丁酸梭菌厭氧發(fā)酵機(jī)制及高密度厭氧發(fā)酵方式研究進(jìn)展

吳天福 謝小林 陳美標(biāo) 周 蓮 陳 猛 鄧名榮 姚 青 朱紅惠

(1. 廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070；2. 廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；3. 廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；4. 省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；5. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東 廣州 510642)

丁酸梭菌又名酪酸菌、丁酸梭狀芽孢桿菌、宮入菌[1]，屬于硬壁菌門(mén)梭菌科梭菌屬。它是從健康人、動(dòng)物腸道、酒窖泥或環(huán)境土壤中分離出的革蘭氏陽(yáng)性嚴(yán)格厭氧梭菌[2]，具有耐胃酸、耐膽汁等特性，能夠經(jīng)過(guò)胃和小腸，到達(dá)完全厭氧的盲腸和結(jié)腸中進(jìn)行定植、繁殖和代謝。丁酸梭菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種酶將腸道中多糖物質(zhì)分解為低聚糖[3]，并產(chǎn)生丁酸梭菌素(抗菌肽)、丁酸、乙酸及維生素等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌生長(zhǎng)，抑制有害菌繁殖，糾正腸道菌群紊亂。此外，還能修復(fù)腸道黏膜，增強(qiáng)腸道屏障功能的作用[4]，從而提高飼料利用率，維護(hù)動(dòng)物腸道健康，提高生產(chǎn)性能。因此，在亞洲特別是日本、韓國(guó)和中國(guó)丁酸梭菌被廣泛用作益生菌劑，作為醫(yī)藥中的整腸劑及畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖中的飼料添加劑[5]。丁酸梭菌作為新一代的芽孢益生菌劑，對(duì)于減少抗生素的濫用、減少肉制品中藥物殘留、降低動(dòng)物細(xì)菌的耐藥性和保障動(dòng)物健康方面有著重要的意義。

目前，中國(guó)對(duì)丁酸梭菌的研究仍然處于起步階段，市面上銷(xiāo)售的丁酸梭菌益生菌劑因有效活菌數(shù)低，普遍發(fā)酵水平在108～109數(shù)量級(jí)上，個(gè)別企業(yè)經(jīng)發(fā)酵噴霧干燥后有效活菌數(shù)能達(dá)到1×1010CFU/g，但一般產(chǎn)量小且價(jià)格昂貴，難以滿足食品、動(dòng)物養(yǎng)殖及飼料行業(yè)對(duì)丁酸梭菌高需求量、高有效活菌數(shù)且價(jià)格低廉的要求[3]。造成這種現(xiàn)狀最主要的問(wèn)題在于丁酸梭菌高密度發(fā)酵技術(shù)不成熟，厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器智能化程度低，工業(yè)化、規(guī)?；l(fā)酵技術(shù)不完善，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約了丁酸梭菌的廣泛推廣及應(yīng)用。此外，發(fā)酵初始pH值、溫度、底物種類(lèi)[6]及無(wú)機(jī)鹽離子[7]等發(fā)酵工藝的優(yōu)化及發(fā)酵過(guò)程代謝調(diào)控優(yōu)化等因素對(duì)丁酸梭菌高密度發(fā)酵也有很大的影響。因此，丁酸梭菌規(guī)?；a(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)研究和用于厭氧發(fā)酵的生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)等問(wèn)題亟待解決和突破。文章從丁酸梭菌的厭氧發(fā)酵機(jī)制、發(fā)酵方式及厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器的應(yīng)用狀況等幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，以期能在丁酸梭菌實(shí)際生產(chǎn)及應(yīng)用等方面提供解決思路和策略，實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌的高密度厭氧發(fā)酵，大幅度提高有效活菌數(shù)及降低工業(yè)生產(chǎn)成本。

1 丁酸梭菌厭氧發(fā)酵機(jī)制

丁酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧菌，其碳代謝途徑中關(guān)鍵酶丙酮酸—鐵氧還蛋白氧化還原酶，屬于金屬蛋白酶類(lèi)，含有鐵硫簇和硫胺素焦磷酸，能催化丙酮酸分解為乙酰-COA和CO2，進(jìn)一步被氧化為丁酸等代謝產(chǎn)物(圖1)。該蛋白酶在純氧中1 h內(nèi)活性降低約50%，而在氮?dú)庵?4 h仍有較高活性[8]，可見(jiàn)氧含量對(duì)丁酸梭菌高密度發(fā)酵是關(guān)鍵因素和關(guān)鍵控制點(diǎn)。因此，對(duì)丁酸梭菌厭氧發(fā)酵機(jī)制的深入了解有助于丁酸梭菌發(fā)酵方法、發(fā)酵工藝及發(fā)酵設(shè)備等方面的改進(jìn)，從而實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌的高密度發(fā)酵，促進(jìn)丁酸梭菌的廣泛應(yīng)用。

