UPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定連翹中4種成分的含量

劉 芳，魏 娟,，張曉燕,，熊先明，祝 宇,，余世榮*

（1.十堰市人民醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院）藥學(xué)部，湖北 十堰 442000；2.武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000；3.兵兵宏康中藥飲片（十堰）有限公司；湖北 十堰 442510）

連翹是木犀科植物連翹Forsythia suspense(Thunb.) Vahl的干燥果實(shí)，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效，按采收期的不同分為分青翹和老翹[1]。主要含苯乙醇苷類(lèi)、黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、萜類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)等化合物[2-5]?！吨袊?guó)藥典》2015年版中規(guī)定以代表性的苯乙醇苷（連翹酯苷A）和木脂素類(lèi)化合物（連翹苷）為連翹藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。然而根據(jù)中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，單一的成分很難全面反映連翹藥材質(zhì)量，采用多個(gè)指標(biāo)性成分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)更具有科學(xué)性和全面性。

現(xiàn)代藥理研究表明，槲皮素具有抗心肌缺血再灌注損傷、抗炎、抗腫瘤、抗高尿酸、抗高血糖等作用[6-10]。連翹酯苷B具有顯著的抗炎抑菌、抗氧化的作用[11-12]。因此將其作為連翹的指標(biāo)性成分進(jìn)行研究，補(bǔ)充完善藥典中連翹藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity H CLASS超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；CP214電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；H1650-W微量臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；2013QT超聲波清洗器（北京碳?xì)涑暡ㄇ逑礄C(jī)有限公司）。

1.2 試藥

連翹苷，連翹酯苷A，連翹酯苷B，槲皮素對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)wkp18012210，wkp19010907，wkp18100801，wkp19011509，純度≥98 %）；數(shù)批連翹（青翹）樣品采自湖北省十堰市鄖縣十字溝（批號(hào)：20180801， 20180802，20180803），經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳科力教授鑒定為正品；乙腈，甲醇為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），預(yù)柱（1.7 μm，VANGUARD）；以0.2 %的甲酸溶液為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫：0～15 min，90 %～70 %A；15～25 min ，70 %～30 % A；柱溫：35 ℃；流速：0.3 ml/min；在330 nm波長(zhǎng)下測(cè)定連翹酯苷B和連翹酯苷A的含量，在277 nm波長(zhǎng)下測(cè)定連翹苷含量，在254 nm波長(zhǎng)下測(cè)定槲皮素含量。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品細(xì)粉（過(guò)3號(hào)篩，50目）約1 g，精密稱(chēng)定，于50 ml具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱(chēng)定重量，浸漬過(guò)夜，超聲處理（250 W，40 kHz）25 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 ml置于干鍋中蒸至近干，加入0.5 g中性氧化鋁拌勻烘干，加在中性氧化鋁柱（100～120目，1 g，內(nèi)徑為1～1.5 cm）上，用70 %乙醇80 ml洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘?jiān)?0 %甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶，并稀釋至刻度，搖勻，離心，取上清即得。

2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷、槲皮素對(duì)照品，加70 %的甲醇制成每1 ml分別含0.42，0.92，0.51，0.49 mg混合對(duì)照品溶液，搖勻，低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取連翹樣品，按照2.2項(xiàng)方法制成供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，得到樣品的UPLC色譜圖。參照4個(gè)對(duì)照品的色譜行為及其DAD紫外檢測(cè)光譜圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。在樣品色譜圖上對(duì)其峰進(jìn)行指認(rèn)，標(biāo)定了4個(gè)成分，它們分別是圖1中連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷和槲皮素。

圖1 UPLC色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 為分析各藥材標(biāo)定成分的含量分布，按如下方法研究了各標(biāo)定成分的線性回歸分析參數(shù)：為分析各藥材標(biāo)定成分的含量分布，按如下方法研究了各標(biāo)定成分的線性回歸分析參數(shù)：精密吸取連翹酯苷B儲(chǔ)備液（0.42 mg/ml）1，2，3，4，5 μl；連翹酯苷A儲(chǔ)備液（0.92 mg/ml）1，2，3，4，5 μl；連翹苷儲(chǔ)備液（0.51 mg/ml）2，3，4，5，6 μl；槲皮素儲(chǔ)備液（0.49 mg/ml）0.2，1.4，2.6，3.8，5 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，各成分回歸方程分析參數(shù)見(jiàn)表1。結(jié)果表明連翹酯苷B、連翹酯苷A、連翹苷和槲皮素分別在進(jìn)樣量為0.42～2.10，0.92～4.60，1.02～3.06，0.098～2.45 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 4種成分線性關(guān)系考察試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄其保留時(shí)間和峰面積，結(jié)果表明峰面積的RSD分別為0.28 %，0.73 %，1.35 %和0.57 %，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（批號(hào)20180801），分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄其峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果表明其RSD分別為0.61 %，0.93 %，1.57 %和1.74 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)20180801），按2.2項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算4種成分含量，其RSD分別為1.81 %，2.04 %，2.61 %和2.39 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的連翹粉末樣品（批號(hào)20180801）6份，各約1 g，精密稱(chēng)定，分別精密加入15ml連翹酯苷B（0.42 mg/ml）、連翹酯苷A（0.92 mg/ml）、連翹苷（0.51 mg/ml）和7.65 ml槲皮素（0.49 mg/ml），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 連翹中4種成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取3批連翹樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種成分含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

比較了超聲提取、加熱回流提取和過(guò)中性氧化鋁柱子提取3種提取方式，發(fā)現(xiàn)用第3種提取方式得到的色譜圖峰數(shù)較多，能同時(shí)檢測(cè)到4種成分，峰形較好，分離狀況令人滿意，故選擇過(guò)中性氧化鋁柱子的提取方式。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

用PDA檢測(cè)器對(duì)樣品在210～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)連翹酯苷B和連翹酯苷A最大波長(zhǎng)為330 nm，連翹苷和槲皮素分別在277 nm和254 nm波長(zhǎng)下有最大吸收，分別在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定4種成分的含量。

3.3 流動(dòng)相的選擇

分別考察了乙腈-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸、乙腈-甲酸為流動(dòng)相時(shí)色譜峰的分離效果。結(jié)果，以乙腈-0.2 %甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)分離效果最佳，色譜峰的分離度及峰形均良好，故最終選擇乙腈-0.2 %甲酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.4 UPLC與HPLC色譜的對(duì)比

對(duì)UPLC和HPLC的供試品色譜圖進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，UPLC具有更高的分離度、靈敏度和更快的分離速度，單位時(shí)間內(nèi)能提供更多的信息量，同時(shí)更節(jié)省流動(dòng)相。

本文采用UPLC法同時(shí)測(cè)定連翹藥材中4種成分含量，避免了單個(gè)成分測(cè)定帶來(lái)的繁瑣步驟，減少了流動(dòng)相的配制和供試品的制備步驟，有效的提高了分析速度，縮短分析周期。該方法簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確且靈敏度高，可為連翹質(zhì)量評(píng)價(jià)的科學(xué)性和全面性提供一定的參考。