微生物發(fā)酵技術(shù)對廣味香腸安全性提升的研究

田甜，詹銳琪，張雅琳，潘攀,孫勁松，張巍，王新惠，劉洋*

(1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，成都 611130；2.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106)

廣味香腸作為中國特色的傳統(tǒng)腌臘肉制品之一，因其獨(dú)特的風(fēng)味深受消費(fèi)者喜愛。傳統(tǒng)廣味香腸發(fā)酵主要依靠自然發(fā)酵，存在亞硝酸鹽殘留量高、生物胺含量高和脂肪氧化嚴(yán)重等食用安全性問題，已受到國內(nèi)外研究人員的高度關(guān)注，如何提升廣味香腸的食用安全性，已成為研究的熱點(diǎn)課題之一。Kim等和楊晶等[1,2]研究表明，乳酸菌可分泌亞硝酸鹽還原酶，在厭氧條件下可降解亞硝酸鹽，可顯著降低香腸中亞硝酸鹽的殘留量；Gardini等和Komprda等[3,4]研究表明，Pediococcuspentosaceus和Staphylococcusxylosus可促進(jìn)生物胺的降解；酵母菌可促進(jìn)香腸風(fēng)味的形成[5]。由此可見，采用優(yōu)良微生物發(fā)酵制作香腸，可控制香腸中的優(yōu)勢菌群，并可利用微生物的獨(dú)特性能改善發(fā)酵香腸的風(fēng)味和安全性[6-8]。

本文將戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)5種微生物制備成的復(fù)合發(fā)酵劑接種于廣味香腸中，以自然發(fā)酵為對照，測定分析了香腸發(fā)酵過程中pH、Aw、亞硝酸鹽殘留量、組胺含量和酸價等，旨在研究復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸安全性的影響，以期為改善傳統(tǒng)廣味香腸質(zhì)量和食品安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原輔料

衛(wèi)生檢疫合格的新鮮豬肉、腸衣、食用級食鹽、味精、蔗糖等：均購于成都龍泉驛區(qū)成都大學(xué)十陵鑫大百貨超市。

1.2 復(fù)合發(fā)酵劑

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)和清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)：均由肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從自然發(fā)酵的香腸中分離獲得，5種菌以1∶1∶1∶1∶1制作成凍干粉。

1.3 主要試劑

磷酸組胺標(biāo)準(zhǔn)品和衍生劑丹磺酰氯：購于Sigma公司；乙腈(Bessldorf公司)、正丁醇、三氯甲烷、乙酸、乙酸銨、氯化鈉、鹽酸、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、亞鐵氰化鉀、亞硝酸鈉、氫氧化鉀、酚酞、乙醇、乙酸鋅、對氨基苯磺酸等：均為國產(chǎn)分析純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.4 主要儀器與設(shè)備

Testo 205肉類專用pH計(jì) 德國儀表國際貿(mào)易(上海)有限公司；HD-3A型智能水分活度儀 無錫市華科儀器儀表有限公司；JA3103N電子天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；RC-III-20L超純水機(jī) 成都瑞昌儀器制造有限公司；LD-5離心機(jī) 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；721可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.5 香腸制作

1.5.1 香腸配方

瘦肉∶肥肉為3∶1，其他輔料的比重按照肉的重量計(jì)，蔗糖0.3%，鹽2.6%，葡萄糖0.4%，抗壞血酸(維生素C)0.06%，NaNO2150 mg/kg，水5%，添加復(fù)合發(fā)酵劑0.04%，不添加其他香辛料。

1.5.2 工藝流程

原料肉→修整→腌制→絞碎→拌料→灌腸→發(fā)酵→成熟。

1.5.3 操作要點(diǎn)

將豬肉切成1.5～2 mm左右同樣大小的肉丁，將切好的肉丁在冰箱冷藏室(3～7 ℃)冷藏24 h，加入調(diào)料，混合均勻后再在低溫下腌制24 h；直投入凍干復(fù)合發(fā)酵劑，接種量為0.04%(W/W)，然后采用手工灌腸，每節(jié)香腸大概是10 cm，用針扎香腸中有氣泡的地方；灌好的香腸掛放在恒溫恒濕發(fā)酵箱中，控制發(fā)酵溫度在20～25 ℃，相對濕度在91%～96%，發(fā)酵3 d，最后控制溫度在16～18 ℃，相對濕度是75%～80%，直到香腸成熟，以自然發(fā)酵為對照。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 Aw值的測定

