煙熏對鱘魚肉特性及脂質(zhì)組成的影響

陳 康，張卓濰，沈 清，戴志遠(yuǎn)*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310012 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連116034 4 新昌縣鱘鰉生物科技有限公司 浙江紹興312521）

鱘魚是一種大型淡水魚，是魚類最原始的類群之一，在黑龍江、松花江等地均有分布，經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值較高[1]。我國鱘魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，魚子醬產(chǎn)量增長迅速，而鱘魚肉作為魚子醬的加工副產(chǎn)物未得到充分利用[2]。養(yǎng)殖鱘魚肉脂肪含量較高，對加工工藝要求較高。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，鱘魚肉脂肪氧化迅速是魚腥味產(chǎn)生的主要因素[3-4]。目前國內(nèi)鱘魚肉加工產(chǎn)品較少，主要為煙熏鱘魚肉[5]、鱘魚松[6]、鱘魚片[7]、鱘魚腸[8]等。

脂質(zhì)是水產(chǎn)品中重要的活性物質(zhì)，包括甘油三酯、磷脂和固醇等，并且水產(chǎn)品中ω-3 多不飽和脂肪酸含量較高[9-10]。海洋動物脂質(zhì)中，磷脂的不飽和程度較高，并富含DHA 和EPA 等多不飽和脂肪酸，具有重要的研究價(jià)值[11]。磷脂廣泛存在于生物細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞膜的重要組成部分，具有多種生理功能[12-13]。脂肪酸不飽和程度增高使得其穩(wěn)定性降低，而魚肉富含多不飽和脂肪酸，在加工過程中容易造成脂肪酸氧化，引起營養(yǎng)損失。煙熏技術(shù)是一種傳統(tǒng)的肉制品保存技術(shù)，通過高溫及熏煙引起食品脫水從而延長保存期限，并賦予食品特殊的顏色和風(fēng)味[14]。雖然煙熏工藝可以抑制鱘魚脂肪酸酸敗，但是煙熏的高溫也會加速魚肉脂肪酸氧化形成酸類和酮類物質(zhì)[15-16]。目前，煙熏鱘魚的研究主要針對菌落總數(shù)、脂肪酸氧化及風(fēng)味物質(zhì)變化，暫無針對鱘魚不同部位及魚肉脂質(zhì)體的研究。本文采用親水作用色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Hydrophilic interaction chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）技術(shù)和主成分分析（Principal component analysis，PCA）方法，系統(tǒng)研究鱘魚肉不同部位在煙熏過程中磷脂成分的變化，以期為煙熏鱘魚肉工藝優(yōu)化提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

史氏鱘鰉（史氏鱘♀×達(dá)氏鰉♂），新昌縣鱘鰉生物科技有限公司。3 種磷脂標(biāo)準(zhǔn)品：磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholines，PC）PC-14∶0/14∶0、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine，PE）PE-15∶0/15∶0 和磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）PS-14∶0/14∶0（純度均大于99.9%），美國Avanti Polar Lipids 公司；乙腈（色譜純級），德國Merck 公司；氯仿、甲醇等試劑，國藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

4000 Q-TRAP 三重四級桿質(zhì)譜儀（配有ESI離子源），美國Applied Biosystems 公司；HPLC 高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters 公司；7890B 氣相色譜儀，美國Agilent 公司；TMS-PRO 物性分析儀，美國FTC 公司；Fresco-21G 臺式離心機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；Millipore 超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚煙熏工藝 取冷凍鱘魚肉于常溫解凍并去皮去骨，流水洗凈表面黏液，切成1 cm 厚的鱘魚片，然后清洗瀝干，放入調(diào)味料中浸漬30 min。取出鱘魚肉放入煙熏爐中熱風(fēng)干燥，干燥溫度定為55℃，干燥時(shí)間設(shè)定為30 min。熏材采用蘋果木，煙熏溫度60℃，煙熏時(shí)間40 min。

1.3.2 質(zhì)構(gòu)測定方法采用TPA 方法[17]測定樣品破斷強(qiáng)度和凹陷深度，采用P/50 不銹鋼球形探頭，直徑5 mm，穿刺速度60 mm/min，每組樣品重復(fù)測量5 次。

