腎的狀態(tài)(P<0.05)。由此可知，輻照紅參提取物可起到保護糖尿病小鼠臟器損傷的效果。

表6 紅參提取物對各組小鼠臟器系數(shù)的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

試驗初期發(fā)現(xiàn)經(jīng)過15 kGy60Co-γ射線輻照的紅參，其降血糖相關(guān)的人參皂苷Rh4及CK含量得到了顯著提升，而后續(xù)的動物試驗顯示經(jīng)過15 kGy60Co-γ射線輻照的高劑量紅參皂苷提取物顯著恢復(fù)了1型糖尿病小鼠的體重增長，降低了其血糖水平和飲水量以及攝食量，提升了食物利用率(P<0.05)，減少了其尿量，同時顯著降低了HbAlc含量和血清TG和TC水平(P<0.05)，并顯著恢復(fù)了心、肝、脾、腎臟器系數(shù)(P<0.05)。高劑量輻照后紅參皂苷提取物在降低1型糖尿病小鼠血糖和緩解其并發(fā)癥方面有較為明顯的效果，對糖尿病有一定的輔助治療作用。

試驗僅研究了60Co-γ射線輻照紅參對小鼠血糖及基礎(chǔ)指標(biāo)的影響，沒有深入研究其降血糖機理，以及輻照后紅參成分的變化，在后續(xù)的研究中將對糖尿病相關(guān)的蛋白進行測定，并研究輻照后紅參成分的具體變化。