取香腸前、中、后三部分的肉切碎，混勻，每次稱量5 g肉平鋪在水分活度儀測定盒的底部，稱量3次，取平均值。

1.6.2 pH值的測定

采用德國Testo 205肉類專用pH計(jì)穿刺電極插入香腸前、中、后重復(fù)測定3次，取平均值。

1.6.3 酸價的測定

參照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》測定香腸中的酸價[9]。

1.6.4 亞硝酸鹽的測定

依據(jù)GB 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》方法測定香腸中亞硝酸鹽的含量[10]。

1.6.5 組胺的測定

參考王新惠等[11]的方法測定香腸中的組胺含量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

每個樣品做3次平行檢測。數(shù)據(jù)分析采用Matlabver.2006b(Mathworks Inc.，Natick，MAUS)和Microsoft Excel(Microsoft，Redmond，Washington，US)。所有數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸pH值的影響

接種復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸pH值的影響見圖1。

圖1 接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸和自然發(fā)酵香腸pH的變化Fig.1 Changes of pH of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermentated sausage

由圖1可知，自然發(fā)酵組隨著時間的延長，pH降低，接種發(fā)酵劑組的pH隨著時間的延長先降低后緩慢上升，在發(fā)酵第9天時，發(fā)酵劑組的pH值最低達(dá)4.51，最后，接種復(fù)合劑發(fā)酵的香腸pH值是4.57，自然發(fā)酵組的pH值是5.41，接種組的pH值比自然發(fā)酵組低15.53%。

接種發(fā)酵組中的戊糖片球菌和清酒乳桿菌都具有較強(qiáng)的碳水化合物分解能力[12,13]，在香腸的發(fā)酵和成熟過程中會產(chǎn)生大量乳酸，使pH值快速下降。pH值在達(dá)到最低值后都有緩慢的回升，最后趨于穩(wěn)定，出現(xiàn)這樣的情況可能是由于微生物或酶的作用分解蛋白質(zhì)后產(chǎn)生的堿性物質(zhì)對發(fā)酵期間產(chǎn)生的酸起到了緩沖作用，也有可能是乳桿菌在生長繁殖的過程中產(chǎn)生了大量的乳酸后抑制了自身的生長。pH是香腸在發(fā)酵過程中的關(guān)鍵指標(biāo)，低pH值是食品防腐的重要柵欄因子，是控制發(fā)酵香腸安全的關(guān)鍵因素之一，pH值在4.6以下可提升香腸的微生物衛(wèi)生指標(biāo)[14]。本實(shí)驗(yàn)中接種復(fù)合發(fā)酵劑組發(fā)酵結(jié)束時pH值達(dá)到4.57，低于4.6，而對照組是5.41。由此可見，添加復(fù)合發(fā)酵劑可通過降低廣味香腸的pH值來提升香腸的安全性。

2.2 接種復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸Aw值的影響

接種復(fù)合發(fā)酵劑廣味香腸的Aw值隨時間的變化見圖2。

圖2 接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸和自然發(fā)酵香腸Aw的變化Fig.2 Changes of Aw of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermented sausage

由圖2可知，自然發(fā)酵和添加復(fù)合發(fā)酵劑的廣味香腸的Aw隨著時間的延長而降低，Aw值在發(fā)酵第3天后快速降低。在第15天后，兩組香腸的Aw值都達(dá)到一個較平穩(wěn)的狀態(tài)，自然發(fā)酵組最后的Aw值是0.798，而接種組的Aw值是0.779，接種組的Aw值比自然發(fā)酵組低2.38%。