丁酸梭菌厭氧發(fā)酵是一個(gè)生化轉(zhuǎn)化的過(guò)程，反應(yīng)過(guò)程大致可分為水解、酸化、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸3個(gè)階段[9]。第1階段是水解階段，丁酸梭菌將復(fù)雜的有機(jī)底物(如多糖、蛋白質(zhì)、脂肪等)在胞外酶(淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶、纖維素酶、磷脂合成酶等)作用下分解成小分子有機(jī)物，如可溶性單糖、氨基酸、脂肪酸和甘油等小分子有機(jī)化合物，這些小分子有機(jī)物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被進(jìn)一步利用；第2階段是酸化階段，小分子有機(jī)物進(jìn)入細(xì)胞胞漿內(nèi)，在相關(guān)酶系作用下轉(zhuǎn)化為乙酸、丁酸、丙酸等揮發(fā)性脂肪酸和乙醇、丙二醇等醇類(lèi)；第3階段是產(chǎn)氫、產(chǎn)乙酸階段，在相關(guān)酶作用下脂肪酸、醇類(lèi)等物質(zhì)被氧化分解為氫氣、二氧化碳等氣體。丁酸梭菌代謝途徑中，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)與CO2在PEP羧化酶催化下形成草酰乙酸(OAA)，進(jìn)入TCA循環(huán)的氧化支路和還原支路[10-11]。由于丁酸梭菌缺少琥珀酸硫激酶和琥珀酸脫氫酶，無(wú)法合成琥珀酸及延胡索酸造成TCA循環(huán)中斷，形成不完全TCA循環(huán)[10](圖1)。此外，丁酸梭菌還存在以NADH為輔酶的蘋(píng)果酸支路，催化蘋(píng)果酸和乙酰-COA轉(zhuǎn)化為丙酮酸[12]。在整個(gè)代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量有機(jī)酸產(chǎn)生，降低發(fā)酵液pH值，不利于丁酸梭菌的增殖生長(zhǎng)。

在微生物發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源比例過(guò)高時(shí)，有機(jī)物則通過(guò)糖酵解途徑生成大量丙酮酸，一部分進(jìn)入三羧酸循環(huán)用于微生物自身生長(zhǎng)，另一部分則進(jìn)入其他代謝途徑生成乙酸、乳酸和乙偶姻等代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)碳溢流代謝(carbon overflow metabolism，COM)現(xiàn)象[15]6。丁酸梭菌在發(fā)酵過(guò)程中也存在碳溢流代謝現(xiàn)象，COM產(chǎn)生的丁酸、乙酸等有機(jī)酸大量積累導(dǎo)致發(fā)酵液pH下降，細(xì)胞質(zhì)酸化，質(zhì)子動(dòng)勢(shì)解偶聯(lián)等一系列生理毒害結(jié)果，出現(xiàn)“酸肋迫效應(yīng)”[16]。細(xì)胞為了維持胞內(nèi)pH穩(wěn)定將通過(guò)消耗額外能量將質(zhì)子泵入胞內(nèi)，這一耗能過(guò)程會(huì)直接影響菌體的正常增殖生長(zhǎng)[17]。因此，在丁酸梭菌培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵過(guò)程中要控制適宜C/N減少碳溢流代謝，或添加適當(dāng)輕質(zhì)碳酸鈣、氯化鈣、碳酸鈉等弱堿鹽或流加氨水、低濃度氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液氧化還原電位(oxidation-reduction potential，ORP)。此外，還可以通過(guò)補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，減少或消除溢流代謝產(chǎn)物，維持菌體持續(xù)生長(zhǎng)從而提高菌體生物量或某種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[18]。Goel等[19]研究表明，在枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中，檸檬酸鹽和葡萄糖共代謝，可有效抑制丙酮酸激酶，減少丙酮酸的生成從而抑制EMP碳通量，減少或消除碳溢流代謝。

