榆林沙區(qū)引種波爾卡樹莓的組織培養(yǎng)與快速繁殖

王建新，吳志茹，馮光惠

（1.榆林市林業(yè)工作站，陜西榆林719000；2.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林719000）

樹莓（Rubus idaeus L.）俗稱覆盆子，是薔薇科懸鉤子屬（Rubus L.）植物，為多年生落葉灌木果樹。樹莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、口感好，果實(shí)中除含有豐富的糖類、氨基酸、纖維素外，還有糅化酸、SOD 酶、類黃酮等對(duì)人體具有保健作用的成分。樹莓的根莖葉在醫(yī)藥、化妝、保健、食品、加工等方面都有著廣泛的用途。樹莓生長(zhǎng)快、耐瘠薄、耐干旱，是優(yōu)良的水土保持植物[1]。樹莓與沙棘、枸杞并列為北方三大水土保持先鋒植物，并逐漸向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展[2-4]。近年來，樹莓的國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求不斷增加，果實(shí)價(jià)格持續(xù)上漲，東北地區(qū)和內(nèi)蒙古等北方優(yōu)生地人為采摘果實(shí)現(xiàn)象普遍，養(yǎng)護(hù)管理措施相對(duì)滯后，野生種質(zhì)資源破壞嚴(yán)重，優(yōu)勢(shì)野生種源地不斷減少，優(yōu)質(zhì)果實(shí)產(chǎn)量相對(duì)降低[5-6]。因此，拓展和引進(jìn)樹莓優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，在適生地開展樹莓新品種的栽培和利用具有十分重要的意義。

榆林市林業(yè)站近年從東北地區(qū)引進(jìn)多個(gè)紅樹莓品種，在榆林沙區(qū)經(jīng)過5～6 a 的馴化栽培，生長(zhǎng)勢(shì)良好，抗寒、抗旱、抗病蟲害和耐鹽堿等適應(yīng)能力均很強(qiáng)，但不同品種結(jié)果能力有差異，其中，波爾卡口感好，味道美，結(jié)果性狀好。傳統(tǒng)的繁殖方法是靠根蘗、扦插、壓條進(jìn)行，繁殖系數(shù)低，苗木質(zhì)量差，不利于規(guī)?；a(chǎn)的需要[7-8]。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)樹莓苗木，不僅能保持母株的優(yōu)良特性，同時(shí)可提高繁殖系數(shù)和苗木質(zhì)量。

本研究以榆林沙區(qū)引種成功且結(jié)果性狀優(yōu)良的樹莓品種波爾卡為試材，以春季新梢幼嫩莖段和莖尖為外植體，通過組培方法研究不同培養(yǎng)基上外植體的生長(zhǎng)狀況，探索樹莓的組織培養(yǎng)和快速繁殖體系，以期為榆林沙區(qū)引種樹莓的產(chǎn)業(yè)化育苗提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料是2017 年春季從東北地區(qū)引進(jìn)的2 年生樹莓新品種波爾卡，在榆林沙區(qū)經(jīng)過2 a 的引種栽培和田間試驗(yàn)，生長(zhǎng)勢(shì)良好。2019 年4 月于引種基地采集1 年生枝條上萌發(fā)的幼嫩新梢，裝于保濕透氣塑料袋帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的滅菌 剪去幼嫩新梢上的葉片并剪成4～5 cm 長(zhǎng)帶1～2 個(gè)芽的莖段，每次試驗(yàn)剪15～20 個(gè)莖段，用1%的吐溫-80 浸泡10～15 min，自來水下沖洗0.5～1.0 h，備用。在超凈工作臺(tái)上，將外植體材料轉(zhuǎn)入無菌燒杯中，用75%的酒精浸泡約30 s，無菌水漂洗2 次，再用0.1%的HgCl2溶液浸泡消毒，消毒時(shí)間設(shè)置為4，6，8，10，12 min，每隔2 min 用玻璃棒攪拌1 次，使漂浮在液面上方的材料能夠充分接觸消毒液，無菌水漂洗5 次，分裝于無菌培養(yǎng)瓶。每瓶接種1 個(gè)外植體，不同消毒時(shí)間均接種40 瓶，統(tǒng)計(jì)不同消毒時(shí)間的污染率和對(duì)外植體的傷害程度。

1.2.2 外植體的接種與培養(yǎng)

