HPLC-MS/MS測定大鼠血漿中的葉酸濃度及其藥動學研究

戚 敏，王 芳，逯海燕，劉 琳，劉愛明，徐玲玲，陳 凱，賈慶文，王本偉

（山東省藥學科學院 新藥評價中心，山東 濟南 250101）

葉酸是一種水溶性維生素，其母體化合物是由喋啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結合而成的。葉酸在人體內主要參與嘌呤和嘧啶核苷酸的合成和轉化，參與構成含鐵的血紅蛋白，參與蛋白質的代謝等，是細胞生長和繁殖所必需的物質[1-2]，臨床可用于預防神經管畸形，還可用于治療慢性萎縮性胃炎、抑制支氣管鱗狀轉化及防治高同型半胱氨酸血癥引起的冠狀動脈硬化癥、心肌損傷與心肌梗塞等[3-4]。研究表明葉酸還能抑制腫瘤細胞中癌基因的表達，從而阻斷惡性腫瘤的進展[5]，但有研究認為過量攝入葉酸可能會增加發(fā)生乳腺癌的風險[6-8]，因此準確定量血中葉酸含量的尤為重要。目前葉酸在機體內的檢測主要有微生物測定法[9]、放射免疫測定法、色譜分析法[10]等，這些方法在專屬性、靈敏度等方面都存在一定的局限性，且樣品用量比較大，處理也較費時費力。本研究基于高效液相色譜和三重四極桿質譜技術的聯(lián)用（HPLC-MS/MS）建立了一種靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快的新型葉酸檢測方法，并用于藥動學研究，為其臨床用藥提供有益的參考。

1 儀器、試劑與動物

1.1 儀器

Agilent 1260-6430液相質譜聯(lián)用系統(tǒng)（LCMS/MS，安捷倫），包括G1379B型脫氣機，G1312B型二元輸液泵，G1367E型自動進樣器，G1330B型控溫模塊，G1316A型柱溫箱，6430 MS/MS系統(tǒng)及Mass Hunter數(shù)據(jù)采集軟件；XL16K-T臺式高速冷凍離心機（湖南湘立科學儀器公司）；Advantage A10 Milli-Q超純水機[默克化工技術（上海）公司]；Vortex Genius 3渦旋儀（廣州儀科實驗技術公司）。

1.2 試劑

葉酸（批號：100074-201214，純度89.7 %），格列本脲（批號：100135-201105，內標，純度99.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（批號：154451，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；甲酸（批號：BCBM5443V，色譜純，Sigma-Aldrich）；二甲亞砜（分析純，國藥集團）；超純水。

1.3 動物

SD大鼠24只，體重180～220 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供[動物許可證號：SCXK（京）2012-0001]，在溫度25 ℃、濕度60 %±5 %條件下適應1周。隨機分成3組，每組8只，雌雄各半，灌胃給予葉酸溶液，給藥劑量分別為0.8，2.4，8 mg/kg體重。給藥前12 h禁食，自由飲水。分別于給藥前，給藥結束0.5，1，2，4，6，8，24 h頸靜脈取血0.2 ml，置入預涂肝素鈉的離心管，4℃、4000 r/min離心10 min，取上層血漿，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法學驗證

2.1 HPLC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱為Thermo Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相為0.1 %甲酸-水（A）與乙腈（B），洗脫梯度：0～0.5 min，5 % B；0.5～2.2 min，5 %→95 %B；2.2～3.2 min，95 %B；3.21～6 min，5 %B。樣品檢測時間：6 min；流速：0.4 ml/min；進樣量：5 μl；柱溫：40 ℃。

質譜條件：離子化方式：電噴霧-正離子；干燥氣：N2；干燥氣流速10 L/min，干燥氣壓力40 psi，干燥氣溫度350 ℃，毛細管電壓4000 V。監(jiān)測方式：多反應監(jiān)測（MRM）。葉酸母離子及子離子為m/z442.2→295.1，碎片電壓100 V，碰撞能量10 eV；格列本脲母離子及子離子為m/z494.2/369.0，碎片電壓130 V，碰撞能量9 eV。