此外添加檸檬酸鹽還能顯著提高PEP含量，增強(qiáng)TCA循環(huán)和HMP途徑，可促進(jìn)細(xì)胞快速增殖生長(zhǎng)。夏會(huì)麗等[20]研究表明，添加乙醛可使NADH的氧化由丁酸合成途徑部分向乙醇合成支路遷移，增強(qiáng)乙醇合成效率，降低丁酸、乙酸的積累，提高丁酸梭菌的生長(zhǎng)效率。實(shí)現(xiàn)了高生物量和低產(chǎn)酸的相對(duì)統(tǒng)一。黃志華等[21]研究表明，不同微生物都有其最適的ORP。ORP值越高說(shuō)明溶液的氧化水平越高越容易失去電子，反之亦然[22]。一般而言，好氧菌適宜的ORP范圍在0.3～0.4 V，兼性厭氧菌在0.1 V左右，厭氧菌在0.1 V以下[23]。微生物調(diào)節(jié)胞內(nèi)ORP的物質(zhì)主要是輔酶Ⅰ(NADH/NAD+)和輔酶Ⅱ(NADPH/NADP+)，但胞外發(fā)酵環(huán)境中的溫度、pH值及氧化還原物質(zhì)濃度等都會(huì)對(duì)ORP產(chǎn)生一定影響。因此，在厭氧菌發(fā)酵過(guò)程中，可通過(guò)添加適量還原性物質(zhì)以調(diào)控胞外氧化還原電勢(shì)，改變胞內(nèi)輔酶Ⅰ與輔酶Ⅱ比例，使細(xì)胞代謝流發(fā)生變化，從而提高生物量或次級(jí)代謝產(chǎn)物[15]10。喻揚(yáng)等[22]研究了在厭氧條件下將ORP值控制在-150 mV時(shí)對(duì)酵母發(fā)酵乙醇過(guò)程最為有利，說(shuō)明可以利用氧化還原電極來(lái)精確控制厭氧發(fā)酵條件，為細(xì)胞合理分配代謝流以實(shí)現(xiàn)生物量或次級(jí)代謝產(chǎn)物的增加提供一種有效的監(jiān)控手段。此外，通過(guò)在發(fā)酵液中添加適量還原劑，如巰基乙酸(0.1%～0.2%)、抗壞血酸(0.1%)、硫化鈉(0.025%)、L-半胱氨酸鹽酸鹽(0.05%)、還原性金屬除氧劑及通入惰性氣體(如氮?dú)?或加熱煮沸培養(yǎng)基等方法都可以實(shí)現(xiàn)降低培養(yǎng)基的ORP，創(chuàng)造利于丁酸梭菌大量繁殖生長(zhǎng)的厭氧環(huán)境。邢宏觀等[7]選擇FeSO4作為除氧劑以降低培養(yǎng)基的氧化還原電位，當(dāng)FeSO4添加量為1.2%時(shí)效果最佳，菌體數(shù)達(dá)到4.55×108CFU/mL，與對(duì)照組相比有顯著提高，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Mg2+添加量為2 mmol/L 時(shí)對(duì)丁酸梭菌的生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，Zn2+、Ca2+、Mn2+等金屬離子則對(duì)其生長(zhǎng)有抑制作用，Cu2+完全抑制其生長(zhǎng)，可能Zn2+、Mn2+、Fe2+等金屬離子是代謝通路中某些關(guān)鍵酶的輔因子，對(duì)酶活性起著重要調(diào)節(jié)作用。丁酸梭菌利用葡萄糖發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生“Crabtree效應(yīng)”，能誘導(dǎo)菌體過(guò)早形成芽孢，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期縮短，大大降低發(fā)酵密度。Dubnau等[24]研究發(fā)現(xiàn)，3種蛋白復(fù)合體YlbF、YmcA和YaaT可加速SpoOA蛋白磷酸化形成二聚體，增強(qiáng)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域“OA-box”親和力，促進(jìn)孢子及生物膜的形成。研究[25]表明，細(xì)胞中GTP水平與全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CodY表達(dá)有關(guān)。發(fā)酵過(guò)程中添加適量檸檬酸鈉可使CodY處于激活狀態(tài)，增加細(xì)胞中GTP水平，抑制芽孢過(guò)早形成，延長(zhǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)周期。Hakalehto等[26]發(fā)現(xiàn)，CO2是梭狀芽孢桿菌生長(zhǎng)的一個(gè)必要信號(hào)，酸性條件下難以將CO2留在培養(yǎng)基中，當(dāng)外部環(huán)境中缺少CO2時(shí)將導(dǎo)致丁酸梭菌生長(zhǎng)延遲或生長(zhǎng)難以啟動(dòng)，可通過(guò)將丁酸梭菌與短乳桿菌混合發(fā)酵培養(yǎng)，短乳桿菌產(chǎn)生的CO2能促進(jìn)丁酸梭菌生長(zhǎng)的啟動(dòng)。