1.2.2.1 初代誘導(dǎo)培養(yǎng) 用無菌濾紙吸取外植體上的多余水分，將外植體切成大約1 cm 長(zhǎng)帶1 個(gè)腋芽或頂芽的莖段，接種在以MS 為基本培養(yǎng)基附加不同質(zhì)量濃度激素配比（6-BA 分別為0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L，NAA 分別為0.05，0.10，0.20 mg/L）的12 種誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種40 個(gè)腋芽和10 個(gè)頂芽。為降低污染率，每瓶接種2 個(gè)外植體。暗培養(yǎng)7 d 后轉(zhuǎn)為25 ℃光照培養(yǎng)16 h。研究不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響，30 d 后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率以及側(cè)芽和頂芽的萌發(fā)率。

1.2.2.2 繼代增殖培養(yǎng) 取已萌發(fā)1～2 cm 的單芽或切割叢生芽為單芽，接種在含不同質(zhì)量濃度激素配比（6-BA 分別為1.0，1.5，2.0 mg/L，NAA 分別為0.01，0.02，0.05 mg/L）的9 種增殖培養(yǎng)基上，每瓶接種2 個(gè)單芽，每種培養(yǎng)基接種10 瓶。25 ℃光照培養(yǎng)16 h，觀察記錄生長(zhǎng)情況，統(tǒng)計(jì)不同培養(yǎng)基對(duì)單芽增殖的影響，30 d 后計(jì)算平均增殖系數(shù)。

1.2.2.3 生根培養(yǎng) 取3～4 cm 長(zhǎng)的單株苗，分別接種于MS、1/2 MS、1/3 MS 添加不同質(zhì)量濃度IBA（0.1，0.2，0.5 mg/L）的9 種生根培養(yǎng)基中，每瓶接種2 個(gè)單株苗，每種培養(yǎng)基接種20 瓶。研究不同培養(yǎng)基對(duì)樹莓組培苗生根的影響，30 d 后統(tǒng)計(jì)生根率及根系生長(zhǎng)狀況。

1.2.3 組培苗的馴化移栽 組培苗的馴化移栽是植物組培快繁的重要環(huán)節(jié)，需要從無菌向有菌、高溫向變溫、高濕向低濕、弱光向強(qiáng)光等環(huán)境因素轉(zhuǎn)變。選用冀菲等[9]研究黑果枸杞組培苗馴化移栽的基質(zhì)，前期7 d 的煉苗階段與培養(yǎng)室環(huán)境相似，遮陰降低光照強(qiáng)度，噴灑自來水保濕且降低溫度，相對(duì)濕度為85%～90%；后期馴化階段與室外環(huán)境相近，逐漸增加自然光照。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

由表1 可知，先用75%的酒精對(duì)外植體消毒30 s，再用0.1%的HgCl2溶液消毒8 min 效果最好，污染率為7.5%，外植體顏色未發(fā)生變化；滅菌10 min的污染率仍為7.5%，但外植體顏色較消毒8 min變深，有褐變現(xiàn)象，受傷害程度較大；滅菌12 min的污染率為0，受傷害程度嚴(yán)重，嚴(yán)重影響外植體活性，會(huì)導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)率和成苗率降低。

表1 滅菌時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率及芽萌發(fā)的影響

外植體接種到培養(yǎng)基上，對(duì)于不易形成不定根的植物，需通過誘導(dǎo)的愈傷組織吸收養(yǎng)分和水分。以MS 為基本培養(yǎng)基，將無菌外植體莖段和莖尖接種于添加不同濃度激素配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7 d 后，在外植體切口處出現(xiàn)白色的愈傷組織，呈松散的不規(guī)則瘤狀；轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，愈傷組織顏色由白逐漸變綠，膨大突起，逐漸增殖變大變松散。30 d 后在愈傷組織表面觀察到綠色的不定芽，同時(shí)莖段側(cè)芽和頂芽萌發(fā)變長(zhǎng)。從表2 可以看出，不同激素配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響差異較大，在細(xì)胞分裂素6-BA 濃度一定時(shí)，隨著生長(zhǎng)素NAA 濃度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率相應(yīng)升高，其中，在4 種6-BA 濃度中，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 時(shí)，相應(yīng)誘導(dǎo)率均最高；在生長(zhǎng)素NAA 濃度一定的情況下，隨著6-BA 濃度的升高，愈傷組織誘導(dǎo)率變化不大，其中，當(dāng)NAA 質(zhì)量濃度為0.2 mg/L 時(shí)，相應(yīng)誘導(dǎo)率均最高。在愈傷組織形成不定芽的同時(shí)，頂芽和側(cè)芽均能夠萌發(fā)，但二者的萌發(fā)率不同，統(tǒng)計(jì)12 種培養(yǎng)基中所有側(cè)芽（480 個(gè)）和頂芽（120 個(gè)）外植體的萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn)，側(cè)芽的萌發(fā)率為80%，且在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)勢(shì)差異較大；頂芽的萌發(fā)率為100%，且生長(zhǎng)健壯，整齊一致。因此，最適合樹莓外植體愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基是MS＋6-BA1.0 mg/L＋NAA 0.20 mg/L，誘導(dǎo)率為96%，選取頂芽為外植體更合適。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)樹莓外植體愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)芽增殖的影響