Aw值也屬于柵欄因子，快速降低發(fā)酵食品的Aw有利于抑制有害微生物的增長，當(dāng)Aw值低于0.9時，食品中許多有害微生物的代謝會受到抑制[15]。由圖2還可知，自然發(fā)酵和接種發(fā)酵香腸的Aw值都在一個安全值下，最后，接種香腸的Aw值是0.779，而自然發(fā)酵香腸的Aw值是0.798。在整個過程中接種發(fā)酵劑的Aw值始終比自然發(fā)酵香腸的Aw值低，Marcos等發(fā)現(xiàn)接種肉葡萄球菌和清酒乳酸桿菌后，發(fā)酵環(huán)境中的蛋白酶活性會增加[16]，所以接種發(fā)酵劑的香腸蛋白質(zhì)發(fā)生降解，香腸的持水性降低，凝膠保水性降低，導(dǎo)致廣味香腸中的水分更容易丟失[17]?？梢?，添加合適的發(fā)酵劑可以提高香腸的食用安全性。

2.3 接種復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸酸價的影響

接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的酸價隨時間的變化見圖3。

圖3 接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸和自然發(fā)酵香腸酸價的變化Fig.3 Changes of acid value of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermented sausage

由圖3可知，接種香腸和自然發(fā)酵香腸的酸價都隨著時間的延長而增大，但是接種香腸的酸價低于自然發(fā)酵。在后期，廣味香腸的酸價上升很快，最后，自然發(fā)酵香腸的酸價是4.5 mg/kg，接種發(fā)酵香腸的酸價是4.22 mg/kg，接種發(fā)酵香腸比自然發(fā)酵香腸低6.22%。

香腸因?yàn)槭侨庵破?，在發(fā)酵和成熟過程中，難免會發(fā)生脂肪的氧化。脂肪的氧化分為兩步，脂肪進(jìn)行水解，進(jìn)而發(fā)生氧化。脂肪氧化生成的小分子醛酮物質(zhì)正是香腸的風(fēng)味來源，適當(dāng)?shù)闹狙趸怯幸娴?，過度的脂肪氧化會導(dǎo)致食物的酸敗，產(chǎn)生“哈喇味”，酵母和凝固酶陰性球菌因?yàn)閷Πl(fā)酵食品的風(fēng)味有所貢獻(xiàn)，所以經(jīng)常作為發(fā)酵劑用于發(fā)酵食品[18]。

張大磊等發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵環(huán)境中，主要是葡萄球菌和微球菌產(chǎn)生脂肪水解酶[19]，而在香腸發(fā)酵的前期，香腸的酸價緩慢上升，可能是因?yàn)榍捌诮湍妇腿樗峋脑鲩L會消耗大量的氧氣，不僅可以通過降低發(fā)酵環(huán)境的pH值來抑制脂肪氧化酶的活性，還可以抑制發(fā)酵產(chǎn)品的酸敗[20]。在后期，酵母的需氧量減少，前期積累的游離脂肪酸開始氧化，導(dǎo)致酸價急劇升高。

2.4 接種復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸亞硝酸鹽的影響

接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的亞硝酸鹽含量隨時間的變化見圖4。

圖4 接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸和自然發(fā)酵香腸亞硝酸鹽的變化Fig.4 Changes of nitrite of sausage inoculated with compoundfermentation agent and natural fermented sausage

由圖4可知，發(fā)酵初期，自然發(fā)酵和接種香腸都增加，在第3天后，亞硝酸鹽的含量開始降低，在第23天后，亞硝酸鹽含量開始增加，最后達(dá)到一個比較平衡的狀態(tài)。最后，接種香腸的亞硝酸鹽含量為1.95 mg/kg，而自然發(fā)酵組的亞硝酸鹽含量為2.17 mg/kg，接種香腸的亞硝酸鹽含量比自然發(fā)酵香腸低10.14%。

在香腸發(fā)酵初期，發(fā)酵環(huán)境中的菌群種類豐富，所以雜菌較多，雜菌可以將硝酸鹽大量轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，并且在初期發(fā)酵劑的豐度比較小，綜上可知，從發(fā)酵后的第3天開始，亞硝酸鹽的降低可能有3個原因：第一，pH的繼續(xù)下降，雜菌的代謝開始得到抑制，無法轉(zhuǎn)化硝酸鹽為亞硝酸鹽；第二，亞硝酸鹽在一定的酸性條件下能生成亞硝酸，從而與肌紅蛋白反應(yīng)，發(fā)酵環(huán)境中的亞硝酸鹽含量開始降低；第三，乳酸菌屬等產(chǎn)生的亞硝酸還原酶還原了亞硝酸鹽。后期亞硝酸鹽的增長可能是因?yàn)榉纸獾鞍踪|(zhì)積累了大量的氨，環(huán)境中的亞硝酸單胞菌進(jìn)行硝化作用導(dǎo)致亞硝酸鹽增長[21]。亞硝酸鹽在肉制品中常用作著色劑、抗氧化劑和抑菌劑，最重要的是可以抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長[22]，所以目前沒有其他添加劑可以代替它。但是亞硝酸鹽在食物中殘留過大，會導(dǎo)致身體組織缺氧而使健康受損，最大的憂患是亞硝酸鹽和胺類物質(zhì)生成致癌致畸的亞硝胺。