1. 甘油脫水酶 2. 1，3-丙二醇脫氫酶 3. 甘油脫氫酶(dhaD) 4. 二羥丙酮激酶(dhaK) 5. 磷酸己糖異構(gòu)酶 6. 磷酸甘油異構(gòu)酶 7. 烯醇化酶 8. 丙酮酸激酶 9. 丙酮酸鐵氧還蛋白氧化還原酶 10. 硫解酶 11. 三羥丁酰COA脫氫酶 12. 丁酰磷酸轉(zhuǎn)移酶 13. 丁酸激酶 14. 丁醛脫氫酶 15. 丁醇脫氫酶 16. 磷酸轉(zhuǎn)乙酸酶 17. 乙酸激酶 18. 乙醛還原酶 19. 乳酸脫氫酶 20. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 21. 檸檬酸合酶 22. 順烏頭酸梅 23. 檸檬酸脫氫酶 24. 蘋(píng)果酸脫氫酶 25. 延胡索酸酶 26. 延胡索酸酶還原酶 27. 氫化酶 28. 鐵氧還原蛋白-NAD(P)+還原酶 29. NAD(P)H-鐵氧還蛋白還原酶圖1 丁酸梭菌屬細(xì)菌的主要代謝途徑[13-14]Figure 1 Main metabolic pathways of Clostridium butyrate

2 丁酸梭菌高密度厭氧發(fā)酵方式

厭氧發(fā)酵(anaerobic fermentation)指厭氧環(huán)境下，通過(guò)微生物的代謝活動(dòng)降解有機(jī)質(zhì)，同時(shí)伴有CH4和CO2產(chǎn)生的過(guò)程。丁酸梭菌厭氧發(fā)酵一般可分為3種發(fā)酵方式：厭氧液態(tài)發(fā)酵(anaerobic liquid-state fermentation，ALF)、厭氧固態(tài)發(fā)酵(anaerobic solid-state fermentation，ASF)和厭氧混菌發(fā)酵(anaerobic co-culture fermentation，ACF)。

2.1 厭氧液態(tài)發(fā)酵

厭氧液態(tài)發(fā)酵(ALF)是指在生化反應(yīng)器中，將細(xì)菌在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所必須的有機(jī)物、無(wú)機(jī)鹽等一些微量元素溶解在水中作為培養(yǎng)基，在厭氧環(huán)境下將液體中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸、二氧化碳等產(chǎn)物。液態(tài)發(fā)酵法可通過(guò)補(bǔ)料流加發(fā)酵培養(yǎng)基，既能提高整個(gè)培養(yǎng)體系pH值避免“酸脅迫效應(yīng)”還可以補(bǔ)充新鮮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持菌體的持續(xù)生長(zhǎng)[27]，從而提高細(xì)胞生物量。液態(tài)發(fā)酵法還能在菌體發(fā)酵至穩(wěn)定期時(shí)流加20%的碳酸鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液至pH 6.5以中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的有機(jī)酸，解除酸脅迫抑制，創(chuàng)造菌體適宜生長(zhǎng)的環(huán)境[28]。邢宏觀等[7]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1%的輕質(zhì)CaCO3，發(fā)酵后菌體數(shù)達(dá)到8.45×108CFU/mL。夏會(huì)麗等[20]研究發(fā)現(xiàn)，采用葡萄糖和乙醛共補(bǔ)料發(fā)酵策略，可以使NADH氧化合成途徑向支路遷移，降低有機(jī)酸的積累，使丁酸梭菌活菌數(shù)達(dá)到1.14×109CFU/mL。袁華偉等[29]也報(bào)道了用清液發(fā)酵丁酸梭菌，培養(yǎng)48 h后有效活菌數(shù)達(dá)到1.64×108CFU/mL；梁運(yùn)祥等[30]采用清液發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，向培養(yǎng)基中分段式流加碳源和金屬鹽，發(fā)酵后丁酸梭菌生物量達(dá)到2.30×109CFU/mL。液態(tài)厭氧發(fā)酵最大優(yōu)點(diǎn)就是可以進(jìn)行清液發(fā)酵，對(duì)菌體的分離收集非常有利[31]，可以將菌體制成不同劑型藥物，適合于醫(yī)藥衛(wèi)生行業(yè)，但應(yīng)用于工業(yè)上生產(chǎn)飼料添加劑設(shè)備投入大，產(chǎn)出效率低，造成成本較高，不利于市場(chǎng)上的推廣與應(yīng)用。

