UPLC法測定牛黃上清丸中連翹酯苷A的含量

龐 靜，王曉云，王 健，韓 笑

（秦皇島市食品藥品檢驗中心，河北 秦皇島 066000）

牛黃上清丸為甲類OTC，1977～2015年版《中國藥典》均有收載，處方來源于明代李梃《醫(yī)學(xué)入門》牛黃上清丸加減方，由人工牛黃、薄荷、菊花、荊芥穗、白芷、川芎、梔子、黃連、黃柏、黃芩、大黃、連翹、赤芍、當(dāng)歸、地黃、桔梗、甘草、石膏、冰片十九味藥組成，具有清熱瀉火，散風(fēng)止痛的功效。用于熱毒內(nèi)盛、風(fēng)火上攻所致的頭痛眩暈、目赤耳鳴、咽喉腫痛、口舌生瘡、牙齦腫痛、大便燥結(jié)[1-2]。

牛黃上清丸處方中的連翹，性苦，微寒，具清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效?，F(xiàn)行的牛黃上清丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[1]僅對連翹進(jìn)行了顯微鑒別和利用高效液相色譜法（HPLC）測定連翹酯苷A保留時間進(jìn)行鑒別，而無含量測定方法。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，連翹化學(xué)成分包括苯乙醇苷類、木脂素及其苷類、黃酮類、五環(huán)三萜類、揮發(fā)油類等[3-4]，其中連翹酯苷A含量明顯高于其他成分[5-6]，且提取方法簡單、易操作。在參考已有文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，本文選擇連翹酯苷A作為質(zhì)控的指標(biāo)性成分。連翹酯苷A的檢測方法多為HPLC[7-11]，測定過程較為耗時。本研究建立了超高效液相色譜（UPLC）快速測定牛黃上清丸中連翹酯苷A含量的方法，為牛黃上清丸的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ACQUITY UPLC?H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AG-135型電子天平（美國Mettler Toledo公司）；DL-1028H型超聲波清洗器（德國Bandelin公司）。

1.2 試藥

連翹酯苷A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111810-201415，含量94.1 %）；牛黃上清丸樣品（均為大蜜丸）由9個藥廠提供；甲醇、乙腈（美國MREDA，色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密稱取連翹酯苷A對照品14.82 mg，置入25 ml量瓶，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.5578 mg/ml的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取本品約1 g，剪碎，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入70 %甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理（功率600 W，頻率35 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70 %甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對照溶液制備 取處方中除去連翹以外的18味中藥材適量，按處方比例及制備工藝同法制成大蜜丸，并按2.1.2項下方法制備陰性對照溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈-0.05 %磷酸溶液（15:85）；流速為0.4 ml/min；檢測波長330 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為1 μl。在此條件下，連翹酯苷A峰的理論塔板數(shù)大于8000，與其他成分分離度良好，且陰性樣品無干擾，見圖1。

圖1 牛黃上清丸中連翹酯苷A含量測定UPLC色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.20，0.75，1.5，3.5，5.0 ml，分別置入25 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得不同濃度系列的對照品溶液。按2.2項下色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積，以濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=4 283 994.374X-17 312.540，r=0.9999（n=6）。結(jié)果表明，連翹酯苷A濃度在4.462～111.560 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 精密度 取2.1.1項下對照品溶液，精密量取3.5 ml，置入25 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按2.2項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，結(jié)果峰面積RSD為0.70 %，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取同一均勻樣品（批號15015669），平行取樣6份，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件分別進(jìn)樣測定。結(jié)果連翹酯苷A平均含量為1.0886 mg/g，RSD為0.93 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于配置后在室溫下放置0，4，8，12，16，20，24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果連翹酯苷A峰面積RSD為1.08 %，表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率測定 取已知含量（批號15015669，含量：1.0886 mg/g）的樣品9份，每份約0.5 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，分別精密加入2.1.1項下連翹酯苷A對照品溶液（0.5578 mg/ml）0.5，1.0，1.5 ml，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進(jìn)樣測定，測得連翹酯苷A的平均加樣回收率為100.08 %，RSD為0.87 %（n=9），見表1。

表1 連翹酯苷A加樣回收率測定結(jié)果

2.4 樣品測定

取9個不同廠家的9批次的牛黃上清丸，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，并按2.2項下色譜條件測定含量，測定結(jié)果見表2。

表2 連翹酯苷A含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取方法的選擇

通過查閱文獻(xiàn)[8-14]，選擇了純甲醇、70 %甲醇、30 %甲醇、水分別為提取溶劑進(jìn)行提取，結(jié)果以70 %甲醇提取的含量最高。在提取方式上，對超聲處理30 min、加熱回流1 h及超聲處理30 min之后再加熱回流1 h 3種方式進(jìn)行比較，結(jié)果3種方式得到的連翹酯苷A含量差異不大。所以最終確定提取方法為以70 %甲醇為溶劑，超聲處理30 min。

3.2 流動相的選擇

本試驗比較了乙腈-0.4 %冰醋酸溶液（15:85）、乙腈-0.05 %磷酸溶液（15:85）系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果以乙腈-0.05 %磷酸溶液（15:85）為流動相時，連翹酯苷A峰形良好且陰性無干擾。