1.3.3 脂肪酸組成測定參照Bligh 等[18]方法。取4 g 魚肉完全絞碎，加入12 mL 脂質(zhì)提取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1）均質(zhì)3 min，再超聲提取20 min，低溫離心后（10℃，8 500 r/min，15 min），取下層氮吹得粗油脂。在提取油脂中加入5 mL 0.5 mol/L KOH-甲醇溶液，于65℃水浴20 min，振搖至油滴消失并冷卻。加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，于65℃水浴5 min，超聲提取10 min 后加入2 mL 正己烷，振搖后用2 mL 飽和NaCl 淋洗上層，取上層用無水硫酸鈉脫水，過濾待測。采用峰面積歸一化法分析各脂肪酸組分的相對含量。每組樣品重復(fù)測試3 次。

氣相色譜條件[19]：HP-INNOWAX 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.15 μm）；升溫程序：初溫50℃保持2 min 后以4℃/min 升至250℃，保持15 min；進(jìn)樣口溫度250℃，分流比40∶1，進(jìn)樣量1 μL，載氣流速0.65 mL/min。

1.3.4 磷脂提取方法 采用改進(jìn)后的Bligh-Dyer法提取鱘魚肉磷脂[20]。準(zhǔn)確稱取鱘魚肉樣品1.0 g，加入12.0 mL 脂質(zhì)提取液（V氯仿∶V甲醇=2∶1），振蕩后于20℃水浴超聲提取20 min。加入6 mL 超純水，于8 000 r/min，10℃離心10 min，收集有機(jī)相。水相中加入6.0 L 氯仿重復(fù)提取2 次，合并3次提取液并氮?dú)獯蹈?。干燥后加? mL 磷脂溶解液（V氯仿∶V甲醇=1∶1）復(fù)溶，用0.2 μm 有機(jī)濾膜過濾后用于質(zhì)譜檢測。

1.3.5 液相色譜條件 色譜柱：Cosmosil HILIC色譜柱（4.6 mm×250 mm，2.5 μm）；流動相A：水相（20 mmol/L 甲酸銨，18 mmol/L 甲酸，超純水溶解）；流動相B：有機(jī)相（18 mmol/L 甲酸，乙腈溶解）。梯度洗脫程序[21]：0 min（95% B），3 min（95%B），18 min（70% B），23 min（50% B），28 min（50%B），29 min（95% B），32 min（95% B）。流量：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL。

1.3.6 質(zhì)譜條件電噴霧離子源ESI 負(fù)離子模式；離子源電壓（IS）-4 500 V；毛細(xì)管溫度500℃；氣簾氣（CUR）172.368 kPa；霧化氣（GS1）165.474 kPa；輔助氣（GS2）206.843 kPa；掃描范圍m/z 600～1 000[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Analyst Software v1.6.3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，用Lipid View 1.2 進(jìn)行磷脂分子種鑒定，用Excel 2013 和SPSS 22 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙熏過程對鱘魚肉質(zhì)構(gòu)的影響

煙熏加工工藝通過熱量傳遞及煙熏材料吸附在魚肉表面的方式，使魚肉組織失去一部分水分，從而延長魚肉制品的保質(zhì)期。從圖1可以看出，鱘魚背部組織硬度高于腹部組織，這可能是由于魚體背部脂肪含量較少，蛋白質(zhì)含量相對較高，肌肉蛋白纖維組織結(jié)構(gòu)具有更強(qiáng)的耐壓能力[23-24]。經(jīng)過煙熏工藝加工后，煙熏鱘魚腹部組織硬度高于背部組織，這可能是由于煙熏過程中，煙熏顆粒附著在魚肉組織表面，同熱力學(xué)共同作用使魚肉組織脫水[25]。煙熏過程中，鱘魚肉組織脂肪滲出，引起鱘魚肉脂肪含量下降，而鱘魚腹部具有更多的水分與脂肪，煙熏后肌肉蛋白纖維含量增高，使得鱘魚腹部具有更高的硬度。煙熏過程對鱘魚肉質(zhì)構(gòu)的影響如表1所示，煙熏后的鱘魚肉具有更高的回復(fù)性、內(nèi)聚性、彈性、膠黏性、咀嚼性，而彈性則在不同部位具有強(qiáng)度差異。

圖1 煙熏工藝對鱘魚肉硬度的影響Fig.1 The effect of smoking technology on hardness of sturgeon

表1 煙熏工藝對鱘魚肉結(jié)構(gòu)的影響Table 1 The effect of smoking technology on the structure of sturgeon