2.2 厭氧固態(tài)發(fā)酵

厭氧固態(tài)發(fā)酵(ASF)是指發(fā)酵體系在近乎無(wú)自由水存在的狀態(tài)下，厭氧微生物利用固體有機(jī)廢棄物為原料發(fā)酵產(chǎn)生小分子有機(jī)物和CH4、H2、CO2等氣體的過(guò)程。反應(yīng)體系中總固體含量一般為20%～50%[32]，最高可達(dá)70%。

目前，雖然液態(tài)深層發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)比較成熟，但發(fā)酵丁酸梭菌所得菌體濃度仍普遍不高，大多數(shù)報(bào)道中所得發(fā)酵菌數(shù)一般在107～109CFU/mL，某些發(fā)酵活菌數(shù)較高的報(bào)道基本處于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模試驗(yàn)階段，而且所使用的培養(yǎng)基成分主要是牛肉膏、蛋白胨、酵母粉等營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，成本較高。此外，液體發(fā)酵還由于設(shè)備投入大、技術(shù)要求高等因素，無(wú)形中增加了工業(yè)化生產(chǎn)成本，從而使丁酸梭菌益生菌劑在飼料添加劑市場(chǎng)上的應(yīng)用受到很大制約。固態(tài)發(fā)酵除具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便等優(yōu)勢(shì)外[33]，還具有培養(yǎng)基原料來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，發(fā)酵后既能改善飼料風(fēng)味、降低飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子可直接飼養(yǎng)動(dòng)物[34]，減少?gòu)U水排放等造成的環(huán)境污染問(wèn)題。此外，丁酸梭菌作為畜禽腸道中土著菌群，其生存的環(huán)境為固態(tài)或半固態(tài)，所以采用丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵方法也許更適合其生長(zhǎng)繁殖。王雪奇等[35]以添加碳酸鈣的大豆渣作為固態(tài)基質(zhì)，用檸檬酸鈉—磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)配制培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后兩歧雙歧桿菌活菌數(shù)可達(dá)1.60×109CFU/g；謝全喜等[36]用復(fù)合固態(tài)培養(yǎng)基豆粕∶麩皮=1∶1進(jìn)行丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵，37 ℃培養(yǎng)72 h后活菌數(shù)可達(dá)2.20×108CFU/g；王海寬等[37]利用豆粕和米糠等作為復(fù)合固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)40～55 h后，丁酸梭菌有效活菌數(shù)達(dá)到4.35×109CFU/g。

2.3 厭氧混菌發(fā)酵

厭氧混菌發(fā)酵(ACF)又叫共培養(yǎng)厭氧發(fā)酵，在培養(yǎng)基質(zhì)中接入兩種或兩種以上不同菌種共同培養(yǎng)發(fā)酵。丁酸梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，單菌發(fā)酵增加其對(duì)厭氧設(shè)備的需求且發(fā)酵初期啟動(dòng)困難，雖然可以通過(guò)加大接種量使丁酸梭菌快速增殖以創(chuàng)造厭氧環(huán)境，但又會(huì)造成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基含水量高、易染菌、后期干燥困難等問(wèn)題。