取1～2 cm 生長(zhǎng)健壯攜帶少量愈傷組織的單株苗，接種在含不同濃度激素配比的增殖培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d 后，單株苗基部愈傷組織開始變大變綠，之后逐漸增大并再次分化出叢生不定芽，30 d 后統(tǒng)計(jì)平均增殖系數(shù)發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化叢生芽的能力不同，平均增殖系數(shù)不同，叢生芽的生長(zhǎng)勢(shì)差異較大。在6-BA 濃度一定時(shí)，隨著生長(zhǎng)素NAA濃度的升高，不定芽總數(shù)相應(yīng)升高，但是，在3 種6-BA 濃度中，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.5 mg/L 時(shí)，相應(yīng)不定芽總數(shù)均最高；在生長(zhǎng)素NAA 濃度一定時(shí)，當(dāng)6-BA 質(zhì)量濃度為1.5 mg/L 時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率均最高。所以，最適樹莓不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，平均增殖系數(shù)為9.70，玻璃化現(xiàn)象較輕，叢生芽生長(zhǎng)健壯（表3）。

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)不定芽增殖的影響

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)組培苗生根的影響

表4 不同培養(yǎng)基對(duì)組培苗生根的影響

取3～4 cm的健壯單株，分別接種于MS、1/2 MS、1/3 MS 添加不同濃度IBA 的生根培養(yǎng)基中，7 d 后組培苗基部愈傷組織膨大并生長(zhǎng)出白色根尖，14 d后根生長(zhǎng)速度加快，在主根上萌發(fā)出側(cè)根。30 d 后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基及IBA 濃度對(duì)樹莓組培苗生根的影響不同，生根速度及生根率差異明顯，在基本培養(yǎng)基一定時(shí)，隨著IBA 濃度的升高，生根率均相應(yīng)升高，其中，1/2 MS 基本培養(yǎng)基的生根率均最高；在IBA 濃度一定時(shí)，1/2 MS 基本培養(yǎng)基的生根率也是最高的，且根系生長(zhǎng)均正常。所以，最適組培苗的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L，生根率達(dá)97.5%，且主根比較健壯，側(cè)根數(shù)量多，植株生長(zhǎng)旺盛（表4）。

2.5 組培苗的馴化移栽

生根培養(yǎng)30 d，選擇根系生長(zhǎng)健壯、發(fā)育良好的組培苗，洗掉根部培養(yǎng)基，剪掉過多須根，僅留主根和部分側(cè)根，將幼苗移入熏蒸消毒基質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)泥炭土、蛭石、珍珠巖（體積比為2∶1∶1）營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)更適合組培苗的生長(zhǎng)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，移栽50 株，成活44 株，成活率高達(dá)88%，植株生長(zhǎng)健壯，與野生紅樹莓的外部形態(tài)特征相似度高。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，榆林沙區(qū)引種波爾卡樹莓的外植體最佳采集時(shí)間為4 月下旬，生長(zhǎng)活性強(qiáng)，褐變現(xiàn)象較輕；最適外植體材料為新梢頂芽，不僅易誘導(dǎo)形成愈傷組織，而且萌發(fā)率高；用HgCl2消毒最佳時(shí)間為8 min，最適樹莓愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.20 mg/L，最適樹莓不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS＋6-BA 1.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L，平均增殖系數(shù)為9.7，最適組培苗的生根培養(yǎng)基為1/2 MS＋I(xiàn)BA 0.5 mg/L，生根率達(dá)97.5%，且生長(zhǎng)勢(shì)良好，植株健壯。本研究體系能在較短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量多且遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)質(zhì)樹莓組培苗，對(duì)推動(dòng)榆林沙區(qū)樹莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。

在植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)過程中，出現(xiàn)污染是普遍現(xiàn)象，其中，外植體接種污染是主要原因，導(dǎo)致試驗(yàn)無法達(dá)到預(yù)期效果。用0.1%HgCl2溶液滅菌效果要好于10%的NaClO 溶液，但前者一旦污染對(duì)人傷害較大，操作要特別小心細(xì)致。消毒時(shí)間適宜控制在8 min 左右，易雙雙等[10]、林樹燕等[11]有相似報(bào)道。在外植體消毒、接種過程中，要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)規(guī)程操作，接種過程中要隨時(shí)用75%酒精擦拭雙手和臺(tái)面，以減少污染的發(fā)生。