2.2 溶液配制

精密稱取葉酸10 mg，置入10 ml量瓶，加二甲亞砜5 ml超聲溶解，乙腈定容至刻度，配制濃度為1.0 mg/ml的儲備液 ，加乙腈稀釋，分別配制不同濃度的葉酸溶液。精密稱取格列苯脲10 mg，置入10 ml量瓶，乙腈溶解并定容至刻度，配制濃度為1.0 mg/ml的內標儲備液。

2.3 樣本處理方法

取血漿樣品30 μl，置入1.5 ml離心管，加入乙腈（含內標50 ng/ml）150 μl，渦旋混勻1 min，加超純水100 μl，渦旋混勻1 min，12 000 r/min 4 ℃，離心5 min，取上清進樣檢測。

2.4 專屬性

取空白血漿30 μl，按2.3項方法操作，得空白質譜圖（見圖1A）；取1000 ng/ml的葉酸溶液10 μl，加空白血漿90 μl，渦旋后取30 μl，按2.3項方法操作，得分析物質譜圖（見圖1B）；取給藥后2 h的血漿樣品30 μl，按2.3項方法操作，得血漿樣品質譜圖（見圖1C）。葉酸和內標的保留時間分別為2.58，3.63 min，內源性物質不干擾待測物的準確定量。

圖1 葉酸和內標物質譜圖

2.5 殘留效應

在進樣標準曲線濃度最高點后進樣空白樣品，評價殘留效應，結果顯示葉酸的殘留量小于定量下限的10 %，說明殘留不影響葉酸的準確定量。

2.6 線性和定量下限

分別配制10，25，50，100，250，500，1000 ng/ml的血漿樣本溶液，按2.3項方法操作處理。以葉酸的濃度為橫坐標（X），葉酸與內標物的峰面積比值為縱坐標（Y），用加權最小二乘法（權重為1/X2）進行回歸運算，求得的直線方程即為標準曲線?；貧w方程為Y=0.1272（±0.0050）X+0.0056（±0.0021），r=0.9971，表明葉酸在10～1000 ng/ml范圍內線性關系良好。取濃度為10 ng/ml的血漿樣本，按2.3項方法操作處理，進樣檢測，平行測定6個樣本。結果準確度為89.1 %，精密度為6.0 %。均符合生物樣本的檢測要求。

2.7 準確度和精密度

分別配制定量下限（10 ng/ml）、低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）4個濃度的血漿標準樣本溶液，按2.3項方法操作，每一濃度5個平行樣本，以標準曲線算得葉酸的濃度，并計算其批內準確度和精密度。連續(xù)處理3個分析批，計算葉酸的批間準確度和精密度。結果見表1。

表1 葉酸的批內和批間準確度與精密度（n=5）

2.8 回收率和基質效應

分別配制低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個濃度的標準溶液，每一濃度6個平行樣本，按2.3項方法操作，得到的峰面積為set1。分別配制低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個濃度的血漿樣本溶液，每一濃度6個平行樣本，按2.3項方法操作，得到的峰面積為set2。分別取低（20 ng/ml）、中（80 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個濃度的標準溶液30 μl，加入提取后的空白血漿溶液150 μl，再加入100 μl水，渦旋混勻，每一濃度6個平行樣本，進樣檢測，峰面積為set3。以set3/set1計算基質效應；以set2/set3計算提取回收率。結果見表2。

表2 葉酸和內標的回收率和基質效應（，n=6）

表2 葉酸和內標的回收率和基質效應（，n=6）

化合物 理論濃度/ng·ml-1回收率/%基質效應/%葉酸 20 80.0±4.1 102.9±4.4 80 95.4±4.4 103.0±5.6 800 93.0±4.7 104.8±5.1內標 50 95.6±5.1 93.5±3.2

2.9 穩(wěn)定性考察

分別配制低（10 ng/ml）、中（100 ng/ml）、高（800 ng/ml）3個濃度的血漿標準樣本溶液，每一濃度6個平行樣本，分別考察3個冷凍（-20 ℃）-解凍（室溫）周期穩(wěn)定性、室溫短期6 h穩(wěn)定性、長期30 d穩(wěn)定性（-20 ℃）和樣品制備后在自動進樣器15 ℃放置24 h穩(wěn)定性。結果見表3。