很多研究表明，固態(tài)混菌發(fā)酵中，好氧菌或兼性厭氧菌的快速增殖可將共培養(yǎng)體系中的氧氣耗盡創(chuàng)造無(wú)氧環(huán)境，同時(shí)菌株間的相互協(xié)同作用能提高對(duì)底物的分解能力和利用率[38]，將大分子蛋白質(zhì)降解為小肽，降低粗纖維含量[39]，促進(jìn)丁酸梭菌快速生長(zhǎng)增殖。此外，不同菌株共同發(fā)酵還可以節(jié)約資源和時(shí)間，降低發(fā)酵成本[1]，且發(fā)酵后固體培養(yǎng)基中次級(jí)代謝產(chǎn)物更加豐富、微生態(tài)體系更穩(wěn)定，適應(yīng)性增強(qiáng)。王松麗等[40]利用CBS培養(yǎng)基對(duì)丁酸梭菌與鼠李糖乳桿菌進(jìn)行了混合培養(yǎng)，結(jié)果顯示兩種菌按1∶1比例接種后于37 ℃條件下厭氧罐中共培養(yǎng)48 h后活菌數(shù)分別是6.30×108，4.35×109CFU/mL，較純培養(yǎng)生物量分別增加了80.0%，51.7%，顯示混菌發(fā)酵中兩種菌株相互促進(jìn)生長(zhǎng)。王海寬等[41]以35%～45%的酶解豆粕∶米糠=5∶1為固料，按其重量的10%接種丁酸梭菌和按其重量的2%接種凝結(jié)芽孢桿菌，在非厭氧條件下37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后測(cè)得丁酸梭菌活菌數(shù)為2.70×108CFU/mL；在厭氧培養(yǎng)箱中用氮?dú)庵圃鞜o(wú)氧環(huán)境，靜置培養(yǎng)40～55 h，最終活菌數(shù)高達(dá)4.35×109CFU/g。朱曉慧等[42]研究表明，在雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和糞鏈球菌中加入其體積1/3的丁酸梭菌發(fā)酵提取液室溫培養(yǎng)24 h后，3種菌有效活菌數(shù)分別增加了24%，43%，7%。張善亭等[43]利用優(yōu)化的復(fù)合固態(tài)培養(yǎng)基麩皮23.23%、玉米粉10%、米糠6.65%為基質(zhì)，乳酸菌與丁酸梭菌1∶1比例混合接種后，37 ℃發(fā)酵48 h的活菌數(shù)分別大于5.0×108，2.0×109CFU/g。

3種發(fā)酵方式優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

3 厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器

生物反應(yīng)器的作用是為微生物的正常生長(zhǎng)繁殖與代謝提供一個(gè)適宜的環(huán)境，是微生物發(fā)酵工藝中一個(gè)重要因素和核心技術(shù)。由于厭氧微生物生理特殊性，厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器智能化程度的高低也是限制其高密度發(fā)酵的關(guān)鍵因素之一。因此，研究厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器對(duì)高密度厭氧發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展具有重要意義[44]。目前，厭氧發(fā)酵生物反應(yīng)器主要有兩大類(lèi)[45]：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模(小試裝置)和工業(yè)化規(guī)模(中試裝置)。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器類(lèi)型精小多樣，設(shè)計(jì)較復(fù)雜，多用于實(shí)驗(yàn)室厭氧菌的小規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)；工業(yè)化規(guī)模則更偏重于工業(yè)化生產(chǎn)方向，反應(yīng)器設(shè)計(jì)上簡(jiǎn)便實(shí)用、智能化程度高，有較完備的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，能實(shí)時(shí)觀察和調(diào)節(jié)微生物的生長(zhǎng)，但反應(yīng)器類(lèi)型基本相同，結(jié)構(gòu)上沒(méi)有太多變化。

表1 丁酸梭菌厭氧發(fā)酵方式的比較Table 1 Comparison of the anaerobic fermentation method of clostridium butyricum

3.1 管式反應(yīng)器

管式反應(yīng)器是最原始、簡(jiǎn)單的厭氧培養(yǎng)方法，適用于實(shí)驗(yàn)室里丁酸梭菌的小規(guī)模厭氧培養(yǎng)。管式反應(yīng)器有高層瓊脂柱法、Hungate滾管法等類(lèi)型。高層瓊脂柱法，即將加有還原劑的固體或半固體培養(yǎng)基裝入試管里培養(yǎng)厭氧菌。這種培養(yǎng)方法的特點(diǎn)是瓊脂柱越深，其氧化還原電勢(shì)越低，越有利于厭氧菌的生長(zhǎng)。Hungate滾管法(hungate roll-tube technique)是利用除氧銅柱來(lái)制備高純氮，用高純氮驅(qū)除小環(huán)境中空氣，從而制造出高度無(wú)氧環(huán)境，保證嚴(yán)格厭氧菌的正常生長(zhǎng)，滾管法的優(yōu)點(diǎn)在于試管口與空氣接觸面積小，滾動(dòng)后試管內(nèi)可培養(yǎng)表面積增大，可用于單菌落的計(jì)數(shù)觀察。Raimbault等[46]發(fā)明使用小圓管作為厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，該反應(yīng)器利用恒溫水浴鍋控溫，但在發(fā)酵過(guò)程中不能在同一體系中連續(xù)取樣，每取一次樣品就浪費(fèi)一支小圓管。Durand等[47]發(fā)明了管式可測(cè)反應(yīng)器，該反應(yīng)器與Raimbault的小圓管反應(yīng)器相比，提高了反應(yīng)器溫度的穩(wěn)定性和含水量測(cè)定的準(zhǔn)確性。