2.2 脂肪酸組成分析

本研究共檢測到鱘魚肉中脂肪酸15 種，其中飽和脂肪酸（SFA）5 種，單不飽和脂肪酸（MUFA）4種，多不飽和脂肪酸（PUFA）6 種；煙熏鱘魚肉中共檢測到脂肪酸13 種，其中飽和脂肪酸4 種，單不飽和脂肪酸4 種，多不飽和脂肪酸5 種，鱘魚煙熏過程脂肪酸組成的變化如表2所示。由表2可知，鱘魚腹部不飽和脂肪酸相對含量高于背部組織，其中腹部EPA 和DHA 相對含量也顯著高于背部。本次試驗(yàn)結(jié)果與早期研究基本一致，說明鱘魚肉不飽和脂肪酸含量高，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能[26-27]。煙熏后，鱘魚組織的多不飽和脂肪酸含量顯著下降，分別下降了5.31%（腹部）和3.75%（背部）。煙熏后鱘魚組織腹部和背部組織的不飽和脂肪酸相對含量差異不顯著，并且EPA 和DHA 相對含量相近。相關(guān)研究表明[28]，不飽和脂肪酸具有熱不穩(wěn)定性，隨著不飽和程度的提高穩(wěn)定性降低，更易被氧化。因此，鱘魚腹部組織由于脂肪酸不飽和程度高，在受熱煙熏過程中更易氧化，所以在加工鱘魚時(shí)，鱘魚背部組織可以采用熱熏處理，而腹部組織更適宜采用冷熏等溫度較低、較為溫和的加工方式。

表2 鱘魚肉及煙熏鱘魚肉脂肪酸組成分析Table 2 Analysis of fatty acid composition of smoked and raw sturgeon meat

（續(xù)表2）

2.3 鱘魚肉與煙熏鱘魚肉的脂質(zhì)組學(xué)分析

2.3.1 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品分析將3 種磷脂標(biāo)品以1∶1∶1 混合，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測試保留時(shí)間。磷脂由親水性頭部與疏水性脂肪酸尾部組成，可以通過洗脫液梯度洗脫進(jìn)行不同磷脂分子種分離，并通過提取圖譜上標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行磷脂分子種鑒定[29]。由圖2可以看出，本試驗(yàn)方法可有效分離3 類磷脂分子種。在負(fù)離子模式中，PE 和PS 因去質(zhì)子化而以[M-H]-為特征離子，PC 由于流動相中甲酸存在而以[M+CH3COO]-為特征離子。由圖2可知，PC、PE 和PS 的出峰時(shí)間分別為11.64，12.49 min 和16.58 min。

圖2 磷脂標(biāo)準(zhǔn)品HILIC-MS 圖Fig.2 HILIC-MS of phospholipid standard

2.3.2 脂質(zhì)組學(xué)分析 由鱘魚肉與煙熏鱘魚肉的HILIC-MS 圖（圖3）可知，本試驗(yàn)的液相方法可以有效地分離磷脂種，通過對比標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間，選取相近出峰位置進(jìn)行分子提取，可以得到各磷脂分子種（圖4）[30]。通過Lipid View 軟件定性分析及相對含量測定，共鑒定出鱘魚肉中PC 分子20 種、PE 分子24 種、PS 分子12 種（表3）。由表可知，鱘魚肉背部、鱘魚肉腹部、煙熏鱘魚肉背部和煙熏鱘魚肉腹部4 種鱘魚肉樣品中，含量最高的PC 分子都是C34：1，分別達(dá)到16.60%，14.93%，18.70%，20.70%；除煙熏鱘魚肉腹部樣品外（PE C36：0，18.93%），含量最高的PE 分子是C38：1，分別為14.50%，14.22%，15.60%；除煙熏鱘魚肉腹部樣品外（PS C44：9，19.02%），含量最高的PS 分子是C40：6，分別為23.32%，24.31%，17.07%，這表明鱘魚肉中PS 分子不飽和脂肪酸含量較高。當(dāng)磷脂分子不飽和度≥5 時(shí)，其中一條脂肪酸可能含有EPA 或DHA 鏈，因此本試驗(yàn)提取磷脂中不飽和度≥5 的分子種作為研究磷脂分子種高不飽和脂肪酸相對含量的參考。試驗(yàn)結(jié)果表明，鱘魚肉的磷脂組成中高不飽和脂肪酸相對含量較高。鱘魚肉煙熏前、后腹部多不飽和脂肪酸含量高于背部，這是由于魚肉背部蛋白質(zhì)含量較高，而腹部含有較高的油脂。煙熏后，鱘魚肉背部不飽和脂肪酸磷脂含量分別降低了3.40%（PC）、1.87%（PE）和15.81%（PS），其中PS（C44：9）分子含量下降顯著，達(dá)到9.11%。鱘魚肉腹部不飽和脂肪酸磷脂組成分別降低了5.01%（PC）、12.89%（PE）和10.90%（PS），其中PS（C40：6）分子含量下降12.52%。試驗(yàn)結(jié)果表明，用鱘魚肉腹部磷脂在煙熏過程中不飽和脂肪酸氧化程度更高，這與脂肪酸分析結(jié)果一致。