在木本植物的組培過程中，易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象。褐變是由于植物組織中酚類物質(zhì)被多酚氧化酶（PPO）氧化后產(chǎn)生醌類物質(zhì)，逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中并累積起來，抑制細(xì)胞中其他酶的活性，毒害培養(yǎng)的外植體材料。在接種前預(yù)冷外植體、初代培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)、縮短轉(zhuǎn)瓶周期均可抑制褐化現(xiàn)象，李小艷等[12]在黑枸杞組織培養(yǎng)中得出類似的研究結(jié)果。外植體取材時(shí)間也是影響褐化的重要因素，在榆林沙區(qū)最適外植體取材時(shí)間是4 月下旬，可能是由于該時(shí)期幼嫩莖段部位酚類化合物含量低或多酚氧化酶活性低的原因。

在樹莓初代誘導(dǎo)培養(yǎng)中，多數(shù)學(xué)者以帶芽莖段和莖尖為外植體，MS 為基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素。二者的濃度及比值決定細(xì)胞分化的方向，由于所用激素藥品的效用不盡相同，采用的激素梯度和配比設(shè)計(jì)方法不同，導(dǎo)致最終得出的最適培養(yǎng)基配方有一定差異。本研究與畢海林等[13]研究的秋福樹莓組織培養(yǎng)相比，所用6-BA 濃度偏小，NAA 濃度相同；與孟靜靜等[14]研究的黑樹莓組培相比，6-BA 和NAA 濃度均偏大，但比值相近，原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

在樹莓不定芽的繼代增殖培養(yǎng)中，因選取的不定芽大小不同、不定芽是否攜帶愈傷組織以及統(tǒng)計(jì)的不定芽大小與時(shí)間不同而導(dǎo)致得出的增殖系數(shù)均有所差異。本研究選取1～2 cm 帶部分愈傷組織的不定芽，得出最適增殖培養(yǎng)基的6-BA、NAA 質(zhì)量濃度與國(guó)內(nèi)學(xué)者[15-17]的研究結(jié)果基本一致，即6-BA質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/L、NAA 質(zhì)量濃度多為0.05～0.20 mg/L。在統(tǒng)計(jì)不定芽的增殖系數(shù)時(shí)，衡量芽大小的指標(biāo)不確定，增殖系數(shù)有差異。同一培養(yǎng)基，相同長(zhǎng)度的芽，生長(zhǎng)過程中的增殖程度也不同，可能是由內(nèi)部生理生化代謝及培養(yǎng)環(huán)境的細(xì)微差異導(dǎo)致。另外，培養(yǎng)溫度、光照時(shí)間等環(huán)境因素也是影響增殖系數(shù)的因素，仍需進(jìn)一步深入細(xì)致地研究。

生根是木本植物獲得健壯組培苗的關(guān)鍵，合適的生長(zhǎng)素及濃度是誘導(dǎo)生根的重點(diǎn)。在木本植物組培苗的生根試驗(yàn)中，多數(shù)學(xué)者選用的生長(zhǎng)素是NAA與IBA，有二者混合使用[18-19]，也有NAA[20]或IBA[21]單獨(dú)使用。本試驗(yàn)通過對(duì)比得出，單獨(dú)使用IBA 生根率高，添加NAA 不能有效提高生根率，可能是由于樹莓組培苗在增殖培養(yǎng)過程中自身體內(nèi)合成了較多NAA 的緣故。

馴化移栽是植物組培苗發(fā)生質(zhì)的改變的一個(gè)階段，需要從無菌向有菌過渡，溫度、濕度、光照等因子都會(huì)發(fā)生變化。關(guān)于樹莓馴化移栽的文獻(xiàn)報(bào)道較少，冀菲等[9]研究了黑果枸杞組培苗馴化移栽的基質(zhì)，移栽成活率高；而本研究采用與黑果枸杞相同的基質(zhì)配方，移栽成活率略低，也低于不同基質(zhì)配方的樹莓移栽成活率[22]，可能與樹莓不同品種特性及環(huán)境的微控有關(guān)，仍需深入研究波爾卡樹莓品種的生理生化特性，優(yōu)化馴化移栽的關(guān)鍵環(huán)境因子，不斷提高移栽成活率，從而能為波爾卡樹莓組培苗的工廠化移栽提供技術(shù)保障。