3.2 轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器

轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器是一個(gè)多相反應(yīng)系統(tǒng)，其基本構(gòu)成由圓柱形反應(yīng)容器、轉(zhuǎn)動(dòng)軸系統(tǒng)、攪拌擋板等部分組成。轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器的特點(diǎn)適合于丁酸梭菌固態(tài)發(fā)酵，可在發(fā)酵過(guò)程中通入二氧化碳和氮?dú)獾然旌蠚怏w降低發(fā)酵過(guò)程的氧化還原電位，溫度控制系統(tǒng)較完善。轉(zhuǎn)鼓式反應(yīng)器在固態(tài)基質(zhì)傳熱、傳質(zhì)方面有較明顯的改善，但在發(fā)酵過(guò)程中反應(yīng)器軸向基質(zhì)的溫度梯度仍然很大，特別是丁酸梭菌發(fā)酵后期培養(yǎng)基質(zhì)黏度增大，在反應(yīng)器的轉(zhuǎn)動(dòng)過(guò)程存在物料結(jié)塊和粘壁現(xiàn)象，造成傳質(zhì)不均，易受污染，可通過(guò)增加破碎板(網(wǎng))改善結(jié)塊問(wèn)題，但仍有少許結(jié)塊存在。此外，反應(yīng)器容積率低，在工業(yè)化放大生產(chǎn)過(guò)程中也存在一些困難。

3.3 滾筒式反應(yīng)器

滾筒式生物反應(yīng)器可以加快熱傳遞，消除溫度梯度，促進(jìn)微生物正常生長(zhǎng)繁殖，該反應(yīng)器易于實(shí)現(xiàn)機(jī)械化操作和擴(kuò)大規(guī)?；a(chǎn)[48]。轉(zhuǎn)筒式生物反應(yīng)器有密閉轉(zhuǎn)筒和多孔轉(zhuǎn)桶，與密閉轉(zhuǎn)筒相比，多空轉(zhuǎn)筒可將發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的廢水及時(shí)排出，便于氣體流通且散熱效率提高。但此類(lèi)生物反應(yīng)器的缺點(diǎn)在于攪拌效率低，物料混合不均勻，對(duì)于黏度較大的培養(yǎng)基質(zhì)攪拌過(guò)程易成團(tuán)，不利于微生物的生長(zhǎng)和發(fā)酵，且隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大換熱系統(tǒng)會(huì)出現(xiàn)很多問(wèn)題[49]，因此，應(yīng)用于丁酸梭菌發(fā)酵時(shí)應(yīng)選擇不易發(fā)黏的培養(yǎng)基原料或增加破碎裝置減少物料成團(tuán)現(xiàn)象。Wang等[50]利用5 t轉(zhuǎn)筒式厭氧發(fā)酵反應(yīng)器以甜高粱為基質(zhì)生產(chǎn)乙醇，該模型可以指導(dǎo)更大規(guī)模的轉(zhuǎn)筒式固態(tài)發(fā)酵罐研制和生產(chǎn)。Li等[51]報(bào)道了一種16 t連續(xù)轉(zhuǎn)筒固態(tài)發(fā)酵反應(yīng)器，其最大的特點(diǎn)在于可連續(xù)生產(chǎn)。

3.4 攪拌槳式反應(yīng)器

攪拌槳式反應(yīng)器是工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用最多也是智能化程度較高的一種生物反應(yīng)器，既可用于丁酸梭菌的液態(tài)發(fā)酵、固態(tài)發(fā)酵也適用于混菌發(fā)酵，廣泛應(yīng)用于各個(gè)發(fā)酵領(lǐng)域。

攪拌槳式反應(yīng)器整體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)較為簡(jiǎn)單，但不同攪拌槳形狀及槳葉間的不同組合在反應(yīng)器內(nèi)會(huì)產(chǎn)生不同的流體特征，直接影響到物料混合均勻程度、湍流能量耗散強(qiáng)度及溶氧濃度，流體混合不均一將造成物料的傳熱傳質(zhì)過(guò)程分布不均一、發(fā)酵效率低[52]。因此，研究攪拌式反應(yīng)器流體均一性混合是其設(shè)計(jì)及反應(yīng)器放大的關(guān)鍵因素[53]。嚴(yán)玉平等[54]設(shè)計(jì)一種水平推流臥式厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，該反應(yīng)器采用低轉(zhuǎn)速螺旋式攪拌，可實(shí)現(xiàn)物料的高濃度混合厭氧發(fā)酵，物料轉(zhuǎn)化率，達(dá)到50%～65%。Nagel等[55]研發(fā)出一種水平漿式攪拌反應(yīng)器，該反應(yīng)器極大提高了物料混合效率，改善了溫度和濕度的同步控制，利用反應(yīng)器壁熱傳遞，但隨著攪拌速率的增加，機(jī)械攪拌產(chǎn)生大量熱量且易造成細(xì)胞損傷。