圖3 鱘魚肉HILIC-MS 圖Fig.3 HILIC-MS of raw sturgeon meat

圖4 鱘魚肉PC（a）、PE（b）、PS（c）質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrometry of PC（a），PE（b）and PS（c）of sturgeon meat

表3 鱘魚肉及煙熏鱘魚肉磷脂分子種組成分析Table 3 Analysis of molecular species composition of phospholipid in smoked and raw sturgeon meat

（續(xù)表3）

2.4 主成分分析

通過SIMCA 14.1.0 軟件對48 組樣品中的磷脂成分進(jìn)行主成分分析，得到第1 主成分（貢獻(xiàn)率為50.6%）和第2 主成分（貢獻(xiàn)率為16.55%），2 種組分的總貢獻(xiàn)率為67.15%，因此，PCA 方法可以有效反映不同鱘魚樣品的特征磷脂。

煙熏鱘魚樣品的PCA 評分散點(diǎn)圖如圖5所示，圖中散點(diǎn)可分為左右2 個(gè)集群，左面集群為鱘魚肉，右面集群為煙熏鱘魚肉，煙熏后鱘魚肉磷脂組成發(fā)生顯著改變。進(jìn)一步分析鱘魚肉集群發(fā)現(xiàn)鱘魚肉腹部和背部磷脂可以分為A，B 2 個(gè)集群，并且2 個(gè)集群距離較遠(yuǎn)，說明鱘魚肉腹部和背部磷脂組成具有較大差異，可以作為區(qū)分鱘魚不同部位的指標(biāo)，有待進(jìn)一步研究[31]。煙熏鱘魚肉集群可分為a，b 2 個(gè)集群，2 個(gè)集群距離較近，說明經(jīng)過煙熏后鱘魚肉中磷脂組成差異性減少。同時(shí)煙熏后鱘魚肉的磷脂樣品離散程度增加，說明煙熏對鱘魚肉磷脂影響具有一定的隨機(jī)性，不同的磷脂在煙熏的過程中變化程度也不同。

圖5 鱘魚和煙熏鱘魚樣品主成分分析散點(diǎn)圖Fig.5 Principal component analysis of smoked and raw sturgeon samples

3 結(jié)論

通過分析煙熏鱘魚肉質(zhì)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過煙熏工藝后鱘魚腹部組織比背部組織具有較高的質(zhì)構(gòu)差異，其中硬度和彈性差異顯著。在煙熏過程中，鱘魚肉多不飽和脂肪酸會發(fā)生氧化損失，其中腹部組織下降較多，達(dá)5.31%。采用脂質(zhì)組學(xué)分析方法對煙熏鱘魚肉進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)煙熏工藝會引起磷脂脂肪酸鏈不飽和程度下降，其中對PS 分子不飽和度影響最顯著。通過主成分分析，發(fā)現(xiàn)磷脂可以作為區(qū)分鱘魚肉腹部和背部的定性指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，煙熏工藝會顯著影響鱘魚肉磷脂組成并使腹部與背部磷脂組成差異性減少。同時(shí)，煙熏對鱘魚肉的影響具有一定的隨機(jī)性。本研究發(fā)現(xiàn)熱熏工藝會引起鱘魚肉脂肪酸氧化，不飽和脂肪酸含量顯著下降，不適于加工脂肪酸含量較高的腹部組織，可考慮采用液熏等冷熏工藝替代。本研究為優(yōu)化不同部位煙熏鱘魚肉產(chǎn)品的加工工藝提供數(shù)據(jù)參考及理論依據(jù)。