2.5 接種復(fù)合發(fā)酵劑對廣味香腸組胺的影響

接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸的組胺含量隨時間的變化見圖5。

圖5 接種復(fù)合發(fā)酵劑香腸和自然發(fā)酵香腸組胺的變化Fig.5 Changes of histamine of sausage inoculated with compound fermentation agent and natural fermented sausage

由圖5可知，自然發(fā)酵和接種香腸的組胺含量從發(fā)酵第1天以后開始增加，在第3天后開始下降，第8天到第28天時，香腸內(nèi)的組胺含量比較平穩(wěn)，但是在第28天后組胺含量短暫上升后降低。最后，接種香腸的組胺含量為1.14 mg/kg，而自然發(fā)酵香腸的組胺含量為1.51 mg/kg，接種香腸的組胺含量比自然發(fā)酵香腸低24.5%。

組胺的生成要有游離的組氨酸和可以產(chǎn)生氨基酸脫羧酶的微生物。起初，發(fā)酵環(huán)境中大量的菌群利用游離的組氨酸快速地生成組胺，導(dǎo)致在初期組胺的含量增高。在乳酸菌屬等產(chǎn)生乳酸后，發(fā)酵環(huán)境的pH開始下降，氨基酸脫羧酶的活性開始受到限制，并且發(fā)酵環(huán)境中雜菌的生長也被抑制，所以組胺的含量并沒有繼續(xù)增加。許多的微生物可以產(chǎn)生組胺降解酶等來減少組胺，Lu等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵劑中的清酒乳酸桿菌和木糖葡萄球菌可以降低香腸內(nèi)的組胺含量[23]，所以在第3天后，組胺的含量降低并且保持在一個較穩(wěn)定的水平。在第28天后，組胺的突然增長可能是因?yàn)榘l(fā)酵環(huán)境中的pH出現(xiàn)短暫的增高，導(dǎo)致對氨基酸脫羧酶的活性抑制解除了，積累的氨基酸脫羧酶快速作用于組氨基酸，所以組胺會出現(xiàn)短暫的升高后降低。組胺和酪胺是生物胺中毒性最強(qiáng)的，誤食過量組胺會導(dǎo)致人體出現(xiàn)呼吸困難、嘔吐等中毒癥狀。結(jié)果說明，接種復(fù)合發(fā)酵劑的香腸的組胺含量有降低，有利于提高食用安全性。

3 結(jié)論

因?yàn)橄隳c是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食物，在近幾年因?yàn)橄M(fèi)者對食品的安全性意識提高，所以對發(fā)酵食物的要求更高，接種香腸不僅可以提高食用安全性，還可以提高產(chǎn)品的風(fēng)味等。接種戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)5種微生物制備成的復(fù)合發(fā)酵劑的廣味香腸的pH和Aw都比自然發(fā)酵香腸低了15.53%、2.38%，pH和Aw是柵欄因子，是食品保藏的重要參數(shù)，低pH和低Aw的發(fā)酵食品不僅可以增長食品的保藏期，還可以提高食品的微生物衛(wèi)生指標(biāo)、安全性指標(biāo)、脂肪的氧化、亞硝酸鹽和組胺在廣味香腸中的含量，由此可以看出，接種復(fù)合發(fā)酵劑的廣味香腸的亞硝酸鹽含量、組胺含量和酸價比自然發(fā)酵劑香腸分別降低了6.22%、10.14%和24.5%。結(jié)果表明，接種復(fù)合發(fā)酵劑的廣味香腸的食用安全性比自然發(fā)酵香腸高。