3.5 壓力脈動(dòng)發(fā)酵反應(yīng)器

壓力脈動(dòng)發(fā)酵反應(yīng)器主要是由空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)和發(fā)酵反應(yīng)器兩部分組成，其主要是利用無(wú)菌空氣或無(wú)菌氮?dú)鈱?duì)密閉低壓反應(yīng)器內(nèi)氣相壓力施加周期性脈動(dòng)，使發(fā)酵培養(yǎng)基間隙內(nèi)的氣相傳質(zhì)由分子擴(kuò)散變?yōu)閺?qiáng)對(duì)流擴(kuò)散，泄壓后又因物料顆粒間氣相瞬間減小而膨脹，起到對(duì)固體顆粒松動(dòng)作用[56]。壓力脈動(dòng)反應(yīng)器可適用于丁酸梭菌的厭氧固態(tài)發(fā)酵。

壓力脈動(dòng)對(duì)于固態(tài)基質(zhì)是靜態(tài)，但對(duì)于氣相而言是雙重動(dòng)態(tài)，即壓力脈動(dòng)和反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)氣流運(yùn)動(dòng)[57]。利用壓力脈動(dòng)產(chǎn)生的周期性氣體環(huán)流來(lái)翻動(dòng)固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)，可避免因機(jī)械翻動(dòng)裝置密閉性不好等原因造成培養(yǎng)基污染，減少因攪拌作用使培養(yǎng)基質(zhì)結(jié)塊，加快培養(yǎng)基間傳熱、傳質(zhì)，還能周期性的刺激菌體生長(zhǎng)[57]，提高生產(chǎn)效率。目前，壓力脈動(dòng)發(fā)酵反應(yīng)器已實(shí)現(xiàn)50，70 t等不同規(guī)模的工業(yè)化放大生產(chǎn)。

4 展望

丁酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧菌，其代謝通路中的丙酮酸—鐵氧還蛋白氧化還原酶對(duì)氧分子極為敏感，如何減少培養(yǎng)體系中氧氣含量，降低氧化還原電勢(shì)成為丁酸梭菌高密度發(fā)酵的重要因素。傳統(tǒng)清除發(fā)酵體系中氧氣的方法主要包括煮沸法、隔絕空氣法(覆蓋液體石蠟)、添加還原劑、通入氮?dú)獾确椒?，這些方法都具有一定的局限性，在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中操作復(fù)雜、僅適用于實(shí)驗(yàn)室條件下的小規(guī)模發(fā)酵。丁酸梭菌3種厭氧發(fā)酵方式中，液態(tài)發(fā)酵更符合現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵趨勢(shì)，其優(yōu)點(diǎn)易于調(diào)控及工業(yè)化放大生產(chǎn)，通過(guò)對(duì)發(fā)酵工藝的優(yōu)化及發(fā)酵設(shè)備的改進(jìn)有望實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵；固態(tài)發(fā)酵方式更符合丁酸梭菌生長(zhǎng)繁殖原生環(huán)境，配合混菌固態(tài)發(fā)酵技術(shù)可實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌菌體的高密度增殖，但由于丁酸梭菌屬于嚴(yán)格厭氧菌，產(chǎn)品只適合在小范圍內(nèi)銷(xiāo)售，相信隨著厭氧包裝與貯藏技術(shù)的發(fā)展及包裝成本的降低其銷(xiāo)售區(qū)域?qū)⒏鼜V。通過(guò)對(duì)丁酸梭菌高密度發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)的研究，包括厭氧發(fā)酵方法、高密度發(fā)酵工藝及生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與改造等方面的研究將有助于實(shí)現(xiàn)丁酸梭菌高密度發(fā)酵的產(chǎn)業(yè)化，推動(dòng)飼用丁酸梭菌在市場(chǎng)中的廣泛應(yīng)用及無(wú)抗化養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展。