表3 葉酸的穩(wěn)定性（n=6）

2.10 藥動學結果

大鼠血漿樣本從冰箱取出，室溫解凍，取30 μl，置入1.5 ml離心管，按2.3項方法操作，依隨行標準曲線計算血漿樣本的濃度。用DAS3.0軟件采用非房室模型計算藥動學參數(shù)。結果見表4和圖2。

3 討論

3.1 空白血漿的選擇

由于葉酸是內源性化合物，空白血漿可能會產生干擾，因此在方法學驗證中對大鼠空白血漿進行了篩選，最終選擇不干擾葉酸準確定量（干擾較?。┑目瞻籽獫{進行方法學驗證。

表4 大鼠灌胃給予葉酸溶液后藥動學參數(shù)（ ，n=8）

表4 大鼠灌胃給予葉酸溶液后藥動學參數(shù)（ ，n=8）

參數(shù) 劑量/mg·kg-1 0.8 2.4 8 Cmax/ng·ml-1 157.4±69 259.9±126 335.0±98 Tmax/h 0.8±0.3 1.1±0.5 1.4±0.6 t1/2/h 5.4±1.2 5.1±1.2 4.4±0.9 AUC0-24 h/h·ng·ml-1 710.0±176 1092.1±567 2047.8±654 AUC0-∞/h·ng·ml-1 791.0±199 1156.0±563 2234.2±717 AUC0-24 h/AUC0-∞/% 89.8 94.5 91.7

圖2 大鼠灌胃給藥后血漿中平均藥物濃度-時間曲線

3.2 色譜條件優(yōu)化

本研究對不同的流動相和色譜柱進行了考察，最終選擇乙腈和0.1 %的甲酸-水做為流動相，梯度洗脫；色譜柱選擇Thermo Accucore C18柱（50 mm×2.1 mm，2.6 μm）；具有較好的分離度和色譜峰型，且血漿中內源性化合物不會干擾分析物和內標的離子化。

葉酸和內標格列本脲的質譜參數(shù)采用Agilent optimizer軟件自動優(yōu)化，獲得的離子對、碎片電壓和碰撞能量均能滿足方法靈敏度要求。

3.3 血漿樣本處理方法的優(yōu)化

葉酸是水溶性維生素，極性相對較大，采用血漿加有機溶劑的蛋白沉淀方法進行預處理，葉酸的回收率小于10 %，重現(xiàn)性較差。固相萃取方法雖能滿足方法學要求，但處理過程繁瑣、耗時，成本高。我們在研究中發(fā)現(xiàn)采用有機溶劑進行蛋白沉淀后添加適量的純化水，葉酸的回收率達80 %。因此在本研究中樣本處理方法采用在蛋白沉淀后添加水的方式，既能保證方法的重現(xiàn)性，又可提高檢測效率。

3.4 藥動學結果

由于大鼠血漿中存在葉酸，因此本研究選擇先扣除零點基線，再進行藥動學參數(shù)統(tǒng)計。大鼠灌胃給藥后葉酸在1 h左右達到最大濃度，且隨著給藥劑量的增加達峰時間有延后的趨勢。Cmax和AUC0-∞在低、中、高3個劑量下的比值分別為1:1.7:2.1和1:1.5:2.9，葉酸在大鼠體內的最大血藥濃度和暴露量隨劑量的增加而增大，但和劑量不成線性相關。低、中、高3個劑量下AUC0-24h和AUC0-∞的比值均在90 %左右，說明采樣點設計較合理，采集24 h內的血漿樣品能滿足對藥動學參數(shù)的評估。

本研究基于HPLC-MS/MS技術建立了大鼠血漿中葉酸的分離分析方法，并進行了方法學考察，成功應用于SD大鼠灌胃給予葉酸溶液后血漿中葉酸的濃度檢測。此方法血漿用量少，靈敏度高，重現(xiàn)性好。